细菌普通染色和革兰氏染色(0001).doc

细菌普通染色和革兰氏染色
生命科学学院 生02 孙禹 2010012376
实验日期：2012-3-12 同组姓名：张宇成

一、实验目的
1、掌握细菌涂片标本的制备方法和普通染色的步骤
2、掌握革兰氏染色法的操作步骤和关键点
3、识别细菌的革兰氏染色结果
4、学习无菌操作技术

二、实验原理
本次实验的主要内容是学习革兰氏染色方法。这一方法由丹麦病理学家Christain Gram于1884年创立，通过革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类。这也是鉴别菌种的重要方法。
革兰氏染色的原理主要是由于不同细菌细胞壁的结构不同所致：
革兰氏阳性菌(G+)：细胞壁肽聚糖较厚，媒染剂可以和结晶紫形成复合物保存在细胞内，且经乙醇处理细胞壁孔径减小，难被番红再次染色，因而呈现紫色。
革兰氏阴性菌(G-)：肽聚糖层很薄，脂肪含量高。乙醇能够使细胞壁更加疏松，且通透性增加。因而结晶紫颜色容易被脱去，经番红染色后呈现红色。
另外，酵母菌也可被染色，且呈现革兰氏阳性结果。

图一 革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌细胞壁差异示意图

对比项目
占细胞壁的干重(%)
G+细菌
G-细菌
肽聚糖
含量很高(30-95)
含量很低(5-20)
磷壁酸
含量较高(<50)
0
类脂质
一般无(<2)
含量较高(约20)
蛋白质
0
含量较高
染色结果
紫色
红色
表一 革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌对比

三、实验仪器、材料和用具
1、实验仪器和用具
显微镜、擦镜纸、镜油、擦镜液、载玻片、盖玻片、接种环、酒精灯、吸水纸、镊子、
打火机、相机(自带，Canon Power Shot A580)

2、实验药品
结晶紫、革氏碘染液、95%乙醇脱色液、番红染液

3、实验样品
枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和未知菌的18小时的液体培养液
酵母菌平板、大肠杆菌平板、牙垢

四、实验步骤
本次实验可分为简单染色和革兰氏染色，通过简单染色学习基本的无菌操作技术，并练习细菌涂片标本的制备方法，包括操作规范、涂片、固定等。革兰氏染色主要学习染色的基本操作步骤，并以此鉴定菌种呈现革兰氏阳性或阴性结果。

1、简单染色
①载玻片处理：用镊子取在75%酒精中浸泡的载玻片，用吸水纸吸取酒精，在火焰上烘烤准备涂菌部位，除去油脂，冷却待用。
②涂片：对于液体涂片，左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上烧灼灭菌，带接种环冷却后在火焰旁从试管中取一环菌液，在载玻片上涂一直径约0.5-1cm 的均匀薄膜。
若从平板上取菌，灭菌后用无菌接种环挑取少量菌体，涂在预先滴有一小滴水的载玻片上，使其薄而均匀。
最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。也可利用记号笔标记涂菌部位。
③干燥：涂布后待其自然干燥。
④固定：将涂片在酒精灯火焰上通过3-4 次，以手背触载片不烫为宜（不超过60℃）。
⑤染色：在固定好的涂片上滴加一滴草酸铵甲紫染液，染色1min。
⑥水洗：用冲洗瓶或滴管缓慢冲洗染液到废液缸中，吸干。
⑦镜检。

2、革兰氏染色
①制片：取大肠杆菌(菌液或平板)、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌(平板)、未知菌、牙垢制成涂片，重复普通染色中的步骤，干燥，固定。
②初染：滴加 1 滴草酸铵甲紫染液，染色1 min，水洗，吸干。
③媒染：再滴加 1 滴碘液覆盖涂片1 min，水洗。
④脱色：用吸水纸吸去玻片上的残留水，用滴管滴加95%的乙醇脱色，轻轻摇动玻片直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，脱色约20-30s，不可过长。
⑤复染：滴加番红染液复染 3 min，水洗。
⑥镜检：用吸水纸吸干载玻片背面及标本周围的水渍，注意不要擦标本，可在玻片上第一滴水，盖上盖玻片，从低倍镜到油镜依次观察。注意细菌形态、大小、排列、颜色。
⑦鉴定结果：革兰氏阳性菌(G+)呈紫色，革兰氏阴性菌(G-)呈红色。

五、实验结果与分析
本次实验中观察的样本共有6种，分别是大肠杆菌(平板)、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌(平板)、未知菌、牙垢的涂片。
在对无菌操作熟悉之后，又经过几次尝试，完成了六组涂片的制作，由同组两个同学共同完成，所有涂片均在1000×条件下使用油镜观察，经照相机记录，显微结果与鉴定结果如下：

1、大肠杆菌(平板)涂片

菌种名称：大肠杆菌
制片人员：孙禹
放大倍数：10×100
形态结构：杆菌、均匀聚集
染色结果：红色
鉴定结果：革兰氏阴性G-
实验备注：
实验中曾用大肠杆菌培养液进行革兰氏染色实验，但经过2次尝试效果都很不好。后采用平板取菌制作图片，效果较好。
注意脱色时间不可过长，用番红染色时间要充分，才能使结果更好。

