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中山大学博士后学位论文
多糖衍生物用于蛋白质复性及天然胶乳改性的研究
姓名: 陈继平
申请学位级别: 博士后
专业: 高分子化学与物理
指导教师: 张黎明
摘要环糊精和温敏聚合物聚Ⅲ．异丙基丙烯酰胺) ( ＰＮＩＰＡ) 对蛋白质的复性均有良好的促进作用, 那么经ＰＮＩＰＡ改性后的环糊精衍生物能否更有效促进变性蛋白质的复性呢? 为此, 我们将氨基．１３．环糊精( ＥＤＡ．１３一ＣＤ) 和带末端羧基的聚Ｎ一异丙基丙烯酰胺( ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ) 偶联得到了一种温敏Ｂ一环糊精衍生物( １３．ＣＤ．ＰＮｍＡ) , 分别考察其在不同变性体系、 不同１３－ＣＤ。ＰＮＩＰＡ浓度、 不同复性温度以及在表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵( ＣＴＡＢ) 存在下对溶菌酶的复性效果; 经过与ＥＤＡ．１３．ＣＤ和ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ的对比分析, 揭示了１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ分子中的环糊精空腔与ＰＮＩＰＡ链段的协同作用, 并使用荧光光谱法进行了验证。实验结果表明: ｐ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ对盐酸胍变性溶菌酶的复性具有抑制作用, 但对尿素变性溶菌酶的复性具有促进作用; 在常温下, ０．４ｍｇ／ｍＬ的ＩＢ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ可使ｌｍｇ／ｍＬ溶菌酶的复性率增加至８３．７％, 而直接稀释法仅为５５．８％; １３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性温度应略小于１３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的相转变温度( ＬＣＳＴ, ３３．６。Ｃ) , 高于这一温度时会由于ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ发生相变而导致溶菌酶的复性率急剧降低; 将１３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ在ＣＴＡＢ辅助溶菌酶复性一段时间( 如１２ｈ) 后再加入到复性体系, 溶菌酶的复性效果更佳。在辅助溶菌酶复性的过程中, １３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ分子中的环糊精空腔与ＰＮＩＰＡ链段能够同时促进溶菌酶的复性, 荧光光谱实验结果证实了这～结论。针对天然乳胶( ＮＲＬ) ＩｔｉｌＪ品蛋白质过敏及乳胶制品的生物降解问题, 考察了海藻酸钠、 透明质酸及羧甲基纤维素的氧化产物氧化海藻酸钠( ＯＳＡ) 、 氧化透明质酸( ＯＨＡ) 和氧化羧甲基纤维素( ＯＣＭＣ) 对天然胶乳中的蛋白质的固定作用, 对比了这三种氧化多糖对乳胶蛋白质的固定效果, 分析了加入氧化多糖后蛋白质在乳胶膜中的分布情况, 讨论了氧化多糖含量以及氧化多糖分子中的醛基含量对乳胶膜的力学性能、 热降解及生物降解过程的影响。实验结果显示, 三种氧化多糖对天然乳胶中蛋白质都具有很好的固定作用; 以ＯＳＡ为研究对象表明, 乳胶膜中ＯＳＡ含量越多, 乳胶膜中水溶性蛋白质( ＷＳＰ) 析出率越低, 当ＯＳＡ占干乳胶的１．６７ｗｔ％时, 乳胶膜ＷＳＰ的溶出率即趋近于０; ＯＳＡ中醛基含量越多, ＷＳＰ溶出率越低, 当ＯＳＡ醛基含量为４．８ｍｍｏｌ／ｇ时, 仅用０．３３ｗｔ％( 以固含量计) 的ＯＳＡｔｉＰ可使乳胶膜中形孓晰出率低于５０｝ｌ眈。未加ＯＳＡ的乳胶膜在土埋２５天后的质量损失率为５叭％左右, 之后质量不再发生明显改变; 而含有ＯＳＡ的乳胶膜在土埋２５天后质量继续下降, 其质量损失率超过乳胶中非橡胶成份所占的百分率, 且ＯＳＡ用量越大, 乳胶膜的质量损失率越大。同时, 氧化多糖对乳胶膜的力学性能无明显的影响。关键词: ｐ一环糊精, 聚( Ｎ一异丙基丙烯酰胺) , 溶菌酶, 复性, 天然胶乳, 多糖衍生物, 蛋白质固定, 降解
第一章温敏ｐ．环糊精衍生物用于蛋白质复性的研究
１．１引言
由于环糊精分子中含有疏水性空腔, 客体分子能从宽口端进入其分子空腔形成包络化合物。因此在使用表面活性剂辅助蛋白质复性时, 常常需要加入环糊精以剥离与蛋白质形成胶束的表面活性剂或去污剂【１‘３１。Ｋａｎｌｐｐｉａｈ等人【４１发现, 向盐酸胍变性的碳酸脱水酶( ＣＡＢ) 复性稀释液中加入适量ｐ一环糊精( Ｄ．ＣＤ) 可使其复性率超过９０％。她们认为这是由于环糊精的疏水性空腔与蛋白质复性中间体的疏水性位点发生了相互作用。聚烈．异丙基丙烯酰胺) ( ＰＮＩＰＡ) 是一种具有温度敏感性的聚合物, 在一定温度下能发生亲水／疏水( ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｅ—ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ) ｎ－Ｉ逆转变, 在水溶液中表现为一种可逆的溶解／沉淀行为【５１( 在凝胶中则表现为一种可逆的溶胀／收缩行为【６】) 。发生这一转变时的温度即为相转变温度( Ｌｏｗｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｓｏｌｕｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ, ＬＣＳＴ) , 而ＰＮＩＰＡ水溶液的ＬＣＳＴ在３２℃附近〔７, ８Ｊ。ＰＮＩＰＡ曾被用于蛋白质的复性研究【９－１¨。如Ｌｉｎ等人【１０ｌ将ＰＮＩＰＡ用于辅助ｐ．