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组织病理切片的制作流程
1． 取材
组织取材的方法是制作切片的一个重要程序, 根据教学、 科研及外检的具体要求取自人体( 外科手术切除标本、 活检标本、 尸检标本) 或动物, 并确定取材的部位和方法。取材者需要掌握解剖学、 组织学、 病理学的基本理论知识, 还要掌握实际操作技术, 每个组织器官的取材都有一定的部位和方法, 不能任意切取组织作为制片材料, 不然, 无法达到教学、 科研和临床诊断的目的, 具体要求如下:
(1)材料新鲜: 取材组织愈新鲜愈好, 人体组织一般在离体后, 动物组织在处死后迅速固定, 以保证原有的形态学结构。
(2)组织块的大小: 所取组织块较理想的体积为2.0cm×2.0cm×0.3cm, 以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部, 但根据制片材料和目的不同, 组织块的较理想体积也不同, 如制作病理外检、 科研切片, 其组织块能够薄取0.1～0.2cm即可, 这样能够缩短固定脱水透明的时间, 若制作教学切片厚取0.3 ～0.5cm, 这样能够同一蜡块制作出较多的教学切片。
(3)勿挤压组织块: 切取组织块用的刀剪要锋利, 切割时不可来回锉动。夹取组织时切勿过紧, 以免因挤压而使组织、 细胞变形。
(4)规范取材部位: 要准确地按解剖部位取材, 病理标本取材按照各病变部位、 性质的不同, 根据要求规范化取材。
(5)选好组织块的切面:根据各器官的组织结构, 决定其切面的走向。纵切或横切往往是显示组织形态结构的关键, 如长管状器官以横切为好。
(6)保持材料的清洁:组织块上如有血液、 污物、 粘液、 食物、 粪便等, 可用水冲洗干净后再放入固定液中。
(7)保持组织的原有形态:新鲜组织固定后, 或多或少会产生收缩现象, 有时甚至完全变形。为此可将组织展平, 以尽可能维持原形。
2．固定
(1)小块组织固定法: 这是最常见的方法, 从人体或动物体取下的小块组织, 须立即置入液态固定剂中进行固定, 一般, 标本与固定液的比例为1:4～20, 但组织块不宜过大过厚, 否则固定液不能迅速渗透。故取组织块的大小一般为2.0cm×2.0cm×0.3cm。
(2)注射、 灌注固定法: 某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部, 或需要对整个脏器或整个动物体进行固定。这时宜采用注射固定或灌注固定法。将固定液注入血管, 经血管分支到达整个组织和全身, 从而得到充分的固定。
(3)蒸汽固定法: 比较小而厚的标本, 可采用锇酸或甲醛蒸汽固定法。如血液涂片, 则应在血片未干燥前采用锇酸或甲醛蒸汽接触固定。
最常见的固定液有10%甲醛固定液和95%乙醇固定液。
3．脱水透明标本经过固定和冲洗后, 组织中含有较多的水分, 必须将组织块内的水分置换出来, 这一过程叫做脱水。无论是用石蜡切片, 还是用火棉胶切片, 都必须除去组织中所含水分, 因含水组织与石蜡、 火棉胶等包埋材料不相容, 常见的脱水剂为一系列不同浓度的乙醇。
脱水的步骤是: 80%、 90%、 95%、 100%各种浓度乙醇2小时, 此过程可用脱水机自控完成。
丙酮也是一种脱水能力很强的脱水剂, 但因其脱水能力很强, 对组织有剧烈收缩作用, 在制作科研、 教学切片时一般不用该试剂。因乙醇、 丙酮等不溶于石蜡, 还要经过一个能溶于石蜡的溶剂替代过程称为透明。常见的透明剂有二甲苯、 三氯甲烷、 水杨酸甲酯等。
4．浸蜡、 包埋
(1)使石蜡浸入组织中, 取代组织中含有的透明剂。
(2)包埋: 将浸蜡后的组织置于融化的固体石蜡中, 石蜡凝固后, 组织即被包在其中, 称蜡块, 此过程称为包埋。
5．切片和贴片
(1)修整蜡块: 可视其组织的大小, 在组织边缘约0.1～0.2cm处, 切去余蜡部分, 否则易造成组织皱缩不平。
