chapter3-植物组培快繁和脱毒技术.pdf

植物组织培养和脱毒技术正是实现这一重要前题的快繁技术。它已被广泛用于各种优良品种的迅速繁殖和推广，在花卉、园艺、农林等方面发挥重要作用。良种的快速繁殖和推广应用是实良种的快速繁殖和推广应用是实现农业高效生产的一个重要前题。现农业高效生产的一个重要前题。由植物的一个器官、组织甚至细胞，通过离体培养，获得一个完整的植株。打破有性生殖的限制，极大提高植物的繁殖效率。植物离体快繁（植物离体快繁（MicropropagationMicropropagation）又叫微型繁殖或试管繁殖，它是把植物又叫微型繁殖或试管繁殖，它是把植物材料放在试管内，给予人工培养基和合材料放在试管内，给予人工培养基和合适培养条件，达到高速增殖，属离体无适培养条件，达到高速增殖，属离体无性繁殖。性繁殖。其特点是快速，每年能以千百万倍其特点是快速，每年能以千百万倍的速度繁殖后代，比常规繁殖方法快万的速度繁殖后代，比常规繁殖方法快万倍到数十万倍。倍到数十万倍。第一节第一节 植物的离体快繁植物的离体快繁 良种快繁良种快繁 脱毒良种苗快繁和无病毒苗大量快繁；脱毒良种苗快繁和无病毒苗大量快繁；特殊育种材料快繁；特殊育种材料快繁；制种材料快速繁殖；制种材料快速繁殖；自然和人工诱变有用突变体的快繁；自然和人工诱变有用突变体的快繁；基因工程植株的快繁；基因工程植株的快繁；离体保存种质的快繁；离体保存种质的快繁；濒危植物的离体快繁濒危植物的离体快繁.一一 .离体快繁的应用离体快繁的应用 快速繁殖新品种，迅速推广快速繁殖新品种，迅速推广 周期短（周期短（1-3月）月）不受季节限制不受季节限制 繁殖系数高繁殖系数高 有效保持优良品种的特性有效保持优良品种的特性 离体无性繁殖离体无性繁殖 性状不分离，也不退化性状不分离，也不退化 避免病虫害侵染避免病虫害侵染 是异交作物和无性繁殖品种繁育是异交作物和无性繁殖品种繁育的理想途径的理想途径 生产无病毒种苗，防治品种退化 节约耕地，提高农产品附加值 以变态器官作为以变态器官作为繁殖体的作物年繁殖体的作物年产品用留作种的产品用留作种的比例比例 大蒜大蒜 1/81/8-1/51/5 马铃薯马铃薯 1/101/10 贝母贝母1/31/3 魔芋魔芋1/51/5 便于运输便于运输 种苗体积小，自带容器，便于携种苗体积小，自带容器，便于携带和运输。带和运输。以马铃薯为例，一亩地以马铃薯为例，一亩地40004000株计株计算，常规薯算，常规薯40004000个重个重200kg200kg（50g/50g/个）个）,试管薯只有试管薯只有1kg1kg（100100-200mg/200mg/个）个）二二.离体快繁的一般技术离体快繁的一般技术 150.jpg离体快繁的一般技术离体快繁的一般技术 培养材料选择及消毒培养材料选择及消毒 材料的初代培养材料的初代培养(无菌母株制备无菌母株制备)试管苗的增殖与继代培养（不定芽增殖）试管苗的增殖与继代培养（不定芽增殖）试管苗的生根与移栽（完整植株形成）试管苗的生根与移栽（完整植株形成）再生植株鉴定再生植株鉴定 芦荟的植物组织培养过程芦荟的植物组织培养过程 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 1、培养材料选择及消毒、培养材料选择及消毒 种和品种选择种和品种选择 1）、培养材料的选择）、培养材料的选择 培养部位选择培养部位选择 取材季节选择取材季节选择 器官的生理状态和发育年龄器官的生理状态和发育年龄 材料的大小材料的大小 增殖方式增殖方式 腋芽增殖腋芽增殖 不定芽增殖不定芽增殖 体细胞胚增殖体细胞胚增殖 愈伤组织增殖愈伤组织增殖 腋芽增殖 培养方法简单，能高度保持遗传培养方法简单，能高度保持遗传稳定性，能长期继代增殖。