１ａｃｔａｍａｓｅ的复性, 发现其复性效率比ＰＥＧ更高, 使用ＰＮＩＰＡ可使经盐酸胍变性的１３一ｌａｃｔａｍａｓｅ的活性率提高４ｌ％, 而ＰＥＧ只能提高２６％。Ｌｕ等人【１１】曾采用ＳＤＳ－－ＰＡＧＥ, 圆二色谱和荧光光谱等方法研究了ＰＮＩＰＡ对尿素变性溶菌酶的复性机理, 认为ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性作用是因为ＰＮＩＰＡ增强了蛋白质的二级结构并抑制了溶菌酶的聚集作用, 从而促进蛋白质的复性。将６．ＣＤ与ＰＮＩＰＡ耦联, 制备具有温度敏感的１３一环糊精衍生物( １３一ＣＤ．ＰＮＩＰＡ) 主要被用于药物释放系统的研究‘协１６１。虽然Ｌｕ等人四曾将该体系用于溶菌酶的复性, 但偶联产物中的Ｂ．ＣＤ结构单元主要用于剥离表面活性剂ＣＴＡＢ, 而未考察其对溶菌酶的复性作用。结合Ｋａｒｕｐｐｉａｈ等人１４】的研究, 我们认为, ｐ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ用于辅助蛋白质复性时, 其分子中ＰＮＩＰＡ链段及环糊精的疏水性空腔应当能够同时促进溶菌酶的复性, 即具有协同辅助蛋白质复性的作用。为验证这一假设, 本研究采用端基耦联的方法, 合成了具有温度敏感的Ｂ—ＣＤ衍生物( １３．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ) , 比较研究了ｐ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ及其合成中间产物: 氨基一ｐ一环糊精( ＥＤＡ—ｐ—ＣＤ) 、 带末端羧基的聚( Ｎ一异丙基丙烯酰胺) ( ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ) 对尿素变性溶菌酶的复性效果, 并采用荧光光谱分析了ＩＢ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性机理; 同时探讨Ｔ’ＩＢ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ与十二烷基三甲基溴化铵( ＣＴＡＢ) 结合使用时对溶菌酶复性的协同作用。
１．２实验部分
１．２．１原料与试剂
Ｎ．异丙基丙烯酰胺( ＮＩＰＡ, Ａｃｒｏｓ公司, 美国) , 正己烷重结晶; 巯基丙酸( ＭＰＡ, Ａｃｒｏｓ公司, 美国) ; １．( ３一二甲氨基丙基) 一３．乙基．碳二亚胺( ＥＤＣ, Ａｃｒｏｓ公司, 美国) ; 偶氮二异丁腈( ＡＩＢＮ, 上海试四赫维化工有限公司) , 甲醇重结晶纯化; ｐ一环糊精( 上海伯奥生物科技有限公司) , 使用前于１１０℃干燥１２ｈ; 对甲苯磺酰氯( 中国医药集团上海化学试剂公司) ; 溶菌酶、 盐酸胍、 二硫苏糖醇( Ｄ订) 、 还原型谷胱甘肽( ＧＳＨ) 、 氧化型谷胱甘肽( ＧＳＳＨ) 和微球菌均购自美国Ｓｉｇｍａ公司。十六烷基三甲基溴化铵( ＣＴＡＢ) 购自日本Ｗａｋｏ公司; 其余试剂均为分析纯。透析袋( Ｍｗ３５００, 华美生物工程公司上海分公司) 。样品溶液用去离子水配制。
１．２．２ＥＤＡ－ｐ．ＣＤ的制备与表征
ｇＩＢ－ＣＤ和１．３９参, 照Ｎｏｚａｋｉ等人ｆ１３１的方法, 在１００ｎ儿无水吡啶中依次加入１０对甲苯磺酰氯, 于２５℃、 搅拌条件下反应２ｈ。在４０℃减压蒸馏出吡啶后, 向反应混合物中加入２０ｍＬ水。过滤, 水洗３次除去吡啶, 真空干燥得到白色粉末。将２ｇ上述制备的白色粉末与２０ｍＬ无水乙二胺在４０℃反应４８ｈ。在减压蒸馏出无水二乙胺后, 向油状物中加入３０ｍＬ丙酮。过滤, 将沉淀溶于２０ｍＬ甲醇．水溶液( 体积比３: １) 。往所得溶液中加入２００ｍＬ丙酮, 得白色沉淀。过滤, 真空干燥。产品为白色粉末。用核磁和红外光谱进行表征。
１。２．３ＰＮＩＰＡ－ＣＯＯＨ的制备与表征ｇ参照Ｎｏｚａｋｉ等人ｐ３〕的方法, 将５ＮＩＰＡ和２３．４ｍｇ链转移剂ＭＰＡ溶解于２６０ｍＬ甲醇中。通氮气２０ｍｉｎ, 加入５０．７ｍｇ引发剂ＡＩＢＮ, 在氮气保护下, 于７０”Ｃ、 搅拌条件下反应７ｈ。减压蒸馏出大部分甲醇, 用丙酮／正己烷体系纯化两次。将所得沉淀过滤并真空干燥。产品为白色粉末。用核磁和红外光谱进行表征。
１．２．４ｐＣＤ．ＰＮＩＰＡ的制备与表征ｇ参照Ｎｏｚａｋｉ等人〔１３１的方法, 将２ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ溶解于２０ｍＬ蒸馏水中, ｇ加入４３５ｍｇＥＤＣ。调整溶液ｐＨ值为５．５, 加入２ＥＤＡ－Ｄ—ＣＤ, 在室温下搅拌反应２４ｈ。所得溶液装入到透析袋( Ｍｗ３５００) , 用水透析２４ｈ以除去未反应的１３－ＣＤ与小分子物质。溶液冷冻干燥得到一种淡黄色粉末。将所得的淡黄色粉末分散在ＴＨＦ中, 用ＴＨＦ－ｎ．ｈｅｘａｎｅ( 体积比２: １) 沉淀, 真空干燥。所得产品为黄色粉末。用核磁和红外光谱进行表征。
１．２．５溶菌酶的变性参照Ｄｅｓａｉ等人【１８】的方法, 将一定量的溶菌酶分别溶于盐酸胍变性缓冲液和尿素变性缓冲液( 盐酸胍变性缓冲液: ３０ｍ０１．Ｌ－１Ｏ．１ｍｍｏｌ?Ｌ．１ＤＴＴ、 ６ｍｏｌ?Ｌ．１盐酸胍和０．１Ｔｒｉｓ一硫酸, ｐＨ值８．５; 尿素变性缓冲液: ３０ｍｍ０１．Ｌ－１ＤＴＴ、 ８ｍｏｌ?Ｌ－１尿素、 ｍｏｌ?Ｌ－１”Ｉｒｉｓ—ＨＣＩ, ｐＨ值８．６和１ｍｍｏｌ?Ｌ－１ＥＤＴＡ) 置于３７。Ｃ下反应３ｈ, 使溶菌酶彻底变性和还原, 得到浓度为３０ｍｇ?ｍｌ。的变性溶菌酶溶液, 放置于４。Ｃ冰箱中保存备用。
１．２．６溶菌酶复性将１００ｌｘＬ浓度为１２ｍｇ／ｍＬ的ＥＤＡ一１３．ＣＤ、 ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ或ＩＢ－ＣＤ－ＰＮＩＰＡ溶液分别缓慢加入到１００ＩｘＬ浓度为３０ｍｇ／ｍＬ的溶菌酶中, 复性３０ｍｉｎ后, 加入复性缓冲液至溶液总体积为３ｍＬ, 在室温下( ３ｌ℃) 继续复性２４ｈ。不含任何辅助剂时溶菌酶的复性为空白样。复性缓冲液为ｐＨ为８．２的Ｏ．１ＥＤＴＡ、 ｌｍｍｏｌ／Ｌｍｏｌ／Ｌ晡ｓ．ＨＣＩ溶液, 该溶液还含有ｌｍｍｏｌ／ＬＧＳＳＧ和１０ｍｍｏＩ．Ｌ－１ＧＳＨ。
