Waters ACQUITY UPLC基础知识.pdf

2006ACQUITY UPLCTM基础知识Waters 中国有限公司培训中心中国有限公司培训中心2006 Waters Corporation液相色谱技术的发展液相色谱技术的发展1959195919591959GPC Dow的色谱柱及Waters的仪器1967196719671967Waters开发出第一台HPLC1968196819681968FAB MS60606060年代年代年代年代70707070年代年代年代年代1972197219721972M6000 HPLC Pump1973197319731973BondapakC181978197819781978Sep-Paks1979197919791979WISP80808080年代年代年代年代1980198019801980-84848484主要进展是从积分仪到计算机-Maxima1981198119811981SFC SFC 出现出现1983198319831983-85858585API&MS/MS1985198519851985-87878787实验室网络技术的进展90909090年代年代年代年代1990199019901990-92929292ESI&PB1990199019901990-91919191CE CE 出现出现1993199319931993-95959595第一台基于关系型数据库的色谱软件出现 Millennium 1993199319931993-94949494：APcI1995199519951995：HP 1100 1996199619961996：Alliance 1996199619961996：Q-Tof 1999199919991999：XTerra2000200020002000年以后年以后年以后年以后2000200020002000ZQ质谱检测器自动纯化系统2002200220022002Atlantis色谱柱Empower色谱软件CapLC毛细管规模液相色谱2003200320032003Quattro PremierLCT Premier不断改进和整合不断改进和整合不断改进和整合不断改进和整合2006 Waters Corporation从从HPLC到到UPLC 2004色谱科学的进步色谱科学的进步?2004.3.8.Waters公司推出全球第一台商品化超高效液相色谱系统ACQUITY UPLCTM系统，将以往人们可望而不可及的UPLC变成实验室中的现实工具，开创了分离科学的新纪元?2004年ACQUITY UPLCTM系统获得匹兹堡最佳新产品金奖?2005年ACQUITY UPLCTM系统再获R&D100 大奖2006 Waters CorporationUltra Performance LC重新定义色谱科学重新定义色谱科学速度灵敏度分辨率创新速度灵敏度分辨率创新Acquity一词源自拉丁文“acutus”，意味着有更出色、更细致地解决问题的能力，及快速、敏锐的智能Acquity一词源自拉丁文“acutus”，意味着有更出色、更细致地解决问题的能力，及快速、敏锐的智能2006 Waters CorporationUPLC的三大优势的三大优势速度灵敏度分离度速度灵敏度分离度?UPLC所展示的优势：样品通量增加九倍 灵敏度增加三倍 分离度增加两倍?数据质量提高?生产力提高2006 Waters Corporation超高效液相色谱的定义超高效液相色谱的定义?超高效液相色谱（超高效液相色谱（Ultra Performance LCUltra Performance LC）是分离分析科学中的一个全新类别 涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术 与HPLC的理论及原理相同 在全面提升HPLC的速度、灵敏度及分离度诸品质的同时，保留其原有的实用性及原理 给实验室带来了新奇而强大的能力2006 Waters CorporationACQUITY UPLC系统系统技术创新诸要素技术创新诸要素?小颗粒杂化填料（1.7m）?更高耐压(达15000Psi)、低系统体积的输液单元?降低自动进样器的进样周期时间、减少交叉污染?高速检测器，光学及质谱?新的色谱单元之间的通讯协议?功能齐全的诊断能力?为系统完整性而设计的软件创新创新2006 Waters Corporation对今天对今天HPLC状况的科学描述状况的科学描述?今天的高效液相色谱分离质量被色谱柱的填料品质所推动，同时也被其所限制 优秀的色谱填料会给色谱过程带来速度、灵敏度及分离度提高 填料颗粒度对色谱柱性能的贡献最大?