稳定性，能长期继代增殖。一般不需要添加外源激素，即使一般不需要添加外源激素，即使加也要严格控制浓度，防治产生加也要严格控制浓度，防治产生愈伤组织。愈伤组织。不定芽增殖 从现存的芽以外从现存的芽以外的任何器官、组的任何器官、组织上通过器官发织上通过器官发生重新形成芽。生重新形成芽。繁殖系数高繁殖系数高 遗传稳定性较好遗传稳定性较好 继代次数有限继代次数有限 体胚增殖体胚增殖 增长率高，双极性免去生根环节增长率高，双极性免去生根环节 但胚状体休眠的诱导和接触难以但胚状体休眠的诱导和接触难以把握，成苗率不高。把握，成苗率不高。除特殊用途（人工种子），还不除特殊用途（人工种子），还不用于快繁用于快繁 愈伤组织增殖 所有植物通过组培方法均可诱导愈所有植物通过组培方法均可诱导愈伤组织，再进一步分化形成植株。伤组织，再进一步分化形成植株。一切通过其它方式不能成功的植物，一切通过其它方式不能成功的植物，均可通过此途径获得组培苗。均可通过此途径获得组培苗。成功率高，繁殖系数大，但遗传稳成功率高，繁殖系数大，但遗传稳定性差。定性差。对品种遗传稳定性要求高的作物一对品种遗传稳定性要求高的作物一般不采用这一途径。般不采用这一途径。2 2）、培养材料的灭菌）、培养材料的灭菌 A A、常用消毒剂常用消毒剂 对消毒剂的要求是：对消毒剂的要求是：有良好消毒作用有良好消毒作用 易冲洗或自行分解易冲洗或自行分解 不损伤材料，不影响生长不损伤材料，不影响生长 B B、培养材料灭菌、培养材料灭菌 不同材料其带菌情况不一不同材料其带菌情况不一，选择不同的选择不同的消毒剂进行处理消毒剂进行处理。通常先用自来水冲洗通常先用自来水冲洗，有的需用肥皂有的需用肥皂、洗衣粉或吐温等进行洗洗衣粉或吐温等进行洗涤之后在消毒涤之后在消毒，消毒完后用无菌水多次消毒完后用无菌水多次冲洗后方可接种冲洗后方可接种。值得注意的是值得注意的是，常规常规灭菌针对培养材料的外生污染菌灭菌针对培养材料的外生污染菌，对内对内生菌无效生菌无效。内生菌污染问题很难界定并内生菌污染问题很难界定并且很难解决且很难解决。2 2、材料的初代培养、材料的初代培养 1 1）、初代培养物的建立初代培养物的建立 做到：做到：保证无菌保证无菌、条件合适条件合适、技术技术过关和防止污染和外植体的褐变过关和防止污染和外植体的褐变 保证无菌是最基本的前提保证无菌是最基本的前提。选择合适的种类选择合适的种类、品种及培养部位；品种及培养部位；选择合适的培养基选择合适的培养基、激素及其它添加物激素及其它添加物 还要注意掌握适宜的培养条件还要注意掌握适宜的培养条件。2 2）、培养反应的观察与统计）、培养反应的观察与统计 植物离体快繁时，由于植物种类不植物离体快繁时，由于植物种类不同，所采用的外植体类型不同及培养基的同，所采用的外植体类型不同及培养基的化学组成不同，因而器官再生途径有很大化学组成不同，因而器官再生途径有很大的差异。的差异。外植体接种后，可能通过不同的途外植体接种后，可能通过不同的途径实现全能性的实现。有的先形成愈伤组径实现全能性的实现。