１．２．７ｐ－ＣＯ—ＰＮＩＰＡ浓度对溶菌酶复性的影响ｐＬ、 １００将１０ｌａＬ和１ｍＬ浓度为１２ｍｇ／ｍＬｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ溶液分别缓慢加入到１００ｇＬ浓度为３０ｍｇ／ｍＬ的盐酸胍变性溶菌酶和尿素变性溶菌酶溶液中。复性３３０２４ｍｉｎ后, 加入复性缓冲液至溶液总体积为３ｍＬ, 在室温下( ３１℃) 继续复性ｈ。不含任何辅助剂时溶菌酶的复性为空白样。
１．２．８复性温度对溶菌酶复性的影响将１００｝ｌＬ浓度为１２ｍｇ／ｍＬ雕ＣＤ．ＰＮＩＰＡ溶液缓慢加入到１００ｐＬ浓度为３０ｍｇ／ｍＬ的尿素变性溶菌酶溶液中, 然后将溶液在某一个特定温度条件下( ２５℃、 ２８”Ｃ、 ３０”Ｃ、 ３２”Ｃ、 ３３。Ｃ或３４”Ｃ) 复性３０ｍｉｎ后, 加入复性缓冲液溶液总体积为３ｍＬ, 继续复性２４ｈ。
１．２．９表面活性剂ＣＴＡＢ对溶菌酶复性的影响将１００ＩｌＬ浓度为１２ｒａｇ／ｍＥ的１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ溶液和１００ｌｘＬＯ．０２ｍｌＶｌＣＴＡＢ溶液按照以下方式加入到１００ｌｘＬ浓度为３０ｒａｇ／ｍＥ的尿素变性溶菌酶溶液中: ａ) 仅加入ＣＴＡＢ溶液; ｂ) 〔３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ溶液和ＣＴＡＢ溶液同时加入; ｃ) 在加入ＣＴＡＢ溶液１２ｈ后再加入ｐ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ溶液。将这些溶液在室温( ３１℃) 下放置２４ｈ。以不含任何辅助剂时溶菌酶的复性为空白样。
１．２．１０相转变温度( ＬＣＳＴ) 的测定经过测定浓度为ｌｒａｇ／ｍＥ的ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ和〔Ｂ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ溶液在５００ｎｎｌ的吸亮度值确定聚合物的相转变曲线。所用仪器为ＴＵ一１８００ＳＰＣＵＶ分光亮度计( 中国, 北京) 。吸亮度一浓度曲线拐点的横坐标值即为该聚合物的ＬＣＳＴ平均值。
１．２．１１溶菌酶活性的测定依据Ｊｏｌｌｅｙｔｌ９１提出的以微球菌为底物的方法测定溶菌酶的活性。将微球菌溶于ｐＨ为６．２４的０．１ＭＮａ２ＨＰ０４一ＮａＨ２Ｐ０４缓冲液中, 使该溶液在４５０ｎｌｎ的吸亮度为１．３０。将０．５ｍＬ溶菌酶溶液加入到２．５ｍＬ底物溶液中, 于２５℃混合３０ｓ, 每隔５ｓ测定一次所得悬浮液在４５０ｎｎｌ的吸亮度, 共测定１３次。所得吸亮度与时间的关系曲线为一直线。将该直线的斜率与同浓度的未变性溶菌酶溶液所得的直线进行对比, 即可得到溶菌酶的复性率, 结果用百分比表示【２０１。
１．２．１２荧光光谱分析用Ｏ．０５ＭＰＢＳ缓冲液配制浓度分别为５０ｒａｇ／ｍＥ、 ２０ｍｇ／ｍＬ、 １０ｒａｇ／ｍＥ、 ５ｍｇ／ｍＬ汞〕１ｍｇ／ｍＬＩ拘ＥＤＡ．ＣＤ、 ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨＪ阿Ｉ〔Ｂ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ溶液, 用黼表示。４另用０．０５ＭＰＢＳ缓冲液配制浓度为Ｏ．０５｜ｌｍｇ／ｍＬ溶菌酶溶液, 用拗表示。将５００Ｌ黼和２ｍＬ黼混合, 所得溶液用ＲＦ一５３０１ＰＣ荧光分光计( 日本) 扫描。设置激发和发射间距为１０ｎｌｌｌ。在２８０ａｍ激发蛋白质溶液, 记录３００”－－－’４５０ｎｍ范围内溶液的发射光谱。
１．３结果与讨论
１．３．１核磁和红外表征( ｔ｝－ＣＤ) ｆｒｏｓｙｌ－Ｂ－ＣＤ) ( ＥＤＡ—Ｉ? , －ＣＤ) ( Ｉ孓－ＣＤ－ＰＮＩＰＡ) 图１．１１３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的合成路线一。一Ⅻ１３６０、 ．铺。厂、 』一Ｉｒ人让小１０５０ｃｖ０８‰懈洲黜图１．２ＥＤＡ．１３．ＣＤ、 ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ和Ｄ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的红外谱图ａＩｊｂ—, Ｕ．…６ＩＯ＿Ｏ咚Ｊ”－ＮＨｌ入二上几Ｌ…ｂ＼．．Ｌ叫汹、 Ｊ－八４３２一．—√、 ．, ／、 、 ～, ＼一Ｊ＼ｃ, ‖晦、 人人≥; 人１６５４３２０ｐｐｍ( ｆ１) 图１．３ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ、 ＥＤＡ—ｐ—ＣＤ和１３一ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的核磁谱图〔Ｂ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的合成路线如图１．１所示。首先Ｂ－ＣＤ糖坏上的羟基氢被磺酰基取代, 然后磺酰基被乙二胺的氨基取代生成氨基化的环糊精, 最后在水溶液中, 氨基环糊精与带末端羧基的ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ经ＥＤＣ催化缩水偶合得到ＩＢ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ。ＥＤＡ．ｐ—ＣＤ、 带末端羧基的ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ以及最终产物１３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的红外光谱图分别如图１．２ａ、 图１．２ｂ和图１．２ｃ所示。在ＩＢ－ＣＤ—ＰＮ口Ａ红外谱图( 图１．２ｃ) 中, ～１０４３锄－１( ｓ, Ｃ．ＯＨ) 峰对应为１３－ＣＤ上的羟基伸缩振动峰。