我们遇到的挑战是：今天的仪器是否能够把更小颗粒度填料的性能表现出来 UPLC以小颗粒填料技术为基础，但是仅有小颗粒填料并不能构成UPLC系统 UPLC是一个综合的技术2006 Waters Corporation色谱理论的回顾色谱理论的回顾?van Deemter曲线及其方程式 1956年；J.J van Deemter介绍了他著名的方程式 最初该方程式主要用在气相色谱（GC）上 经过改进，该方程式用到了液相色谱上?Waters公司引入UPLC的概念由其著名的方程式开始2006 Waters Corporationvan Deemter曲线及方程式曲线及方程式A A 项（涡流扩散,颗粒度和填装技术）（涡流扩散,颗粒度和填装技术）Height Equivalent to Theoretical Plate线速度线速度 U U（mm/sec）（mm/sec）最低HETP=最优化的塔板数最低HETP=最优化的塔板数C 项（传质扩散,颗粒度,流速）C 项（传质扩散,颗粒度,流速）B B 项（轴向扩散,流速）（轴向扩散,流速）HETP PLATESA 项A 项+B 项B 项+C项C项HHETP三项加在一起最终得到的“van Deemter曲线”三项加在一起最终得到的“van Deemter曲线”2006 Waters Corporationvan Deemter 曲线曲线与塔板数和流速的关系与塔板数和流速的关系最佳线速度与流速Height Equivalent to Theoretical Plate HETP线速度线速度ucm/secu=L/t 0HETP PlatesHETP PLATESH塔板数和流速的关系10000500010001.02.03.0流速mL/minHETP 与线速度的关系N2006 Waters Corporationvan Deemter曲线的提示曲线的提示?颗粒度越小柱效越高 颗粒度控制着分离的质量?曲线上有一个最佳流速?更小的颗粒度：使最高柱效点向更高线速度方向移动 有更宽的线速度范围?降低颗粒度不但可以增加柱效，同时也增加分离速度van Deemter 曲线的挑战van Deemter 曲线的挑战如果填料的颗粒继续演变如果填料的颗粒继续演变2006 Waters Corporation未来的色谱未来的色谱:更小的颗粒度更小的颗粒度被仪器及色谱柱被仪器及色谱柱被仪器及色谱柱被仪器及色谱柱的耐压限所限制的耐压限所限制的耐压限所限制的耐压限所限制2006 Waters Corporation线速度与流速的换算线速度与流速的换算线速度mm/sec1246810流速1.0mm IDmL/min0.040.150.70.200.130.070.30.61.42.80.94.20.281.25.50.341.57.0流速2.1mm ID(mL/min)流速流速4.6 mm IDLC/MSu(mm/s)2.1 x 20 mm,1.7 m2.1 x 20 mm,2.5 m2.1 x 20 mm,5 m024681012140.0002.0004.0006.0008.00010.00012.000HETP(m)UPLC Range“Narrow-bore”2006 Waters Corporation更小颗粒度所面临的挑战更小颗粒度所面临的挑战?色谱柱的性能 颗粒耐压及柱结构 颗粒度分布?系统的压力限?系统体积?检测的可行性 流动池的优化 检测的速度?系统控制及数据管理5m填料颗粒一根头发宽度可放12个1.7m UPLC 填料颗粒一根头发宽度可放33个60m人的头发（非常细的）60m人的头发（非常细的）2006 Waters CorporationACQUITY颗粒化学是什么？颗粒化学是什么？?历史上最先进的颗粒技术 高效1.7m颗粒，在硅胶基质内键合了桥式乙烷?改善了高pH稳定性?具有硅胶的柱效与反压 三官能团键合C18配体?改善低pH稳定性 专利端基封口技术?最佳可能峰形请记住：如果不能获得良好峰形，则高柱效和峰容量是不可能的。看看如何达到上述目标2006 Waters Corporation创造全新的颗粒技术创造全新的颗粒技术优势劣势无机（硅胶）优势劣势无机（硅胶）机械强度高机械强度高 高柱效高柱效 保留时间可预测保留时间可预测 有限的pH范围有限的pH范围 碱性化合物拖尾碱性化合物拖尾 化学稳定性差聚合物（碳）化学稳定性差聚合物（碳）宽pH范围宽pH范围 没有离子相互作用没有离子相互作用 化学稳定性好化学稳定性好“软”，机械强度低“软”，机械强度低 柱效低柱效低 保留时间不可预测保留时间不可预测杂化（硅碳键合）颗粒技术杂化（硅碳键合）颗粒技术2006 Waters Corporation第一代杂化颗粒技术第一代杂化颗粒技术我们当年采用的技术我们当年采用的技术1999年年Tetraethoxysilane(TEOS)MethylPolyethoxysilane(MPEOS)Methyltriethoxysilane(MTEOS)Waters 