有的先形成愈伤组织再进行器官分化；有的直接形成胚状体；织再进行器官分化；有的直接形成胚状体；有的先芽后根；有的先根后芽有的先芽后根；有的先根后芽。愈伤组织发生愈伤组织发生 愈伤组织愈伤组织（CallusCallus）组织培养中外植体经脱分化形组织培养中外植体经脱分化形成的一种无组织结构的团块组织成的一种无组织结构的团块组织，由于这种组织以往常见于受创伤的由于这种组织以往常见于受创伤的植物器官和基干表面植物器官和基干表面，故叫愈伤组故叫愈伤组织织（WoundWound CallusCallus）。离体培养时离体培养时，一方面由于材料受一方面由于材料受切伤后分泌的伤源激素作用切伤后分泌的伤源激素作用，另另一方面培养基中添加的外源激素一方面培养基中添加的外源激素的作用的作用，往往在切口处产生愈伤往往在切口处产生愈伤组织组织。生长素生长素,尤其是尤其是2 2，4 4D D对愈伤组织诱导形成中作用显著对愈伤组织诱导形成中作用显著。芽形成芽形成 芽的产生方式有两种：芽的产生方式有两种：从愈伤组织上产生从愈伤组织上产生不定芽不定芽（除现有的芽除现有的芽之外，在任何器官上的通过器官发生重之外，在任何器官上的通过器官发生重新形成的芽新形成的芽 ）；）；从茎尖、侧枝上产生，即腋芽萌发形成从茎尖、侧枝上产生，即腋芽萌发形成丛生芽丛生芽。（由于培养基中添加高细胞分。（由于培养基中添加高细胞分裂素的作用，促进了腋芽的萌发裂素的作用，促进了腋芽的萌发 ）.根形成根形成 根的起源有两种：根的起源有两种：一种是起源于苗基部切口处形成的愈伤一种是起源于苗基部切口处形成的愈伤组织上，由组织上，由愈伤组织内部愈伤组织内部形成；形成；另一种是起源于苗基部切口处愈伤组织另一种是起源于苗基部切口处愈伤组织的上部，直接起源于的上部，直接起源于中柱鞘细胞中柱鞘细胞，由于，由于发生与茎的中柱相连，故利于移栽成活。发生与茎的中柱相连，故利于移栽成活。胚状体形成胚状体形成 概念：概念：离体离体培养下培养下起源起源于非合子细胞，于非合子细胞，经历经历了胚胎发生和胚胎发了胚胎发生和胚胎发育过程所形成的类胚育过程所形成的类胚结构。结构。原球茎形成原球茎形成 3 3、试管苗的增殖与继代培养、试管苗的增殖与继代培养 1 1）、试管繁殖速率及计算试管繁殖速率及计算 理论计算理论计算：接种一个芽或一块增殖的培养物接种一个芽或一块增殖的培养物，经一段时间经一段时间的培养后看能得到多少个芽或苗的培养后看能得到多少个芽或苗，从而推算理从而推算理论上一年能繁殖出多少苗论上一年能繁殖出多少苗。实际计算实际计算：接种一个芽或转接一个苗接种一个芽或转接一个苗，经过一定的实际繁经过一定的实际繁殖周期看实际得到多少个苗或成苗殖周期看实际得到多少个苗或成苗，再换算成再换算成每个周期实际繁殖的数量每个周期实际繁殖的数量。Y Ym mX Xn nmXmXn n Y Y年繁殖数年繁殖数 m m无菌母株苗数无菌母株苗数 X X每个培养周期增殖的倍数每个培养周期增殖的倍数 n n全年增殖次数全年增殖次数 理论计算：月季繁殖速率计算月季繁殖速率计算 每每5 5周转接一次周转接一次（N=N=1010）甲品种每次增殖甲品种每次增殖3 3倍倍，乙品种每次增殖乙品种每次增殖5 5倍倍，丙丙品种品种7 7倍倍。