～１６３７ＣＩＩｌ－１和～１５４４锄＿１峰对应为酰胺Ｉ和酰胺ＩＩ的吸收( 来自ＰＮＩＰＡ结构单元) 。～３３００伽．１～３５００ｃｍ＿是一个很强很宽的谱带, 对应为Ｎ．Ｈ、 ｏ．Ｈ( 包括醇羟基与羧羟基) 的总吸收。ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ、 ＥＤＡ一８一ＣＤ以及ＩＢ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的核磁谱图分别如图１．３ａ、 图１．３ｂ和图１．３ｃ所示。在这三种结构中, 各氢的化学位移分别为, 科．９( ７Ｈ, Ｃ( １Ｗ) ３．３( ５Ｈ, 一ＣＨ２ＣＯ—ＥＤＡ－Ｂ—ＣＤ) , ２．５( ＩＯＨ, ?ＣＨ２Ｓ－) , １．９６( ３７Ｈ, ＣＨＣＯＮＨ一) , １．４３( ７０Ｈ, 一ＣＨＣＨ２ＣＨ一) ’１．０３( ７Ｈ, ．ＣＨ３) 。由图３ｃ看出, １３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ既存在ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ的特征峰, 也存在ＥＤＡ—Ｂ—ＣＤ的特征峰。６经过ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ、 ＥＤＡ—ｐ—ＣＤ以及ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ红外及核磁谱图的对比, 证明ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ的末端羧基已成功与ＥＤＡ—ｐ．ｃＤ的氨基发生酰胺化反应。
１．３．２ＰＮＩＰＡ－ＣＯＯＨ和弘ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的温敏性质
浓度为０．１ｍｇ／ｍＬ的ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ和ｐ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ水溶液在５００ｎｍ处的吸亮度随温度的变化如图１．４所示。随着溶液温度的升高, ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ和ＩＢ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ水溶液的吸亮度分别在溶液温度在３２．４℃或３３．６”０时急剧升高。根据前述对ＬＣＳＴ的定义, 此温度即对应为ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ和ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的ＬＣＳＴ。ＰＮＩＰＡ在其ＬＣＳＴ附近会发生可逆的亲水／疏水转变, 当溶液温度低于ＬＣＳＴ时ＰＮＩＰＡ表现为亲水性, ＰＮＩＰＡ依靠氢键作用与水互溶: 当溶液温度高于ＬＣＳＴ时, ＰＮＩＰＡ由亲水性转为疏水性, 与水脱离并发生聚集, 从而导致溶液的吸亮度增大。图１．４ｃ显示, ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ的ＬＣＳＴ为３２．４”Ｃ, 与文献报道接近【７’８】。ＰＮＩＰＡ与亲水性基团结合以后会导致其ＬＣＳＴ升耐２１１, 而氨基改性Ｂ．ＣＤ表现为亲水性, 因此Ｂ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的ＬＣＳＴ略高于ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ, 为３３．６”Ｃ。３．０２．５∞ＵＣ２．０至１．５Ｌｏ兰１．０《０．５Ｏ．Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｉ。Ｃ图１．４ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ和ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的相转变曲线７
１．３．３肛ＣＤ－－ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性效果
将不同浓度的Ｂ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ分别用于盐酸胍变性溶菌酶和尿素变性溶菌酶的复性, 其活性收率如表１．１所示。从表１．１看出, 随着复性体系中Ｂ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ浓度的增大, 盐酸胍变性溶菌酶的活性率逐渐减小, 从５５．８％( 直接稀释法复性) 减／Ｊ, 至ｌＪ３４．４％( ｔ３．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ浓度为０．８ｍｇ／ｍＬ) ; 而尿素变性溶菌酶复性的活性率则逐渐增大, 从５５．８％( 直接稀释法复性) 增至８３．７％( １３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ浓度为０．４ｍｇ／ｍＬ) 。即在盐酸胍变性溶菌酶的复性体系中, 〔３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ不但不能促进溶菌酶的复性, 反而对其复性有抑制作用。而与此相反的是, 对于尿素变性溶菌酶的复性体系, １３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性具有较好的促进作用。导致这一实验现象的原因有待进一步研究, 在后续实验中, 为了验证Ｂ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性作用, 我们以尿素变性溶菌酶作为研究对象。表１．１不同浓度的ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ对不同变性体系变性溶菌酶的复性