专利技术No.6,686,035 B2Waters 专利技术No.6,686,035 B2甲基甲基在在杂化颗粒表面杂化颗粒表面（更好的峰形）（更好的峰形）并且在并且在杂化颗粒内部杂化颗粒内部（高pH条件下的长寿命）（高pH条件下的长寿命）2006 Waters Corporation第二代杂化颗粒技术第二代杂化颗粒技术桥式乙烷 硅碳杂化颗粒桥式乙烷 硅碳杂化颗粒Anal.Chem.2003,75,6781-6788Tetraethoxysilane(TEOS)Bis(triethoxysilyl)ethane(BTEE)+4Polyethoxysilane(BPEOS)SiEtOEtOOEtEtOSiEtOEtOCH2EtOCH2SiOEtOEtOEtSiEtOOCH2CH2SiOSiEtOOEtSiOOOEtOSiOSiOEtOOOEtEtEtn在硅胶基质中的桥接乙烷基团在硅胶基质中的桥接乙烷基团Waters 专利技术专利技术No.6,686,035 B22006 Waters Corporation创新及最优化的创新及最优化的UPLC柱柱ColumnsColumnseCordeCord2006 Waters CorporationACQUITY UPLC 色谱柱化学色谱柱化学?C18 三官能团键合三官能团键合 C18 专利的端基封口技术专利的端基封口技术 宽宽 pH 范围范围?C8 三官能团键合三官能团键合 C8 专利的端基封口技术专利的端基封口技术 宽宽 pH 范围范围?Shield RP18 双官能团键合双官能团键合 内嵌极性基团内嵌极性基团?Phenyl 三官能团键合三官能团键合 C6Phenyl 专利的端基封口技术专利的端基封口技术2006 Waters CorporationACQUITY UPLC BEH 色谱柱化学色谱柱化学2006 Waters CorporationACQUITY UPLC系统系统通过设计实现超能通过设计实现超能检测器检测器:光学或光学或ELSD及质谱及质谱可调可调UV 或二极管矩阵或二极管矩阵为为UPLCTM优化的检测优化的检测池池高速检测高速检测色谱柱管理器色谱柱管理器:革新枢轴转动设计革新枢轴转动设计多个色谱柱出口至检测器位置多个色谱柱出口至检测器位置样品管理样品管理:低扩散低扩散 XYZZ 形式形式快循环时间快循环时间低交叉污染低交叉污染可使用板或样品瓶可使用板或样品瓶可选样品组织器可选样品组织器二元溶剂管理器二元溶剂管理器:高压混合高压混合二元梯度二元梯度四元溶剂选择四元溶剂选择在线脱气在线脱气低扩散设计低扩散设计UPLC 压力能力压力能力2006 Waters CorporationACQUITY UPLCTM的特性的特性?熟悉的分离机理熟悉的分离机理 同样的色谱理论同样的色谱理论?应用领域扩展应用领域扩展 为MS优化系统，可得到更多的信息为MS优化系统，可得到更多的信息?置信度更高的结果置信度更高的结果 支持先进的诊断技术，可靠性更高支持先进的诊断技术，可靠性更高?提高生产力提高生产力 更高的峰载荷量、更快的色谱更高的峰载荷量、更快的色谱 更高的实验室通量更高的实验室通量2006 Waters Corporation从HPLC 到 UPLC2006 Waters Corporation用用ACQUITY 做做 HPLC10.0Rs=1.86Rs=2.302.1x100mm 5 Hybrid C18Time in Minutes0.010.0Rs=3.01Rs=6.452.1x100mm 5 Hybrid C18ACQUITY(HPLC)HPLC122006 Waters Corporation用用ACQUITY做做HPLC 和和 UPLCTM0.25AUFS10.0Rs=3.01Rs=6.452.1x100mm 5 Hybrid C18ACQUITY(HPLC)0.30AUFSTime in Minutes0.010.0Rs=4.71Rs=9.152.1x100mm 1.7 Hybrid C18同样时间同样时间,分离度更高分离度更高ACQUITY UPLCTM232006 Waters CorporationACQUITY UPLCTM10.00.30AUFSRs=4.71Rs=9.152.1x100mm 1.7 Hybrid C180.33AUFSTime in Minutes0.03.5Rs=3.52Rs=1.822.1x30mm 1.7 Hybrid C18 与与 HPLC分离度相同分离度相同,但时间缩短但时间缩短ACQUITY UPLCTMACQUITY UPLCTM342006 Waters