(2)准备好切片用具: 切片刀、 毛笔、 眼科镊子( 弯) 、 漂烘温控仪
(3)安装蜡块: 将修好的蜡块安装在金属或木制持蜡器上。
(4)安装切片刀: 将切片刀安装在切片机的刀台上, 把刀台上的紧固螺丝旋紧, 使切片时不产生振动, 能保持一定的切片厚度。
(5)切片的厚度: 切片机的厚度调节器上刻有0～50μm或0～25μm, 可任意选择其厚度, 石蜡切片的厚度一般在4～6μm。
(6)切片
(7)铺片: 用眼科镊子镊起蜡带轻轻平铺在40～45℃的水面上, 借水的张力和水的温度, 将略皱的蜡带自然展平。
(8)贴片、 烘片: 待切片在恒温水面上充分展平后, 将蜡片捞到载玻片的中段处倾去载玻片上的余水, 置入60～65℃恒温箱内或切片漂烘温控仪的烘箱内烤片15～30分钟, 脱去溶化组织间隙的石蜡。
6．染色和封片常见的染色方法是苏木素-伊红( Hematoxylin-Eosin) 染色法, 简称H.E染色法。这种方法对任何固定液固定的组织和应用各种包埋法的切片均可使用。苏木素是一种碱性染料,可使组织中的嗜碱性物质染成蓝色, 如细胞核中的染色质等; 伊红是一种酸性染料, 可使组织中的嗜酸性物质染成红色, 如多数细胞的胞质、 核仁等在H.E染色的切片中均呈红色。
H.E染色程序如下:脱蜡、 脱苯、 复水、 染色、 脱水、 透明、 封固
常规苏木素染色中的对比染色是用伊红,近年来在英、 美国家的一些实验室则采用焰红( phloxine) ,另外也有用桔黄G( OrangeG) 、 比布里希猩红(Biebrich scarlet)、 波尔多红(Bordeaux red)等作为对比染色。伊红为染胞质、 胶原纤维、 肌纤维、 嗜酸性颗粒等常见的染料。
1 . 取材
取材的好坏, 直接影响切片的质量。医生在取材时, 首先要有一把锋利的取材刀, 在切割组织时要避免取材刀来回拖拉, 切取的组织块厚薄要均匀, 一般厚度以0.2 ～0.3cm为适, 较容易发脆的组织如甲状腺、 肝脏、 血块、 淋巴结、 大块癌组织等可适当厚一点, 而脂肪组织、 肺组织、 纤维性肿瘤、 平滑肌瘤等致密的或试剂不易渗入的组织应取薄一些; 淋巴结应修掉两侧球冠, 并尽量剔除周围的脂肪组织。在取材中还应十分注意组织内是否有缝线或骨组织, 如碰到不可避免的钙化组织, 应与技术室讲明, 在切取纤维组织、 肌肉、 组织、 胃肠道时, 应注意纤维及肌肉的走向, 取材时尽可能按与纤维平行走向切取为佳。
2 . 固定
固定是技术室工作的第一步, 也是在整个制片过程中无法补救的一步。所谓”固定”, 就是组织离体后, 用各种办法使其细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构和位置的过程。固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败, 防止了细胞内的酶对蛋白质的分解作用, 使细胞内的各和成分如蛋白质、 脂肪、 碳水化合物或酶类转变为不溶性物质, 以保持原有的结构与生活时相仿。另外, 组织固定后, 均呈一定的硬化状态, 增加组织韧性, 而且不易变形, 有利于以后的组织处理。因此组织一旦离体必须及时固定, 固定液的量应为组织的5倍。固定的关键主要与固定的及时性、 固定液的选择、 固定液的浓度、 固定的温度和时间有关。最常见的固定液为10％福尔马林。笔者认为, 10％福尔马林由于受到福尔马林的质量、 使用时的挥发和取材时带入的水分影响, 浓度被降低致组织固定不足, 而高浓度的福尔马林, 降低了对组织的穿透性, 形成周围固定好而中央固定不到的现象。经过实践, 本人认为以酸性12～15％的福尔马林最佳。大标本( 2cm厚) 一般需要6～12个小时, 小标本一般需要3～6个小时; 当室温低18℃时, 可在37℃以下的温箱内加温4～6个小时。由于HE染色最佳着色PH为3.5～4.5, 中性福尔马林对苏木素染色有一定影响,细胞核容易发灰,核染色质不佳。因此, 尽管中性福尔马林对抗原有很好的保存作用, 但酸性福尔马林对绝大多数抗原来说也有很好的保存作用, 因此在没有特别处理的情况下常规HE用12～15％酸性福尔马林也能够( 每100毫升12～15％福尔马林液内加5毫升冰醋酸) 。骨髓、 结缔组织固定以Bouin液为佳, 经Bouin液固定后的组织必须流水冲洗4小时以上。有条件的单位可根据不同要求选用二种或二种以上的固定液; 少数单位还可建立组织冷冻库, 以便适应各种特殊的处理要求。