１．３．４ＥＤＡ．争ＣＤ、 ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ或ＩＶＣＤ．ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性效果在３ｌ℃, 变性溶菌酶( 尿素变性溶菌酶, 以下同) 最终浓度为ｌｍｇ／ｍＬ时, 将０．４ｍｇ／ｍＬ的ＥＤＡ．Ｂ—ＣＤ、 ＰＮＩＰＡ－ＣＯＯＨ和〔ｊ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ溶液分别用于辅助溶菌酶复性, 其复性效果如图１．５所示。使用ＥＤＡ．Ｂ．ＣＤ辅助溶菌酶复性时, 溶菌酶的活性率为７１％, 使用ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ辅助溶菌酶复性时, 其活性率为７２．２％, 而使用１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ辅助溶菌酶复性时, 其活性率为８３．７％。三者均高于直接稀释法复性所得的活性率。这说明ＥＤＡ．ｐ—ＣＤ、 ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ和１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ对尿素变性溶菌酶的复性均有促进作用, 而〔３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的促进作用最大。作为一种蛋白质的复性辅助剂, 环糊精不但能够抑制蛋白质的聚集作用, 同时还能有效地促进蛋白质折叠复性至其天然状态以恢复其活性瞄粕１。伸展的或部分折叠的中间体疏水性表面与环糊精疏水性空腔之间的相互作用降低了分子间８的疏水作用力, 从而有效地消除或抑制了蛋白质的聚集作用ｆ２３Ｊ。而ＰＮＩＰＡ则经过其疏水性链段与蛋白质复性中间体氨基酸的疏水性侧链之间的疏水作用促进蛋白质的复性【１０１。显然, 在本实验中, 〔３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ分子中环糊精空腔和ＰＮ口Ａ一乍旷引乍｜｜Ｉ疏水性链段的同时对溶菌酶的复性起到了辅助作用。即Ｊ３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ分子中的Ｉ匿－ＣＤ疏水性空腔和ＰＮＩＰＡ疏水性链段对溶菌酶的复性具有协同作用。／／／／／ｌ”／／Ｚ／; ｝ｚ嚣ｌｌ象器貉瑟簟．鼍? 绻爹蓉?誓瞄: §Ｌ。－矗矗。赞黟一蘑琵一ｌ筑参雠。Ｕ７罗．／
１．３．５争ＣＤ．ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性机理溶菌酶分子中含有能发出内源荧光的色氨酸及酪氨酸。当蛋白质与物质发生物理碰撞或化学结合以后, 蛋白质的荧光会发生一定的变化, 这一规律常被用于研究蛋白质与物质之间的相互作用机理ｌ硎。图１．６是在变性溶菌酶溶液中加入一定量的ＥＤＡ—ｐｃＤ、 ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ或〔３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ后溶液的荧光光谱图。由图看出, 溶菌酶溶液的荧光光谱曲线的形状未发生明显变化, 可是荧光强度存在一定差异: 加入含有Ｂ—ＣＤ结构单元的ＥＤＡ．Ｂ．ＣＤ和ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ时, 随着辅助剂浓度的增加, 溶液的荧光强度逐渐降低, 且在辅助剂浓度相同时, 加ＡＥＤＡ—Ｂ—ＣＤ后荧光强度降低幅度比Ｂ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ降低幅度更大( 图１．６( ａ, ｃ) ; 而对于不含１３．ＣＤ结构单元的ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ, 即使辅助剂的浓度高达５０ｍｇ／ｍＬ时溶液荧光强度的变化仍不明显( 图１．６( ｂ) ) 。这表明９对于溶菌酶而言, ＥＤＡ．ＣＤ和ＩＢ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ是良好的焯灭剂, 而ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ不具有荧光ｊ卒灭作用。ｃ, ) Ｃ３０＃０Ｌ９０６０３０Ｏａ) Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ图１．６不同浓度的ＥＤＡ—ｐ．ＣＤ、 ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ或ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ加入变性溶菌酶溶液后的荧光光谱图。ａ’ＥＤＡ．ＩＢ－ＣＤ; ｂ, ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ; ｃ, ｐ—ｃＤ—ＰＮＩＰＡ。ＥＤＡ—ｐ—ＣＤ, ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ和ｐ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的浓度分别为①＝Ｏ; ②＝ｌｍｇ／ｍＬ; ③＝５ｍｇ／ｍＬ; ④＝ｌＯｍｇ／ｍＬ; ⑤－２０ｍｇ／ｍＬ; ⑥＝５０ｍｇ／ｍＬ; 如果溶菌酶被包络在ＥＤＡ．ｐ．ＣＤ或ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的ｐ—ＣＤ的疏水性空腔中, 那么由酪氨酸和色氨酸产生的天然荧光就可能被屏蔽, 从而导致溶菌酶荧光强度降低。