CorporationACQUITY UPLCTM0.33AUFSTime(min)0.03.52.1x30mm 1.7 Hybrid C18 与与 HPLC分离度相同分离度相同,但时间缩短但时间缩短4ACQUITY UPLCTM2.1x30mm 1.7 Hybrid C18 流速加倍，相似分离度，更短分离时间流速加倍，相似分离度，更短分离时间1.60.25AUFSTime(min)0.01.60.25AUFSTime0.052006 Waters CorporationHPLC 和和 UPLC10.02.1x100mm 5 Hybrid C18ACQUITY(UPLC)TMHPLC1.60.25AUFSTime(min)0.0152.1x30mm 1.7 Hybrid C18 流速加倍，相似分离度，更短分离时间流速加倍，相似分离度，更短分离时间2006 Waters Corporation系统概貌 硬件部分系统概貌 硬件部分?UPLC 二元溶剂管理器?UPLC 样品管理器?UPLC 光学检测器?UPLC 系统2006 Waters Corporation二元溶剂管理器二元溶剂管理器?低体积流路?串联/平行流路?四溶剂选择 A1，A2，B1，B2?UPLC高耐压能力?用户诊断2006 Waters Corporation二元溶剂管理器二元溶剂管理器(BSM)的组成的组成Pump APump BSSV ASSV BDegasserTeeFilterMixerVent ValvePlungerWash2006 Waters Corporation低系统体积流路设计低系统体积流路设计Filter/Mixer/Tee Filter/Mixer/Tee AssemblyAssembly“A A”AccumulatorAccumulatorB2B2“A A”Solvent Solvent Select ValveSelect Valve“B B”Solvent Solvent Select ValveSelect ValveB1B1A2A2Solvent A1Solvent A1“A A”PrimaryPrimary“B B”PrimaryPrimary“B B”AccumulatorAccumulatorSix ChannelSix ChannelDegasserDegasserVent Vent ValveValve系统体积低于100l2006 Waters Corporation回顾回顾2695溶剂管理系统的创新设计溶剂管理系统的创新设计关键的功能部件1 梯度比例阀(GPV)2 进口阀3 主柱塞杆4 主压力传感器5 蓄积柱塞杆6 系统压力传感器7 独立的线性柱塞驱动马达ABCD流动相流动相122主柱塞蓄积柱塞546到到HPLC系统系统3772006 Waters Corporation组成的准度组成的准度 1%梯度步长梯度步长0%B1%B3%B2%B7%B6%B5%B4%B9%B8%B10%B2006 Waters Corporation梯度流速的重现性梯度流速的重现性AU0.000.100.200.300.400.500.600.700.80Minutes0.600.700.800.901.001.101.201.301.40Acetanilide-0.677Acetophenone-0.837Propiophenone-0.951Butyrophenone-1.035Benzophenone-1.064Valerophenone-1.111Hexanophenone-1.182Heptanophenone-1.247Octanophenone-1.307PeakStandard Deviation(minutes)Rt%RSD乙酰苯胺0.000830.122苯乙酮0.000850.101苯丙酮0.000820.086苯丁酮0.000800.077二苯甲酮0.000800.075苯戊酮0.000810.073苯己酮0.000790.067苯庚酮0.000820.066苯辛酮0.000900.069N=34温度：温度：30C样品：样品：Phenone测试混合物测试混合物进样体积：进样体积：5L检测波长：检测波长：214nm压力：压力：5,900psi色谱柱：色谱柱：2.130mm，1.7m Bridged Hybrid流动相流动相A：0.1%FA 水溶液流动相水溶液流动相B：0.1%FA乙腈溶液流速：乙腈溶液流速：0.6 mL/min梯度：在梯度：在1分钟内从分钟内从595%的的 B2006 Waters Corporation样品管理器样品管理器?0.120L进样范围进样范围?2样品板固定器，每个可接受：样品板固定器，每个可接受：482mL样品瓶于样品瓶于Waters 样品瓶板中样品瓶板中(标准配置标准配置)另有多种配置另有多种配置?