脂肪酸∕脂肪酸甲酯气相分析概要.pdf

1欢迎大家关注本期Sigma-Aldrich公司Supleco的脂肪酸和脂肪酸甲酯气相分析的网络讲座。本期讲座不仅面对初遇脂肪酸甲酯的分析者，也面向资深分析者，希望起到拾遗补漏，温故知新的作用。也希望本次讲座给大家的分析工作带来助益，方便各位解决平时遇到的一些问题。2本次讲座将分三个部分向您阐述对于不同脂肪酸甲酯的分析方法，以及脂肪酸甲酯的基础知识等。脂肪酸及脂肪酸甲酯分析应用手册，可免费索取，或登录：http:/ 下载油脂是不饱和高级脂肪酸（C6-C26）甘油酯（油）和饱和高级脂肪酸甘油脂（脂肪）的统称。脂肪酸及脂肪酸甲酯的分析贯穿于我们的生活中，涉及到多个行业的方方面面。3什么是FFAs游离脂肪酸和FAMEs脂肪酸甲酯呢？油脂类物质主要以TG甘油三脂的形式存在。因甘油酯不能直接进行GC分析，需水解或皂化（Saponification）后成为游离脂肪酸再进行分析。一些小分子的游离脂肪酸可直接分析，而大多数情况下还需衍生化为甲酯后分析。45为什么需要分析脂肪酸及其甲酯？美国FDA于1990年实施的Nutrition Labeling and Education 中规定，食品标签必须明确标示食物中“总脂肪”含量及“饱和脂肪”含量。“单不饱和脂肪”和“多重不饱和脂肪”含量为选标。然而最近科学家们发现反式脂肪酸与很多现代“富贵病”有很大联系后，北欧一些国家已经明确将反式脂肪酸超过2%的食品列为不合格食品。但并不是所有的脂肪都是对人体有害的，相反，有很多种油脂是人体无法“自足”需要外源性补充的，如：亚油酸和亚麻酸等。对于我们智力有助益的如EPA和DHA都是重要的营养成分也已是常见的食品添加剂。6脂肪酸又如何分类呢？按脂肪酸空间结构的不同，分为顺式脂肪酸和反式脂肪酸（trans fatty acids，TFA）。TFA 是分子中含有一个或多个反式双键的非共轭不饱和脂肪酸。天然脂肪酸中的双键多为顺式，氢原子位于碳链的同侧，而反式双键的两个氢原子位于碳链的两侧。反式脂肪酸空间结构成现为线性，结构稳定，这也解释了为什么反式脂肪酸通常呈现为固态，便于运输等特点。7按照不饱和度分，脂肪酸分为单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。一些对人体健康相关的不饱和脂肪酸多为PUFA，如花生四烯酸AA，EPA,DHA等。脂肪酸及脂肪酸甲酯又如何命名呢？一些常见的名称如：月桂酸等来源于习惯命名法。对于更复杂的则用系统命名法来命名。1.编码系统：是从脂肪酸碳氢链的羧基端开始数碳原子，先写出碳原子总数目，再写出双键总数目，最后标出双键位置；碳原子数与双键数之间用“:”号隔开，双键总数与双键位置之间以“”隔开。如棕榈酸（软脂酸）可简记为：C16:0，它表示16 个碳原子而无双键的饱和脂肪酸，而油酸可简记为：C18:19，表示它有18个碳原子，含个不饱和双键，双键位于从羧基数起的第个碳原子处。CH3(CH2)7=9CH(CH2)71COOH 顺-9-十八碳烯酸(油酸)(C18:19)(cis-9-octadecenoic acid)亚油酸(linoleic acid)被命名为：顺-9,12-十八碳二烯酸(亚油酸)(C18:29,12)(cis-9,12-octadecadienoic acid).CH3(CH2)4CH=12CHCH2CH=9CH(CH2)71COOH2.或编码系统：是从脂肪酸碳氢链的甲基端碳原子（即距羧基端最远处碳原子）开始数碳原子的排列顺序。