X=X=3 3，5 5，7 7 假定一开始都是假定一开始都是1 1个芽个芽（M=M=1 1）那么三品种一年能增殖苗数：那么三品种一年能增殖苗数：Y Y甲甲1 13 310105.905.9010104 4 （万万）Y Y乙乙1 15 510109.769.7610106 6 （百万百万）Y Y丙丙1 17 710102.822.8210108 8 （亿亿）2 2）、提高繁殖速度的方法）、提高繁殖速度的方法 A A、改进培养基、改进培养基 培养基种类、无机及培养基种类、无机及有机成分、糖浓度、琼脂，特别是有机成分、糖浓度、琼脂，特别是植物植物激素激素都影响试管苗增殖和分化。都影响试管苗增殖和分化。B B、改善培养条件、改善培养条件 252522恒温培养；恒温培养；光对增殖的影响；培养基的光对增殖的影响；培养基的PHPH值一般在值一般在5.65.66.06.0之间；气体条件也影响增殖，之间；气体条件也影响增殖，氧气不足也会影响增殖和生长。氧气不足也会影响增殖和生长。细胞分裂素细胞分裂素可打破顶端优势对腋芽可打破顶端优势对腋芽的抑制作用，组培中常添加细胞分裂素的抑制作用，组培中常添加细胞分裂素促进腋芽的不断分化和生长，逐渐形成促进腋芽的不断分化和生长，逐渐形成芽丛；芽丛；不定芽（除现有的芽之外，在任何不定芽（除现有的芽之外，在任何器官上的通过器官发生重新形成的芽）器官上的通过器官发生重新形成的芽）形成，一般使用形成，一般使用细胞分裂素高于生长素细胞分裂素高于生长素的配比，两者配比接近的配比，两者配比接近1 1的也用得很多；的也用得很多；一般在含丰富一般在含丰富还原氮还原氮的培养基上的培养基上诱导胚状体形成，加生长素，特诱导胚状体形成，加生长素，特别是别是2 2，4 4D D能诱导胚状体发能诱导胚状体发生，然后转移到降低浓度或没有生，然后转移到降低浓度或没有生长素的培养基上使其成熟生长素的培养基上使其成熟 。3 3、继代和增殖中应注意的问题、继代和增殖中应注意的问题 外源激素的积累：外源激素的积累：由于长期反复的继代增殖，外由于长期反复的继代增殖，外源激素大量积累，会导致不正常生源激素大量积累，会导致不正常生长和分化，形成各种畸形芽、畸形长和分化，形成各种畸形芽、畸形茎、透明芽等，影响再生植株的质茎、透明芽等，影响再生植株的质量。量。解决方法：解决方法：继代培养中降低激素的水平继代培养中降低激素的水平。4 4、试管苗的生根与移栽、试管苗的生根与移栽 1 1、生根生根 A A、试管内生根、试管内生根 B B、试管外生根、试管外生根 2 2、移栽移栽 试管苗从试管内移到试管外，试管苗从试管内移到试管外，经历了三个重要的转变：经历了三个重要的转变：由异养变成自养；由异养变成自养；由无菌变为有菌；由无菌变为有菌；由恒温、高湿、弱光向自然变由恒温、高湿、弱光向自然变温、低湿、强光过渡。温、低湿、强光过渡。三、离体快繁的使用范围三、离体快繁的使用范围 用于加速某些难繁殖或繁殖速率很低的植用于加速某些难繁殖或繁殖速率很低的植物，需要加速繁殖的特殊基因型，如名贵物，需要加速繁殖的特殊基因型，如名贵花卉、优质种源、果树芽变分离、工程植花卉、优质种源、果树芽变分离、工程植株等。株等。用于自然繁殖极易感染病毒的植株，如马用于自然繁殖极易感染病毒的植株，如马铃薯、甘蔗、香蕉、石竹、百合等。铃薯、甘蔗、香蕉、石竹、百合等。用于有性繁殖变异范围大而自然条件下又用于有性繁殖变异范围大而自然条件下又不易繁殖的植物，如非洲菊、紫罗兰等。不易繁殖的植物，如非洲菊、紫罗兰等。