3. 水洗
固定后水洗( 10～20分钟) , 一般被很多人所忽视, 而水洗不彻底, 容易造成脱片和染色不鲜艳。对需做免疫组织化学的组织, 更不应当忽视。福尔马林不利于组织块内抗原的保存
4 . 脱水和透明
所谓脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来, 以利于有机溶剂的渗入, 这一过程称为脱水。脱水是否彻底, 直接关系到组织是否能充分透明, 而脱水过度( 原因是组织在纯酒精内时间过久, 发生组织质地发生变化) 容易造成组织发脆。造成组织发脆的原因还有加温( 温度超过35℃) 、 脱水剂内加有丙酮、 浸蜡用的石蜡中二甲苯过多等等。一般我们总认为组织发脆跟高浓度酒精有关, 而忽视了与低浓度的酒精关系, 其实低浓度的酒精具有强大的穿透力, 比纯酒精更容易渗透到组织块内部使之脱水, 组织如果在低浓度酒精里充分脱水, 在高浓度酒精里只需脱去从低浓度到高浓度之间的水份, 因此, 仅需短时间就可完成, 如果这时不缩短纯酒精的时间, 便会引起组织发脆; 如果脱水时加温, 使用丙酮, 还可引起组织收缩, 并影响免疫组织化学的标记。为了使石蜡浸入到组织块内, 必须经过一种既能与脱水剂混合, 又能与石蜡相溶的媒介物质, 这个过程称透明。当前最好的透明剂是二甲苯。很多人认为二甲苯极容易使组织发脆, 这个观点很片面, 在常温下, 如果不是时间过长( 超过２4小时以上) 二甲苯并不会引起组织过份发脆, 相反会使某些组织结构比较质韧的组织: 比如子宫肌瘤等相当好切) , 可是当二甲苯温度超过35℃以后, 极易引起组织发脆。因此本人认为, 大小标本最好分开脱水, 一般情况下, 大标本脱水时间( 室温18℃) 以80％酒精2小时、 95％酒精( 2道) 各1个半小时至2小时、 纯酒精( 3道) 各1个半小时至2小时, 二甲苯( 2道) 各30-60分钟为宜; 小标本脱水时间应相应缩短。脱水时间长短, 与室温高低有密切的相关。我们在实践中发现, 室温在12～15℃时, 可作为一个临界温度范围。当室温高于此温度范围时, 组织容易脱水, 可适当缩短脱水时间; 而室温低于该温度范围时, 应适当延长脱水时间( 如能保证在一个恒定的温度下最佳) 。更换试剂, 应以量为基础, 定量更换, 不能等到切片不好时再去更换。否则, 至少会有2～3批组织切片不好。根据我科经验, 如试剂用量为500ml, 每500个蜡块更换一次为宜。
5. 浸蜡
组织透明后, 在熔化的石蜡内浸渍的过程称为浸蜡。用其它浸透剂( 如火棉胶、 明胶等) 渗入组织内部的过程可称为浸透或透入。浸蜡温度过高( 超过60℃) , 在蜡内加入二甲苯蜡或由于透明时带进的二甲苯过多, 都会导致组织发硬, 还会使组织内的抗原受到破坏; 因此作者主张浸蜡用的石蜡熔点在56℃( 三道) , 第一道: 石蜡30分钟; 第二道: 石蜡90分钟; 第三道: 石蜡, 90分钟。浸蜡温度控制在56～58℃左右。( 第一道也可用硬脂酸石蜡1: 3混合浸蜡, 不但可软化组织, 特别适用于比较韧、 硬的组织, 而且由于硬脂酸是弱酸性的, 对细胞核有媒染作用, 核浆比鲜明, 但容易脱片; 同时对疏松组织容易散片) 。有条件的能够每天打开第一道石蜡的盖子, 让二甲苯挥发。浸蜡所用的石蜡如有杂质尽可能过滤, 以防附在组织上, 造成切片刀刀口受损, 或切片破碎和划痕增多。
6. 包埋
