Quattro Premier Training高级培训.pdf

Quattro PremierThe Quattro PremierAgenda for Training CourseDay 1:Instrument Overview and RF/Quadrupole TheoryElectrospray and Z-Spray TheoryAPcI TheoryScanning TechniquesCone Voltage FragmentationT-Wave TechnologyLC-MS Introduction API Spectral Interpretation Acquity UPLC&Column UseDay 2:MS Tune Data AcquisitionAgenda for Training CourseDay 3:LC-MS/MS QuantificationDay 4:Mass Calibration Maintenance仪器示意图仪器示意图1.经经HPLC分离的样品进入大气压电离源分离的样品进入大气压电离源1.1.经经经经HPLCHPLC分离的样品进入大气压电分离的样品进入大气压电分离的样品进入大气压电分离的样品进入大气压电离源离源离源离源2.样品离子经样品离子经T-wave聚焦进入质量分析器聚焦进入质量分析器2.2.样品离子经样品离子经样品离子经样品离子经T T-wavewave聚聚聚聚焦进入质量分析器焦进入质量分析器焦进入质量分析器焦进入质量分析器3.样品离子根据其质荷比在样品离子根据其质荷比在MS1中过滤分析中过滤分析3.3.样品离子根据其质荷比在样品离子根据其质荷比在样品离子根据其质荷比在样品离子根据其质荷比在MS1MS1中过滤分析中过滤分析中过滤分析中过滤分析4.被分析离子在被分析离子在T-wave碰撞室中进行碰撞室中进行CID分析分析4.4.被分析离子在被分析离子在被分析离子在被分析离子在T T-wavewave碰碰碰碰撞室中进行撞室中进行撞室中进行撞室中进行CIDCID分析分析分析分析5.碎片离子根据其质荷比在碎片离子根据其质荷比在MS2中过滤分析中过滤分析5.5.碎片离子根据其质荷碎片离子根据其质荷碎片离子根据其质荷碎片离子根据其质荷比在比在比在比在MS2MS2中过滤分析中过滤分析中过滤分析中过滤分析6.光电倍增器检测分析离子光电倍增器检测分析离子6.6.光电倍增器检测分析离光电倍增器检测分析离光电倍增器检测分析离光电倍增器检测分析离子子子子仪器平面示意图仪器平面示意图预四极杆过滤器和四极杆质量分析器预四极杆过滤器和四极杆质量分析器PrefilterQuadrupole Mass FilterQuadrupole AnalyserQuadrupole AnalyserRejected ionsStable ion质谱分辨率的定义质谱分辨率的定义单位质量分辨率单位质量分辨率:FWHM=0.5-0.8 amuwith 10-20%valley传统分辨率的定义传统分辨率的定义:分辨率分辨率R=m/mat 5%valley 单位质量分辨率单位质量分辨率半峰高处的半峰宽为半峰高处的半峰宽为 0.5-0.8 amum/m=133/0.6=222Peak width at half height=0.6m/m=1009/0.5=2018Peak width at half height=0.5分辨率的设置分辨率的设置LM/HM resolution=15:Peak width at 1/2 height=0.6 amu分辨率设置分辨率设置LM/HM resolution=11:Peak width at 1/2 height=1.4 amuUNDER-RESOLVED分辨率设置分辨率设置LM/HM resolution=18:Peak width at 1/2 height=0.3 amuOVER-RESOLVED大气压电离技术大气压电离技术(API)离子化发生在大气压环境下离子化发生在大气压环境下(与真空情况下的离子化相比较，如与真空情况下的离子化相比较，如EI)API 技术技术 ESI-Electrospray Ionization APCI-Atmospheric Pressure Chemical Ionization什么是电喷雾电离什么是电喷雾电离(ESI)？毛细管+4kV3)离子从液滴表面蒸发出来-+-+-1)含各种离子的液滴-+-+-+-+-2)随着液滴的挥发,电荷密度增大,离子集中到液滴表面+-+-+-+-+-+-Z SPRAYTMSource电喷雾电喷雾 Tune Page 设置设置电离电压电离电压Positive ESNegative ES2.502.503.753.752.002.003.003.00电喷雾电喷雾 Tune Page 设置设置锥孔电压锥孔电压Cone Voltage1010100100电喷雾电喷雾 Tune Page 设置设置萃取锥孔和萃取锥孔和RF 透镜电压透镜电压1 15 5Extractor Voltage0 05 5RF Lens Voltage电喷雾电喷雾 Tune Page 设置设置离子源温度离子源温度Infusion(5-40 l/min)Source temp.80Desolvation temp.120HPLC(100-300 l/min)Source temp.Desolvation temp.120300电喷雾电喷雾 Tune Page 设置设置气流气流锥孔气去溶剂气锥孔气去溶剂气30030010001000100100探头位置探头位置建议的设置建议的设置注意注意:入口和出口的电压设置在入口和出口的电压设置在20-100V之间碰撞能量要小大约之间碰撞能量要小大约2-3 eV之间之间大气压化学电离大气压化学电离(APcI)适合小分子化合物适合小分子化合物(1x10-3mbar).