四、离体快繁中的有关问题四、离体快繁中的有关问题 培养物的增殖方式培养物的增殖方式 外源生长调节物质对品种典外源生长调节物质对品种典型性的影响型性的影响 继代次数与变异继代次数与变异 为什么要脱毒？为什么要脱毒？怎样脱毒？怎样脱毒？怎样鉴定无病毒植株？怎样鉴定无病毒植株？第二节第二节 植物的组培脱毒技术植物的组培脱毒技术 病毒不仅使人患病，同样也侵害植病毒不仅使人患病，同样也侵害植物，使植物出现皱叶、黄叶、落叶，以物，使植物出现皱叶、黄叶、落叶，以致品质变劣、花色变淡、花数减少、产致品质变劣、花色变淡、花数减少、产量降低。量降低。多数农作物，特别是无性繁殖作物，多数农作物，特别是无性繁殖作物，都易受到一种或多种病原菌的周身浸染。都易受到一种或多种病原菌的周身浸染。病原菌的浸染不一定都会造成植物的死病原菌的浸染不一定都会造成植物的死亡，很多病毒甚至可能不表现任何可见亡，很多病毒甚至可能不表现任何可见症状。但在植物中病毒的存在会减少作症状。但在植物中病毒的存在会减少作物的产量和降低作物的品质。物的产量和降低作物的品质。植物病毒多经无性繁殖而传递，有性植物病毒多经无性繁殖而传递，有性繁殖的植物除豆类一部分作物外，种子均繁殖的植物除豆类一部分作物外，种子均不会传递病毒。若使用未受侵染个体的种不会传递病毒。若使用未受侵染个体的种子进行繁殖，就有可能得到无病毒植株。子进行繁殖，就有可能得到无病毒植株。不过有性繁殖后代常表现遗传变异性。不过有性繁殖后代常表现遗传变异性。由于依赖营养繁殖的作物很多，植物由于依赖营养繁殖的作物很多，植物的快速繁殖技术也正是建立在无性繁殖的的快速繁殖技术也正是建立在无性繁殖的基础上，因而脱毒方法就显得尤为重要。基础上，因而脱毒方法就显得尤为重要。1 1、茎尖培养脱毒茎尖培养脱毒 2 2、物理学方法脱毒物理学方法脱毒 3 3、化学疗法脱毒化学疗法脱毒 4 4、其他方法脱毒其他方法脱毒 愈伤组织培养脱毒愈伤组织培养脱毒 珠心胚培养脱毒珠心胚培养脱毒 茎尖微体嫁接（茎尖微体嫁接（MGSTMGST）一、一、快速繁殖中去除病毒的方法快速繁殖中去除病毒的方法 脱毒的方法：脱毒的方法：1.茎尖培养脱毒茎尖培养脱毒 1 1、茎尖培养脱毒茎尖培养脱毒 分生组织能逃避病毒浸染的原因：分生组织能逃避病毒浸染的原因：在植物体内，病毒易于通过维管系统而在植物体内，病毒易于通过维管系统而移动，但在分生组织中不存在移动，但在分生组织中不存在维管系统维管系统。病毒在细胞间的移动只能通过病毒在细胞间的移动只能通过胞间连丝，胞间连丝，但它的速度很慢，赶不上细胞不断分裂但它的速度很慢，赶不上细胞不断分裂的生长速度；的生长速度；在旺盛分裂的分生细胞中在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性，代谢活性很很高，使病毒无法复制；在茎尖中存在高高，使病毒无法复制；在茎尖中存在高水平的水平的生长素生长素，可抑制病毒的增殖。，可抑制病毒的增殖。去病毒去病毒 茎尖大小茎尖大小 成活成活 茎尖长茎尖长(mm)(mm)叶原基叶原基数数 小植株小植株数数 脱毒植株脱毒植株数数 脱毒率脱毒率（）（）0.120.12 1 1 5050 2424 4848 0.270.27 2 2 4242 1818 42.942.9 0.60.6 4 4 6464 0 0 0 0 2 2、物理学方法脱毒、物理学方法脱毒 其原理是将植物组织置于高于其原理是将植物组织置于高于或低于正常温度的环境中或低于正常温度的环境中，使内部使内部的病毒受热的病毒受热（冷冷）以后部分或全部以后部分或全部钝化钝化（而非杀死而非杀死），但寄主植物的但寄主植物的组织很少或不会受到伤害组织很少或不会受到伤害。