用包埋剂来支持组织的过程称包埋。最常见的是石蜡包埋法。包埋的关键一是平整, 二是方位。要求在包埋时, 应采用镊子轻压组织块拱起部份, 使之平贴于底部, 一般采用组织的最大面包埋。囊壁、 管腔组织应竖直包埋。小块多颗组织, 应尽量放在一起, 并保证在一个平面上。修去两边的余蜡( 所谓的两边, 指切片时与切片刀垂直的两侧) 。包埋时还应注意有无缝线, 纸絮, 如有一定要去除。胃黏膜活检标本, 不能按一般的规律取最大包埋面, 应采取窄面竖起包埋。包埋的蜡更应过滤, 留有杂质的石蜡, 容易造成污染或刀口受损。蜡的熔点应在56～58℃之间选择, 不提倡在冬天使用软蜡。因为用软蜡包埋的蜡块, 到了夏天, 会粘在一起, 不利于资料的保存, 而且即使在冬天, 用硬蜡包埋的蜡块也比用软蜡包埋的蜡块要好切。
7. 磨刀
要想切好一张切片, 首先要有一把锋利的切片刀。磨刀是从事切片技术人员的一项最基本技术, 刀磨的好坏, 直接关系到切片的质量。磨刀的手法各人不同, 但都要求用力均匀, 使刀口和磨刀石全面接触, 两手的用力点应在刀口上, 而不是在刀背上。切片刀应用一次磨一次, 每次仅需10～15分钟, 过长时间的磨刀, 容易把已经磨出的锋刃磨掉, 检查切片刀是否锋利, 用手试摸刀口的方法并不十分科学, 不但不能证明切片刀是否真正锋利, 而且容易损害刀口, 最简单的办法是每次磨好后拿一个蜡块试切一下。每次磨好刀后, 应将磨刀石用盖子盖好, 以防灰尘掉在磨刀石上, 用有灰的磨刀石磨刀, 会使切片刀产生许多细小的缺口。现在很多单位都买了磨刀机, 磨刀机用来开刀锋和磨缺口的确不错, 但由于磨刀的角度和时间不易精确掌握, 故效果并不理想。根据我们的经验, 真正的锋刃很难用机器磨出来。一次性刀片在很大程度上解决了这个问题。如用一次性刀片, 必须及时更换刀口。一个刀口切小标本不应超过20～25只蜡块, 切大标本不应超过10～15只蜡块。
8. 切片
切片的第一步必须粗切。粗切的厚度大约在５0～100微米左右, 质地较硬的组织或较小的组织应再薄一些, 粗切致组织全部暴露后, 才进行细切。细切至组织块表面均匀一致, 无白点后, 再把切的蜡片放入温水中。切片时要求用力均匀、 柔和, 摇速不易过快或过慢。过快会导致切片厚薄不均, 机器磨损; 过慢会使切片增厚。切片厚度一般为3～5微米。切片的要求是完整、 薄、 均匀。切下的片膜其大小形状应与组织块一致, 切片的不完整, 常会将重要病变遗漏, 导致误诊、 漏诊。在切片放蜡块时, 应注意组织包埋的方向, 组织的层次, 纤维、 肌肉等的走向应与切片刀平行, 较难切的部分应放在上面, 如皮肤的表皮, 肿块的包膜, 胃肠道的浆膜等, 这样能够减少组织的断裂现象。操作切片机时应用力均匀, 避免用力过重。对脱钙组织、 骨髓, 以及已知的钙化组织, 应选用固定的刀口, 以减少其它部位出现缺口的可能性。在使用毛笔展片时要防止笔丝进入刀口, 因为每切到一根笔丝, 就会增加一个缺口。切片厚度一般为4～6微米, 有人认为: 只要切片机刻度标着几个微米, 切出来的片子就是几个微米。其实不然, 当切片刀不锋利, 或切片时速度不匀, 或切的较慢时, 切的片子都会变厚, 只有在切片刀十分锋利、 切片匀速的情况下, 才能真正保证其厚度。下面是切片时碰到的问题的原因及可能处理的方法: (1)组织发脆: 一般是脱水、 透明、 浸蜡时间过长、 温度过高, 并与组织本身质地也有关, 在切片时, 边切边用嘴向蜡片吹气, 可能会好些。(2)切片卷起, 可能是刀不锋利, 或刀锋在另一面, 或刀角度过大, 切片太厚等等。(3)蜡片弯曲: 可能是刀锋不均, 切片刀未磨直, 切片刀与蜡块不平行。(4) 透明、 浸蜡时间过长、 温度过高, 并与组织本身质地也有关(5)厚薄不均: 可能是刀、 刀座及蜡块未夹紧, 组织太硬, 或切片机主轴太向前, 或切片机已磨损。(6)切片出现裂痕: 可能是刀有缺口, 石蜡内有杂质, 组织内有钙化、 骨片或有线结, 也可能会有棉纸纤维等。(7)切片不连片, 切不下片, 切片很厚, 或者切片后蜡块发白, 内陷: 组织脱水不佳。补救办法: 可先将蜡块溶解, 取出组织, 放入加热水浴的丙酮内( 80℃) , 30～60分钟, 再进行透明浸蜡包埋切片, 可能会好一点。