特别地, 当ＥＤＡ—ｐ—ＣＤ浓度为５０ｍｇ／ｍＬ时, 溶菌酶的荧光强度已接近于０, 表明溶菌酶分子基本上都被包络进１３．ＣＤ的疏水性空腔中。相对于相同浓度的ＥＤＡ．ｐ．ｃＤ而言, 由于ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ中ＰＮＩＰＡ链段的空间位阻效应以及相对较低的１０１３－ＣＤ浓度, 〔Ｂ－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ能够包络溶菌酶的数量相对少: Ｊ: ＥＤＡ—ｐ—ＣＤ, 因此其荧光强度的减弱程度略小于ＥＤＡ．ｐ—ＣＤ。复性体系的荧光光谱法实验证明了ＩＢ－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ分子中ｐ．ＣＤ结构单元对溶菌酶分子的包络作用。１．３．６不同温度时溶菌酶的复性不同温度下０．４ｍｇ／ｍＬ的Ｄ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性效果如图１．７所示。从图中看出, 随着温度的升高, 溶菌酶的活性率逐渐增大。当温度达到３２℃时, 溶菌酶的活性率最大。但继续升高温度, 溶菌酶的活性率反而降低。结合〔Ｂ－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的相转变温度( 见图１．４) , 发现溶菌酶的活性率最大时的温度与ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的相转变温度接近。这是因为, 当温度达到ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的相转变温度时, １３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ会由亲水性转变为疏水性而发生聚集, 从而导致溶菌酶的活性率急剧下降。因此, 在将ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ用于辅助溶菌酶复性时, 复性温度应低于Ｂ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的ＬＣＳＴ。９０邑８０勺７０６０５０４Ｏ３Ｏ２ＯＩ名?一ｈ１《∞矗州口一ｏｑ。篮１ＯＯ二《ｉ鬻隧～艮甏簪: 引‰妇ｊ, ．ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ( ℃) Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ图１．７不同温度下Ｂ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ辅助溶菌酶复性的复性率( 溶菌酶最终浓度为ｌｒａｇ／ｍＥ, １３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的浓度为Ｏ．４ｍｇ／ｍＬ)
１．３．７ｐ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ和ＣＴＡＢ联合辅助溶菌酶复性将１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ和ＣＴＡＢ按三种不同的添加方式: ( １) 仅加入ＣＴＡＢ; ( ２) １３一ＣＤ．ＰＮＩＰＡ和ＣＴＡＢ同时加入; ( ３) 加入ＣＴＡＢ, 复性１２ｈ后再加入ｐ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ, 继续复性１２ｈ。溶菌酶的复性率如图１．８所示。从图１．８看出, 〔３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ与ＣＴＡＢ同时加入到变性溶菌酶中进行复性时, 溶菌酶的复性率低于单独使用ＣＴＡＢ或Ｂ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ, 而在ＣＴＡＢ复性１２ｈ后再加入ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ, 溶菌酶的复性率高于单独使用ＣＴＡＢ或ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ。将１３一ＣＤ—ＰＮＩＰＡ与ＣＴＡＢ同时用于辅助溶菌酶复性时, ＣＴＡＢ的疏水链段与溶菌酶分子竞争进入环糊精的疏水空腔, 但由于ＣＴＡＢ的疏水链段的疏水性强于溶菌酶分子, 因此ＣＴＡＢ会优先进入环糊精的空腔内内【２１, 这一竞争过程一方面导致部分环糊精的空腔被ＣＴＡＢ占据, 使能够容纳溶菌酶的环糊精空腔减少; 另一方面也导致溶液中ＣＴＡＢ的浓度大大降低, 从而降低ＣＴＡＢ对溶菌酶的复性率。因此ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ与ＣＴＡＢ同时用于溶菌酶复性时, 其复性效果较单独使用ＣＴＡＢ和ｐ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ差。而在使用ＣＴＡＢ复性１２ｈ后, 溶菌酶的复性过程已基本上完成, 此时再加入Ｂ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ可能使部分未复性的溶菌酶在环糊精的疏水性空腔的疏水作用下继续复性ｆ４ｌ, 从而使最终溶菌酶的复性率高于单独使用ＣＴＡＢ的复性效果。实验表明, 按这种方式( 第三种加入方式) 对溶菌酶进行复性, 〔Ｂ－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ与ＣＴＡＢ具有协同作用。墓ｊ４Ｄ甍葺名莲图１．８采用不同的添加方式１３一ＣＤ．ＰＮＩＰＡ和ＣＴＡＢ对溶菌酶的复性效果。