样品温度控制样品温度控制 从从440C2006 Waters Corporation样品组织器样品组织器(样品管理器的选件样品管理器的选件)?Sample Organizer(样品组织器)?扩展样品容量 1,060 x 2 mL 瓶 8,448 个样品?使用 384 孔板时?软件控制?袖珍设计2006 Waters Corporation样品管理器概貌样品管理器概貌?样品室样品室 宽视场照明灯照亮样品间宽视场照明灯照亮样品间?灯的开关可以控制灯的开关可以控制 LED灯在样品取样头上使你能看清它的位置灯在样品取样头上使你能看清它的位置?两个样品盘固定器，包含两个样品盘固定器，包含 一个符合一个符合SBS的托盘的托盘 24/48样品瓶位样品瓶位 两个两个2ml或或4ml瓶瓶?放置放置“stat”样品或标样样品或标样2006 Waters Corporation针内针设计针内针设计1.移动到样品瓶上2.扎破样品瓶的盖3.上样探头和吸样ZZ?针内针设计的益处:针内针设计的益处:事实上消除了取样针在穿透样品瓶盖时，瓶盖碎屑及硬物使进样针弯曲造成的麻烦事实上消除了取样针在穿透样品瓶盖时，瓶盖碎屑及硬物使进样针弯曲造成的麻烦 进样针内的低扩散进样针内的低扩散2006 Waters Corporation极低的交叉污染极低的交叉污染?置换和清洗程序 计量注射器的置换 强溶剂清洗 用弱溶剂置换 弱溶剂清洗 清洗后的注射器再充满 首次空白 0.002%；后续空白 0.0002%?远好于：0.005%（指标）2006 Waters Corporation集成的柱温箱集成的柱温箱?柱温可加至65C?旋转柱出口设计 叠放在上面的检测器，或 独立的质谱?短流路设计 最大限度降低扩散?可兼容各种尺寸的色谱柱 小于10cm柱长(UPLC)2006 Waters Corporation色谱柱在线过滤器色谱柱在线过滤器50 mmColumn100 mmColumn2006 Waters Corporation在线过滤器在线过滤器(In-Line Filters)Replacement Packs of 5 Filters p/n 700002775 Outlet assemblyFilterInlet nutFlowPlace wrenches on flats to assemble and disassemble Column inlet In-line filter unit Stabilizer tube assembly FlowPlace wrenches here to connect In-line filter unit to Column inlet.Place wrenches here to connect In-line filter unit to Stabilizer tube assembly.In-Line Filter p/n 2050003432006 Waters CorporationACQUITY UPLC 的接头长度的接头长度ACQUITY UPLC 0.087”WatersTraditional 0.130”2006 Waters CorporationUPLC光学检测器光学检测器?理解UPLC需要?更快的数据采集速率?低扩散，UPLC流动池?图形软件接口与MassLynx及Empower连接?用户诊断2006 Waters CorporationUPLC流动池设计流动池设计?光引导的UPLC流动池 10mm光程长 流动池通道即低吸收系数的 Teflon AF 管的内部 壁上全内反射，犹如光纤涂层Teflon AF水dTeflon AF2006 Waters CorporationUPLC流动池设计流动池设计?低扩散 UPLC流动池 10mm长分析光路?光引导TeflonAF 500nL体积A=.c.l2006 Waters Corporation关于ACQUITY UPLC的文献?高效液相色谱方法及应用高效液相色谱方法及应用色谱技术丛书色谱技术丛书(第二版第二版)化学工业出版社化学工业出版社 2005.?重新定义分离科学重新定义分离科学LC/GC 增刊增刊(北美版北美版)2005.5 UPLC专辑专辑(出版中出版中)?UPLC-Tandem MS for the determination of epirubicin(表阿霉素表阿霉素)in human plasma Ruiping Li,Lili Dong,Junxiong Huang，Analytica Chimica Acta 546(2005)167-1732006 Waters CorporationACQUITY UPLCTM分离科学的创新分离科学的创新