9. 展片与捞片
展片水温应在42℃至47℃之间, 这主要和包埋蜡的熔点有关,水温过高, 会引起组织细胞散开, 水温过低, 切片皱摺无法摊平。包埋蜡中如有二甲苯, 也会造成石蜡溶解现象。而用一次性刀片切的片子, 一碰到热水, 片子上的皱摺就无法再展开, 这有二个方法能够解决: 第一、 能够在切片时边切边向蜡片吹气, 这样的片子就会非常平整, 放到热水里就会自然展开, 比较方便快捷, 但这样的片子会略微厚一点; 第二、 在切完片子后, 先把切片放在30%酒精水溶液中, 让酒精的张力自动把皱摺展开, 然后再将切片移到热水, 这样的片子会较薄;如酒精浓度过高, 容易引起切片破碎, 出现裂隙, 像脂肪之类细胞间粘附性较小的组织一碰到酒精就会散开, 故不能用此法。最后捞片时玻片要干净, 要选择那些完整、 无皱摺的切片, 粘贴于玻片中1/3和下1/3的中间。
10. 烤片和脱蜡
烤片, 一般在60℃的温箱内烤片0.5～1小时左右, 温度过高, 会引起切片细胞收缩; 时间太短(少于20分钟), 容易造成脱片。脱蜡也相当重要, 如果脱蜡不干净, 切片不易着色或着色不匀, 因此, 脱蜡用的二甲苯要经常更换, 一般用3道二甲苯, 每500ml液体, 处理500张切片后更换一次为宜。当室温低于18℃时, 必须将切片从温箱拿出后立即放入二甲苯中脱蜡, 或将二甲苯放入温箱内预热( 37℃左右) 脱蜡, 最高不得超过60℃。然后经高浓度的酒精到低浓度的酒精洗去二甲苯, 至水。
11. 染色
苏木素染色时间要根据染料的新旧、 温度、 切片的类型而定, 一般为5－15分钟。经水略洗后, 用盐酸酒精分化, 分化程度必须用显微镜控制。分化水洗后, 可用温水或自来水蓝化, 并充分水洗( 流水冲洗5分钟以上) , 以防盐酸残留导致切片褪色。我们不提倡使用碱性溶液( 释氨水、 肥皂水等) 促蓝, 尽管蓝化效果很好, 但从实践的结果来看, 用碱性溶液促蓝的切片不能长期保存, 容易褪色。最后入伊红复染( 5－20秒) 。HE染色的关键在于深浅适度, 对比鲜明, 一般有经验的, 肉眼就能判断, 但偶而也会出现失误, 因此用显微镜控制是最保险的方法。其关键的步骤在于苏木素染好后的分化及蓝化过程, 在蓝化结束后, 应在显微镜下观察细胞核着色是否合适, 核结构是否清晰, 胞浆内是否有残留的苏木素等等。染色理想的切片在显微镜下应是: 细胞核与细胞浆应蓝红相映, 鲜艳美丽; 核浆对比明显, 核膜及核染色质颗粒清晰可见。
12. 脱水和封片
切片脱水应从低浓度的酒精到高浓度的酒精, 80%酒精1道, 95%酒精2道, 纯酒精2道, ( 正丁醇1道) , 二甲苯2道。浓度低的酒精比浓度高的酒精更容易脱水, 但也容易使伊红退色, 故脱水时间可短一点, 每道3－5分钟, 纯酒精每道10分钟。为增加酒精与二甲苯的相融性, 可在二甲苯前面增加一道正丁醇; 石碳酸－二甲苯液也有此效, 但用石碳酸时如不洗净, 可引起切片退色, 不利于切片久存, 故不作推荐。切片经二甲苯透明后, 用中性树胶封固。为增加切片的透明度, 防止细胞收缩、 龟裂或切片出现黑色结晶样小点。因此我们规定切片必须湿封, 不得用温箱烤干或电吹风吹干后干燥封片。在南方冬春、 霉雨季节, 封片时要防止口鼻呼出的气体接触到切片; 在天气较潮湿的日子里, 不宜一次将多张切片取出待封, 以免切片”还潮”, 形成透明不佳,出现云雾状水珠。脱水剂的更换也应有一定的时间规定。一般是每500ml液体, 处理500张切片后更换一次为宜。封片树胶不能过稀, 封片时树胶要均匀充满盖玻片且树胶不及外溢为佳。要将组织全部覆盖, 也不能有气泡。最后, 粘贴标签, 标签必须贴于玻片左侧, 编号书写清楚, 最好能打印。