Ｍｅｔｈｏｄ( １) : 仅加入ＣＴＡＢ; ｍｅｔｈｏｄ( ２) : ＣＴＡＢ与ｐ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ同时加入复性液; ｍｅｔｈｏｄ( ３) : ＣＴＡＢ复性１２ｈ后再加入ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ１２当复性完成以后, 利用ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ相变功能, 经过升高温度可将ＣＴＡＢ从溶菌酶分子上剥离出去, 从而为溶菌酶的后续纯化带来便利。同时, 在Ｄ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ剥离表面活性剂以后( 或Ｂ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ单独使用) , 同样可利用其温敏相变功能儿实现Ｂ, ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的循环使用( 图１．９) 。图１．９ｐ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的循环使用示意图１．４本章小结〔ｊ－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ及其合成中间产物ＥＤＡ．Ｄ—ＣＤ和ＰＮＩＰＡ．ＣＯＯＨ对尿素变性溶菌酶的复性过程均有促进作用, 而Ｄ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ对盐酸胍变性溶菌酶的复性过程却具有抑制作用, 不能用于辅助盐酸胍变性溶菌酶的复性。ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ分子中的Ｂ．ＣＤ疏水性空腔及ＰＮＩＰＡ链段能够共同促进溶菌酶的复性, 具有协同辅助溶菌酶复性的作用, 荧光光谱的研究结果证实了这一结论。Ｂ—ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的浓度对溶菌酶的复性效果有一定的影响, 当溶菌酶的最终浓度为１ｍｇ／ｍＬ时, ０．４ｍｇ／ｍＬ的Ｂ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性效果最好: 而复性温度应当控制在其ＬＣＳＴ以下。１３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ与ＣＴＡＢ结合用于辅助溶菌酶的复性时, 最好在ＣＴＡＢ作用一段时间后( 约１２ｈ) 再加入复性体系, 否则会对溶菌酶的复性产生不利影响。由于ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ具有温敏相变功能, 在复性完成以后, 可经过升高体系温度实现ｆｌ－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ( 或包络了ＣＴＡＢ的１３．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ) 从复性体系中分离, 为溶菌酶的后续纯化带来便利。并实现ｐ—ＣＤ．ＰＮＩＰＡ的循环使用。
１６第二章氧化多糖衍生物用于天然胶乳改性的研究
２．１引言
天然橡胶乳液州ＲＬ) 是一种生物合成的高聚物水基型胶体体系, 以聚顺式一异戊二烯为主体, 并有十几种组分的物质。其主要成分为橡胶烃、 水、 非胶物质, 其中非胶物质主要由蛋白质、 类脂物、 丙酮溶物、 水溶物、 无机盐等组成。天然胶乳具有优异的工艺操作及物理性能, 其湿凝胶强度高、 弹性大、 蠕变小等, 就其通用性而言, 当前尚无其它材料能替代, 依然是医务工作者隔离病毒及感染性微生物的最好选择。上世纪以来, 由于人们对预防艾滋病、 肝炎等病毒感染的意识增强, 导致了乳胶制品特别是手套和避孕套需求量的急剧上升, 但很快人们发现使用乳胶制品会引发一种过敏症, 其最先的症状是荨麻疹, 表现为皮肤瘙痒、 发炎、 起疙瘩、 长水泡等症状, 严重时会引起过敏性休克、 甚至死亡【ｌ】。最初人们认为是乳胶制品生产过程中加入的助剂, 如秋兰姆、 琉基苯并噻唑、 氨基甲酸盐等引起的过敏症, 后来对乳胶制品的过敏性进行深入的研究, 发现天然胶乳本身含有的水溶性蛋白质( ＷＳＰ) 是引起过敏的主要原因【２１。鲜胶乳中蛋白质的含量占胶乳重的１－２％ｔ３１, 其中约２０％被橡胶粒子所吸附, 是构成粒子保护层的重要物质, 约２０％存在于胶乳底层的液体中, 共余部分则溶解于乳清。这些蛋白质是决定橡胶粒子胶体稳定性的主要因素【４, ５１。为解决乳胶制品中水溶性蛋白的过敏性问题, 当前主要采取的方法是降低乳胶中的水溶性蛋白的含量, 国际上普遍认为, 当乳胶手套中水溶性蛋白质质量分数小于０．０００１时, 对胶乳过敏的人在皮肤刺激试验中几乎不显示过敏反应, 但大多数国家要求其质量分数应小于０．０００５１６１。降低天然胶乳中水溶性蛋白质比较成熟的方法有: ( １) 氯化法ｆ７, ８ｊ: 利用浓盐酸与次氯酸钠反应释放出的氯气与ＮＲ发生交联和环化反应, 在乳胶表面形成１７防止蛋白质迁移的阻断层。同时使蛋白质变性而使其难以溶解。氯化法是降低胶乳手套水溶性蛋白质含量的一种非常有效的方法, 也是当前工业上普遍采用的办法。但氯化处理产生的氯化废水会对环境造成污染。( ２) 沥滤法〔９１: 有湿凝胶沥滤和干胶膜沥滤。湿凝胶沥滤是指在干燥前洗涤附着在模具上的湿凝胶, 干胶膜沥滤是指在胶膜干燥和硫化后洗涤附着在模具上的胶膜。( ３) 多次离心法【ｌｏ】: 由于胶乳中的非橡胶物质绝大多部分分布在乳清相和小胶粒中, 经过重复加水稀释胶乳和离心浓缩可制成非橡胶物质含量极低的胶乳。( ４) 酶处理法【Ｉｌ－１４１: 利用蛋白酶分解破坏天然胶乳包括胶粒表面保护层中的蛋白质, 将分解出来的蛋白质转变成水溶性物质, 再经过离心分离除去或在沥滤中洗掉, 从而大大减少天然胶乳制品中的含量。( ５) 辐射硫化法１１５】: 使用＾ｒ射线或电子束对离心浓缩胶乳进行辐射硫化, 稀释后再离心可得到蛋白质含量很低的低蛋白质胶乳。