按此编码系统，亚油酸简写作C18:2n-6,9（或C18:2-6,9），表示它有18个碳原子，含2个不饱合双键，双键位于从甲基端算起的第和第个碳原子上。EPA简写作C20:5n-3,6,9,12,15(或C20:5-3,6,9,12,15)，顺-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸(EPA)(相当于编码系统：C20:55,8,11,14,17)CH3CH2CH=17CHCH2CH=14CHCH2CH=11CHCH2CH=8CHCH2CH=5CH(CH2)31COOH9对于不同行业所关注的脂肪酸组份各有不同，本处收录了一些从文献中收集到的常被关注的脂肪酸组份。10从表格罗列的结果来看，很好的解释了为什么吃海鱼能使我们变得更加聪明：因为鱼类中含有更多不饱和脂肪酸，如：EPA和DHA。11常见的相关分析标准主要来自国标，美国的AOAC和AOCS方法及欧盟的一些标准。本处也罗列出对应标准使用的色谱柱。12基础知识可见脂肪酸及脂肪酸甲酯分析应用手册，可免费索取。或登录：http:/ 下载对于固定相的选择，通常考虑：选择性、最高温度、极性三点。14柱内径的选择中，大家需要考虑到柱效和样品容量这两者相互制约。15对于膜厚的选择，通常考虑以上四点。此处引出的相比率代表柱子里气体体积与固定相体积比率。拥有相同相比率beta值的不同色谱柱在相同分析条件下会有相似的保留时间和馏出顺序。故相比率是我们选择固定液膜厚时有用的一项参数。16信噪比在柱长选择时，大家常会认为增加柱长就能增加等值的分辨率，在程序升温时，并不遵守这一规律，因为分辨率与柱长的平方根成正比。分析时间、线速度和分辨率三者相互制衡。故平时我们常用的30m柱在满足以上三点时都能兼顾。17游离脂肪酸大多为短链的脂肪酸，未经甲酯化，呈酸性。Nukol柱可直接分析此类样品。18从分析结果来看，C2-C7小分子的脂肪酸未经衍生化，也能获得良好的峰形和分辨率。19非极性柱（Equity1）能够提供饱和与不饱和脂肪酸按不同沸点的出峰顺序的结果。其好处易于使质控部门从参照物中比对出脂肪酸的来源，掺杂物，纯度等。而脂肪酸细微的变质、降解也能从谱图结果的比对中举证出来。聚乙二醇PEG柱（Omegawax等）此类柱常用于对不同碳链长度和不饱和度脂肪酸类的分析。利于分析如海洋鱼类油脂及动物血液中脂类成分的样品。强极性氰丙基硅氧烷柱(SP-2380/SP-2560)利于分析 顺/反 空间异构体及双键位置异构体的分析。也是目前分析FAMEs使用最为广泛的一类分析柱。最常见的应用是氢化植物油（人造黄油）的样品分析。超强极性离子液体柱（SLB-IL100/111）异于传统固定相的离子液体固定相因其强极性，可使极性样品得以快速分离。最大耐温度高，可至270，低柱流失。也是具有希望的“未来柱型”。2037种脂肪酸甲酯，依次按沸点出峰，即使是细微的掺杂外来物质即可甄辩。然而常规的气相将会耗费宝贵的分析时间。21用15m的色谱柱进行快速气相分析，仅在5分钟内就完成了37种脂肪酸甲酯的分析，时间成本大大减少，但其代价仅是一些分辨率的牺牲。22Supelco 37 Component FAME Mix 47885-U 模拟实际样品中的主要FAMEs成分：牛奶中C4饱和脂肪酸酯到C16-C18的不饱和脂肪酸酯组份；植物油脂中氢化及未氢化的指标FAMEs，C8-C24,C16:1,cis-trans C18:1,C20:1,C22:1；鱼油中的omega-3 和 omega-6等多不饱和脂肪酸酯等。