在碰撞室中轴向速度的减少在碰撞室中轴向速度的减少(由于多重碰撞）将限制仪器在快速扫描或由于多重碰撞）将限制仪器在快速扫描或MRM方式切换时的性能。方式切换时的性能。以前解决此问题的方法是加一轴向电压梯度以提高离子的轴向速度，但这会降低离子在碰撞室中驻留时间。以前解决此问题的方法是加一轴向电压梯度以提高离子的轴向速度，但这会降低离子在碰撞室中驻留时间。驱动离子通过碰撞室的新技术是利用了加在离子导向边界的双向前行波（驱动离子通过碰撞室的新技术是利用了加在离子导向边界的双向前行波（travelling wave）T-Wave离子传输技术T-Wave的硬件技术是一组环型离子导向板，相邻的一对环型电极上加的射频电压的相位相反。环型导向板上除了射频电压外，每一环型电极上还有一恒定的直流偏置电压的硬件技术是一组环型离子导向板，相邻的一对环型电极上加的射频电压的相位相反。环型导向板上除了射频电压外，每一环型电极上还有一恒定的直流偏置电压(碰撞能量或射频透镜电压碰撞能量或射频透镜电压)。timeionsTravelling Wave Pulse直流电压的瞬变（直流电压的瞬变（transient）将致环型电场的变化，离子将从此电场中排出。离子只沿轴向运动，直流电压在一固定的时间后切换到下一环型导向板，如此，就可形成一运动的电场或）将致环型电场的变化，离子将从此电场中排出。离子只沿轴向运动，直流电压在一固定的时间后切换到下一环型导向板，如此，就可形成一运动的电场或“travelling wave”，离子在此电场中做波浪运动，离子在此电场中做波浪运动“surf”。更高的更高的 MRM 采集速率采集速率 每个每个MRM的循环时间由两部分组成：的循环时间由两部分组成：dwell时间即离子被监测的时间时间即离子被监测的时间 两个连续两个连续MRM通道之间的通道之间的inter-channel delay 时间，即将所有离子从碰撞池排出的时间。时间，即将所有离子从碰撞池排出的时间。在在inter-channel delay之后，碰撞池必须快速地充满另一之后，碰撞池必须快速地充满另一MRM通道的离子。通道的离子。如果速度不够快（即当如果速度不够快（即当dwell time设得非常短时），信号强度将会下降。设得非常短时），信号强度将会下降。更高的更高的 MRM 采集速率采集速率Travelling Wave 离子传输MRM 采集速率对信号强度的影响每秒每秒100个数据点个数据点更高的更高的 MRM 采集速率采集速率LC/MS/MS多农残分析多农残分析(81种化合物种化合物,3组通道时间窗口组通道时间窗口)LC/MS/MS 需要同时监测需要同时监测 27个 MRM 离子对(每个通道时间窗口每个通道时间窗口).每个每个MRM离子对采用离子对采用40 ms的的dwell time(5 ms的的inter-channel delay).如果平均峰宽为如果平均峰宽为10秒，那么每个峰将只有秒，那么每个峰将只有8个数据点来描述。而这对于可靠的峰面积定量是不够的。来描述。而这对于可靠的峰面积定量是不够的。因此，本实验将每个离子对的因此，本实验将每个离子对的dwell time设为设为5 ms（inter-channel delay设为设为5 ms），这样对于一个），这样对于一个10秒宽的峰将获得秒宽的峰将获得37个数据点。个数据点。更高的更高的 MRM 采集速率采集速率更高的更高的 MRM 采集速率采集速率以上数据说明即使是在很短的MRM采集循环时间内，travelling wave技术也可保证信号强度，提高了Quattro PremierTM信号采集的性能。采用MRM扫描方式，您可以每秒采集到多达100个数据点。此速率相当于同时监测66个MRM通道，同时保证用15个点表达10秒种宽度的色谱峰。更低的更低的MRM inter-channel交叉干扰交叉干扰什么是inter-channel crosstalk?监测的两组监测的两组MRM有相同的子离子。有相同的子离子。MRM循环时间很短。循环时间很短。样品浓度范围很宽（样品浓度范围很宽（3到到4数量级）数量级）当高浓度化合物当高浓度化合物1进样后，监测化合物进样后，监测化合物2的的MRM通道也会产生信号，而实际上进样的样品中并没有化合物通道也会产生信号，而实际上进样的样品中并没有化合物2。更低的更低的MRM inter-channel交叉干扰交叉干扰Travelling Wave离子传输与MRM交叉干扰 为了避免连续为了避免连续MRM监测过程中的交叉干扰，必须保证在第二组监测过程中的交叉干扰，必须保证在第二组MRM采集之前，第一组采集之前，第一组MRM的所有离子从碰撞池中清出。