A A、高温处理、高温处理 又称温热疗法又称温热疗法（thermotherapythermotherapy），有两种处理方法：有两种处理方法：一是一是温汤浸渍处理温汤浸渍处理，适用于休眠器官适用于休眠器官、剪下剪下的接穗或准备种植的材料的接穗或准备种植的材料，在在5050左右的左右的温水中浸渍数分钟至数小时温水中浸渍数分钟至数小时，方法简便易方法简便易行行，但易导致材料受伤但易导致材料受伤。二是二是热风处理热风处理，将生长的盆栽植物移入温热将生长的盆栽植物移入温热治疗室治疗室（箱箱）内内，处理温度和时间因植物处理温度和时间因植物种类和器官的生理状况而异种类和器官的生理状况而异，一般为一般为35354040，短则几十分钟短则几十分钟，长可达数月长可达数月。B B、低温处理、低温处理 又称冷疗法（又称冷疗法（cryotherapycryotherapy）将菊花植株在将菊花植株在55条件下经条件下经4 47.57.5个个月的处理后，切取茎尖进行培养，月的处理后，切取茎尖进行培养，可除去菊花矮化病毒和菊花褪绿斑可除去菊花矮化病毒和菊花褪绿斑驳病毒。驳病毒。3 3、化学疗法脱毒、化学疗法脱毒 采用许多化学药品包括嘌呤和嘧啶类采用许多化学药品包括嘌呤和嘧啶类似物似物、氨基酸氨基酸、抗生素处理抗生素处理，可在某种程可在某种程度上抑制植物体内或离体叶片内病毒的合度上抑制植物体内或离体叶片内病毒的合成成，但不能完全抑制病毒使之失活或不活但不能完全抑制病毒使之失活或不活化化。三氮唑核苷三氮唑核苷（鸟嘌呤类似物鸟嘌呤类似物）、2 2硫硫尿嘧啶尿嘧啶、放线菌酮和放线菌素放线菌酮和放线菌素D D等也常有等也常有应用应用。4 4、其他方法脱毒、其他方法脱毒 愈伤组织培养脱愈伤组织培养脱毒毒 珠心胚培养脱毒珠心胚培养脱毒 茎尖微体嫁接茎尖微体嫁接（MGSTMGST）每一茎尖或愈伤组织分化产生的植株每一茎尖或愈伤组织分化产生的植株，在作为母本生产无病毒原种以前在作为母本生产无病毒原种以前，必须对特必须对特定病毒进行鉴定定病毒进行鉴定。由于许多病毒具有延迟的恢复期由于许多病毒具有延迟的恢复期，所以所以在最初在最初1818个月中每隔一定时间仍须进行鉴定个月中每隔一定时间仍须进行鉴定，只有显示持续阴性反应的无病毒植株只有显示持续阴性反应的无病毒植株，才能才能供生产上应用供生产上应用。无病毒植株易被再感染无病毒植株易被再感染，因此在繁殖的因此在繁殖的不同阶段仍需重复进行鉴定不同阶段仍需重复进行鉴定。二、无（特定）病毒植株的鉴定二、无（特定）病毒植株的鉴定 鉴定方法鉴定方法 1 1、直观测定法、直观测定法 2 2、指示植物法、指示植物法 利用病毒在其他植物上利用病毒在其他植物上出现症状的特征出现症状的特征，作为作为鉴别病毒种类的标准鉴别病毒种类的标准，这种专门用以生产症状这种专门用以生产症状的寄主植物即为的寄主植物即为指示植指示植物物，又称鉴别寄主又称鉴别寄主。3 3、抗血清鉴定法、抗血清鉴定法 4 4、酶联免疫吸附法（、酶联免疫吸附法（ELISAELISA）5 5、电子显微镜检查法、电子显微镜检查法 6 6、免疫吸附电镜法、免疫吸附电镜法