上述方法虽然能够有效降低天然胶乳中的水溶性蛋白质含量, 但一方面操作复杂, 生产成本高, 且有的方法还会对环境造成污染; 另一方面由于降低蛋白质含量会影响天然胶乳的稳定性、 生胶的干燥速率、 降低生胶的抗氧化性能, 同时对乳胶制品的力学性能也有一定的不利影响【Ｉ６Ｊ。因此, 经过降低胶乳中水溶性蛋白质( ＷＳＰ) 含量的方法解决乳胶制品皮肤过敏问题并不是一个最好的选择。本研究首次提出经过固定蛋白质的方法来解决乳胶制品蛋白质过敏问题。即在天然胶乳中添加可生物降解的、 具有良好生物兼容性的氧化多糖( 本研究选取了海藻酸钠、 透明质酸和羧甲基纤维素三种多糖) , 利用氧化多糖分子上的醛基与蛋白质分子上的氨基的交联, 增大蛋白质的分子量, 使蛋白质失去水溶性, 从而将蛋白质固定在乳胶膜内。具体的实验内容包括: 氧化海藻酸钠、 氧化透明质酸和氧化羧甲基纤维素的制备和表征; 三种氧化多糖对乳胶蛋白质的固定效果比较; 氧化多糖对乳胶中蛋白质分布的影响; 添加氧化多糖后, 乳胶膜的热重、 力学性能及生物降解性能的研究等。其中, 水溶性蛋白质的析出实验经过改进的Ｌｏｗｅｒｙ方法进行表征; 乳胶膜蛋白质的分布情况经过考马斯亮蓝染色法进行评价; 生物降解性能经过室内土埋法进行考察。１８
２．２实验部分
２．２．１原料与试剂
高氨离心浓缩天然胶乳( ＧｏｌｄＴｈａｉＲｕｂｂｅｒＣｏ．, Ｌｔｄ．, Ｂａｎｇｋｏｋ, Ｔｈａｉｌａｎｄ) , 其部分指标见表２．１。海藻酸钠( ＳＡ, ＡＲ．, 天津大茂化学试剂厂) , 福林酚试剂( ＢＲ, 北京鼎国生物技术有限责任公司) , 脱氧胆酸钠( ＤＯＣ, Ｂ心上海伯奥生物技术有限公司) , 三氯乙酸( ＴＣＡ, ＡＫ天津福晨化学试剂厂) , 磷钨酸( ＰＴＡ, 幔国药集团化学试剂有限公司) , 考马斯亮蓝( Ｒ２５０, ＢＲ, 上海伯奥生物技术有限公司) , 盐酸羟胺( ＡＲ天津天新精细化工研发中心) , 其它试剂均为分析纯, 水为去离子水。表２．１高氨浓缩天然胶乳的部分指标( 厂家提供)
２．２．２氧化多糖的制备及表征
按照Ｇｏｍｅｚ〔１７】所报道的方法制备氧化海藻酸钠( ｏＳＡ) 。将海藻酸钠( １０．００曲溶于６００ｍＬ蒸馏水中, 然后在搅拌下加入１００ｍＬ高碘酸钠, 用蒸馏水将溶液稀释至总体积１Ｌ。高碘酸钠的加入比例分别为３, ５, １０ｍ０１％。避光反应２４ｈ后, １９加入３．５ｍＬ７, －－醇, 继续搅拌Ｏ．５ｈ终止反应。加入３ｇ氯化钠和ｌＬ乙醇使海藻酸钠氧化产物沉淀出来。将所得沉淀重新溶于２００ｍＬ去离子水, 用去离子水透析４８ｈ以减少最终产品中的ＮａＣｌ含量和高碘酸钠含量。产物冷冻干燥得到一种白色产品。用ＦＴ－ＩＲ进行表征。参照上述方法制备和表征氧化透明质酸( ＯＨＡ) 和氧化羧甲基纤维素( ＯＣＭＣ) 。
２．２．３醛基含量的测定在多糖的氧化过程中, 糖环单元中的Ｃ＿２和ｃ＿３位置的羟基易转变为羰基。生成的醛基可与盐酸羟胺发生希夫碱反应转变为含氮衍生物( 肟) 。经过与ＮａＯＨ溶液的酸碱中和反应可测定在希夫碱反应过程中生成的ＨＣＩ〔１８, １９〕, 并经过如下关系计算醛基含量。相关的反应式( 以海藻酸钠为例) 和计算公式如下: Ａｌｇｉｎａｔ争－( ＣＨＯ) ｎ＋ｎＨ２Ｎ－一ＯＨ‘ＨＣＩ＝Ａｌｇｉｎａｔｅ－－( ＣＨ＝Ｎ－－ＯＨ) ｎ＋ｎｎＨ２０＋ＨＣｌＨＣＩ＋ＮａＯＨ＝ＮａＣｌ＋Ｈ２０( １) ( ２) 【伽Ｄ】( 肌。ｌ／ｇ) : —０．１ｘ１０—－３ＷｘＶ( ３) 其中, 【ＣＨＯ〕为待分析的ＯＳＡ中醛基含量, ｍｏｌ／ｇ; ｙ为滴定ＨＣＩ时所消耗的Ｏ．１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ溶液的体积, 单位ｍＬ; Ｗ为待分析的ＯＳＡ的质量, 单位ｇ。用ＡＶＡＴＡＲ一３６０ＦＩ—ＩＲｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ( Ｎｉｃｏｌｅｔ／Ｎｅｘｕｓ６７０, ＵＳＡ) , 采用ＫＢｒ压片法ｇｉｎ～。扫描室温下ＯＳＡ的红外光谱。扫描范围为４０００－４００ｃｎｌ～, 间距为２
２．２．４乳胶膜的制备
将高氨离心浓缩天然胶乳( ５０９) 与一定量的氧化多糖氨水溶液混合, 然后将混合物加入到直径为１５ｔｉｎ的培养皿中, 在室温下水平放置ｌ天, 待胶乳凝固以后于５０”Ｃ干燥４８ｈ成膜。乳胶膜中氧化多糖含量分别为０．０３３％, ０．１６７％, ０．３３％和１．６７％。由天然胶乳( ５００) 与２５ｗｔ％氨水溶液( １０９) 形成的不含氧化多糖的乳胶膜为空白样。在成膜过程中乳胶膜朝向培养皿底面的那一面被定义为乳胶膜的底面( ｂｏｔｔｏｍｓｉｄｅ) , 另一面为顶面( ｔｏｐｓｉｄｅ) 。
２．２．５水溶性蛋白质含量及分布
采用改进的Ｌｏｗｒｙ方法【２０１, 利用Ｆｏｌｉｎｐｈｅｎｏｌ试剂测定乳胶膜中水溶性蛋白质( ＷＳＰ) 含量, 并按照以下公式( ４) 和( ５) 计算: ＷＳＰ( ｇｇ／ｇ) ＝黑Ｆ: —４ｍ—ＬＶｕ, , ｏＨ( ４) ( ５) 这里, ｙ为抽提液( ｐＨ为７．４的０．０２ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液) 的体积, ｍＬ; ｃ是从标准曲线上测得的蛋白质浓度, ｇｇ／ｍＬ; Ｆ为浓缩因子; Ｗ为被抽提的乳胶膜质量, ｇ; ＶＮａＯＨ为溶解蛋白质沉淀时所用Ｏ．２ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ溶液的体积, ｍＬ。经过蛋白质染色法考察乳胶膜中蛋白质的分布情况。制备大小为２０ｍｉｎｘ３０ｒａｉｎ的膜样, 浸入盛有染色液( Ｏ．１９考马斯亮蓝Ｒ２５０, ４５０ｍＬ甲醇, １００ｍＬ冰醋酸, ４５０ｍＬ蒸馏水) 的培养皿中, 置于摇床上每隔３０ｍｉｎ将乳胶膜样翻转一次, 染色３ｈ。染色完成后用脱色液( 甲醇１００ｍｌ, 冰醋酸１００ｍｌ, 蒸馏水８００ｍ１) 对乳胶膜样进行脱色, 脱色总时间为１２ｈ, 每隔３ｈ将膜样翻转一次并重新加入新的脱色液。用去离子水冲洗脱色后的乳胶膜样, 用滤纸吸干膜样表面的水分, 对染色的乳胶膜样的顶面、 底面及侧面拍照。
２．２．６力学性能的测试
根据