是目前脂肪酸甲酯检测主流的混合标准品。由于长链脂肪酸都具有更高的沸点或极性，空间结构也更为复杂，脂肪酸甲酯FAMEs的分析中则更多的应用到了PEG系列的极性柱和极性更强的氰丙基聚硅氧烷系列毛细色谱柱，但两者在FAMEs分析中的选择性又有区分。24Omegawax在分析人造黄油和动物油脂时是最为合适的。这类色谱柱提供了分析含有Omega 3 和 6不同碳链长度的脂肪酸酯最佳分辨率的谱图结果。25什么是ECL？为什么要用ECL？参数ECL是等效碳链长度，ECL的作用是将不饱和脂肪酸异构体换算成相当的饱和脂肪酸碳数，便于我们预测多重不饱和脂肪酸按照碳链长度馏出时的顺序。当柱温以恒温或恒速程序升温时，保留时间与饱和脂肪酸碳数呈线性关系，因此可将不饱和脂肪酸异构体换算成相当的饱和脂肪酸碳数.待测的不饱和脂肪酸甲酯必须在两个饱和脂肪酸甲酯之间出峰，这两个饱和脂肪酸甲酯在相同操作条件下间隔不超过两个碳单位.26不同色谱柱都有其固定的ECL值，此处列举的是Omegawax320在200摄氏度时求取的ECL值。等值碳链拥有相等的ECL值，如C18:1n，C18:2n和C18:3n。从ECL的结果也看出，此时Omegawax就不能应付顺反异构体的问题了。2728Omegawax 250(L I.D.15 m 0.10 mm df:0.10 m,L I.D.:30 m 0.25 mm,df:0.25 m)Omegawax 320(L I.D.:30 m 0.32 mm,df:0.25 m)Omegawax 265(L I.D.:30 m 0.53 mm,df:0.50 m)强极性的氰丙基聚甲基硅烷类毛细色谱柱用于分析沸点相近的FAMEs空间异构体（顺反异构体）。SP-2380满足了以组份为单位的顺反异构体的分析，通常ECL值相近的（trans）反式异构体组份在（cis）顺式异构体组份之前流出。在更为复杂的情况下，双键位置异构体同样可被分析。SP-2560满足更高分辨率分析的要求，更进一步的可对顺反异构体的空间位置异构进行拆分31相较两款色谱柱的分析结果而言，SP-2380虽然牺牲了分辨率，但赢取了大量宝贵的分析时间。32SP-2560不仅可以很好的分离顺反异构体，对于不饱和键的位置异构体也能很好的分辨。33天然植物油中仅以cis形式存在，但人造氢化油脂中以饱和反式脂肪酸居多，故SP-2560可应用于日间检测油脂产品的质量控制。SP-2560由于极性高于SP-2380，故在分辨率上较后者有所提升。34SP-2560与HP-88的37FAMEs结果比较，SP-2560在选择性、分辨率和柱流失方面都存在优势。35SLB-IL系列柱是离子液体GC柱首度商业化的产品，也是潜在具有实力的未来强极性柱发展趋势之一。因固定液的结构有颠覆性的变化，SLB-IL系列柱具有的超强极性，低柱流失，耐温高（Max Temp.270）耐氧和耐水气等特殊优点，成为未来极性柱设计的趋势。结果表明SLB-IL100的超强极性将空间位置异构体的分离又有更进一步的性能提升。36此处以Partially Hydrogenated Vegetable Oil（半氢化植物油）为基质，对比SP-2560与SLB-IL111的分析结果：由于SLB-IL111极性更强，FAME异构体馏出时间更短，也更为高效。对于分离C18:1D9c 到 C18:1D15tC18:2D9c,11t 到 C18:2D7t,9c.对于SP-2560或其他氰丙基硅氧烷类色谱柱都颇显勉强，但SLB-IL111的表现出色。373839谢谢大家的支持与参与。