的所有离子从碰撞池中清出。Quattro Premier的碰撞池采用的碰撞池采用travelling wave技术，即使是采用非常短的技术，即使是采用非常短的inter-channel delay也可以从碰撞池中快速清出离子。也可以从碰撞池中快速清出离子。更低的更低的MRM inter-channel交叉干扰交叉干扰Dwell=10msInter-channel delay=10ms维拉帕米虚假的MRM信号更低的更低的MRM inter-channel交叉干扰交叉干扰Travelling Wave技术保证即使是在最快的MRM采集时间下也完全消除Quattro PremierTM的inter-channel 交叉干扰。提高Quattro PremierTM快速MRM采集性能。LC-MS 介绍介绍液质联用方法开法中主要考滤以下几个因素液质联用方法开法中主要考滤以下几个因素 LC-MS分析的目的分析的目的 溶剂和缓冲盐的选择溶剂和缓冲盐的选择 等度或梯度方法等度或梯度方法 样品情况样品情况 流速的影响流速的影响 色谱柱规格和温度色谱柱规格和温度LC-MS配置配置液相色谱仪和进样器液相色谱仪和进样器色谱柱色谱柱分流器分流器废液或馏分收集器废液或馏分收集器探头探头基质干扰基质干扰:Loop 进样进样In MethanolIn Tomato Juice基质干扰基质干扰:用色谱柱将基质和分析物分离用色谱柱将基质和分析物分离In MethanolIn Tomato Juice正离子方式或负离子方式正离子方式或负离子方式?碱性化合物碱性化合物(-NH2)(M+H)+酸性化合物酸性化合物(-CO2H,-OH)(M-H)-NHNOClClOCH3CH3OOHCH3CH3CH3Linuron+ve ionIbuprofen-ve ionpH 值的影响值的影响正离子方式 分析碱性化合物用有机酸调整 pH 值如：甲酸或乙酸负离子方式 分析酸性化合物用碱调整 pH 值如：氢氧化铵/氨水pH 值的影响值的影响pH 值的影响值的影响一般所用溶剂和缓冲盐一般所用溶剂和缓冲盐溶剂溶剂水乙腈水乙腈缓冲盐缓冲盐甲酸乙酸氢氧化胺乙酸胺甲酸乙酸氢氧化胺乙酸胺*甲醇异丙醇甲醇异丙醇*缓冲盐浓度应不超过缓冲盐浓度应不超过10 mM。溶剂和添加剂的选择溶剂和添加剂的选择 TFA（三氟乙酸）（三氟乙酸）-用于分析蛋白和多肽用于分析蛋白和多肽 它能抑制它能抑制ESI+电离至少电离至少 0.1%。它将很大程度上抑制它将很大程度上抑制ESI-电离。电离。TEA（三乙胺）（三乙胺）有丰富的有丰富的m/z 102离子存在（三乙胺加质子的峰）。离子存在（三乙胺加质子的峰）。抑制弱碱性化合物的抑制弱碱性化合物的ESI+电离，但能提高弱碱性化合物的电离，但能提高弱碱性化合物的ESI-电离。电离。THF（四氢呋喃）（四氢呋喃）100%的四氢呋喃可能会着火。的四氢呋喃可能会着火。当喷雾气是空气时，在当喷雾气是空气时，在APCI电离方式，不能用四氢呋喃。电离方式，不能用四氢呋喃。不恰当的溶剂和缓冲盐不恰当的溶剂和缓冲盐 不挥发性缓冲盐不挥发性缓冲盐(磷酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐等磷酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐等)表面活性剂表面活性剂(抑制电离抑制电离)无机酸无机酸(硫酸、磷酸等硫酸、磷酸等)用用PEEK管时注意溶剂的使用管时注意溶剂的使用 溶胀溶胀 PEEK DMSO THF CH2Cl2 腐蚀腐蚀 PEEK HNO3 H2SO4常用溶剂常用溶剂 乙腈乙腈常用溶剂常用溶剂 甲醇甲醇溶剂的选择溶剂的选择同位素峰同位素峰两种不同有机溶剂的比较两种不同有机溶剂的比较流动相配比的影响流动相配比的影响HPLC等度和梯度方法比较等度和梯度方法比较等度等度 LC梯度梯度 LC分析物溶解分析物溶解样品全溶解于水中样品全溶解于水中样品溶解于流动相中样品溶解于流动相中流速对大气压电离的影响流速对大气压电离的影响00.51.01.52.050100Relative intensityAPCIPneumatically assisted ESIPure ESI流速流速(ml/min)(50/50 ACN/H20)质谱能适应的流动相流速质谱能适应的流动相流速APCI0.2-1 ml/min（不用分流）（不用分流）ESI1-300 l/min（需要分流，约（需要分流，约 250 l 进入质谱）进入质谱）分流器的连接分流器的连接死体积为零的三通PEEK 管PEEK 管电雾喷探头废液池或溜分收集器分析色谱柱LC流速对质谱的影响流速对质谱的影响LC流速对质谱的影响流速对质谱的影响HPLC色谱柱的选择色谱柱的选择LC流速一般根据色谱柱规格和电离方式来确定流速一般根据色谱柱规格和电离方式来确定0.5-2 ml/min3.9-4.6 mm i.d.0.1-0.3 ml/min2.1 mm i.d.40-50 l/min1 mm i.d.165.07 0.48 30.0 14.02 :213.05 72.14 0.48 30.0 18.0自动定量自动定量定量分析结果定量分析结果