2、枯草芽孢杆菌

菌种名称：枯草芽孢杆菌
制片人员：张宇成
放大倍数：10×100
形态结构：杆菌、均匀聚集
染色结果：紫色
鉴定结果：革兰氏阳性G+
实验备注：
枯草芽孢杆菌涂片的制作相对顺利，在显微镜下可见紫色杆状细菌，图片效果颜色略失真。

3、酵母菌

菌种名称：酵母菌
制片人员：孙禹
放大倍数：10×100
形态结构：近圆形、少量聚集
染色结果：紫色
鉴定结果：革兰氏阳性G+
实验备注：
酵母菌虽为真核细胞，但也可被革兰氏染色法染色，而且具有革兰氏阳性结果。实验中颜色较难界定，但对比另外几组图片结果，仍可鉴定为紫色，说明染色比较成功。

4、金黄色葡萄球菌

菌种名称：金黄色葡萄球菌
制片人员：张宇成
放大倍数：10×100
形态结构：球菌、较分散
染色结果：紫色
鉴定结果：革兰氏阳性G+
实验备注：
金黄色葡萄球菌经染色后呈现紫色，与预期符合良好。
在显微镜下可见葡萄球菌呈分散状，可能由于制片与染色过程冲散了原本的聚集形态造成的。

5、牙垢

样本名称：牙垢
制片人员：张宇成
放大倍数：10×100
形态结构：球菌为主
染色结果：紫色
鉴定结果：革兰氏阳性G+
实验备注：
牙垢涂片显微图像中可见破碎的细胞和一些球菌和杆菌。左图所示的球菌经革兰氏染色可见紫色颜色较很明显(图中箭头所示)，可鉴定为革兰氏阳性G+。

6、未知菌S1

样本名称：未知菌S1
制片人员：张宇成
放大倍数：10×100
形态结构：杆菌、较分散
染色结果：紫色
鉴定结果：革兰氏阳性G+
实验备注：
未知菌S1涂片显微图像清晰，且紫色较为明显，可鉴定为革兰氏阳性G+。

六、实验小结与感想
本次试验重点是革兰氏染色的学习，同时还学习了无菌操作步骤，掌握了通过染色方法鉴别微生物的的原理。
实验的重点是练习革兰氏染色的方法。尽管早就听说这种鉴定细菌的方法，但直到这次实验的课上我才真正学习其操作。然而，实验并非我想象得顺利。最开始我采用液体培养的大肠杆菌进行革兰氏染色操作，然而液体培养的大肠杆菌很难固定，实验进行了两次均未能成功。于是我随后采用固体大肠杆菌进行固定和染色，这次效果明显有所改善，而实验至此我才第一次成功完成了染色实验。此后，实验逐渐变得更加顺利，我也能够更熟练地完成全部操作，并获得较好的观察效果。
另外，在实验观察中，很多细节都会影响到实验结果，如脱色时间过长、番红染色过重都可能出现假阴性的结果，而如果起初的固定操作不成功，最终甚至无法得到显微图像。所以，每一步操作都需要严格控制，同时不断学习和尝试最佳的染色操作。
这次实验在学到知识的同时，也告诉我实验就是在不断的尝试中积累经验，在失败的经历中吸取教训，获得进步。

七、思考题
1、分析影响某一微生物革兰氏染色的因素。
答：影响细菌革兰氏染色的因素有很多，包括菌种本身、试剂和操作方法等：
①细菌本身的细胞壁组成可造成染色呈现革兰氏阳性(G+)或者阴性(G-)的结果。
②细菌菌龄也会对染色结果造成影响，如菌龄较大细胞壁通透性增加可能呈现假阴性。
③如果实验所用试剂不佳也会造成染色结果偏差，如本次实验的番红染液凝结速度过快，可能对实验产生了影响。但未经对比，影响程度难以确定。
④涂片操作影响着整个实验的后续进行，如果热固定温度控制不佳，导致固定不够牢固，经染色、脱色后样本损失将很严重。
⑤染色时间不可过长，要控制初染不超过1分钟；复染时间不可过短，如进行大肠杆菌染色时间应控制在3分钟左右，否则颜色将很浅，难以观察。
⑥脱色处理时要密切观察脱色情况，10-20s时无紫色液体时脱色应立即结束。
⑦每次用水冲洗时应尽量缓慢，以恰好洗净染液为宜。不可对涂菌部位快速冲洗，否则容易冲掉细菌，造成实验失败。

2、思考一下，我们平常使用的甲紫药水杀菌机理。
答：通常所用的紫药水即甲紫溶液，一般医用的紫药水是龙胆紫的1％～2％水溶液或酒精溶液，这种染液对革兰氏阳性细菌具有明显的抑菌作用。作为碱性阳离子染液，它能够和细菌蛋白质结合，使其丧失生理活性，造成细菌死亡。

3、酵母菌能进行染色吗?结果如何?为什么?
答：酵母菌虽为真核生物，但可以被染色，且具有革兰氏染色阳性特征。这是由于酵母菌有细胞壁，且主要由葡萄糖、甘露糖以及少量蛋白质、脂质构成。多糖难溶于乙醇，因此经过初染、媒染后结晶紫难以脱色，复染后依旧呈现紫色。

八、参考资料
《微生物学实验指导》，陈金春，陈国强主编，清华大学出版社，2005年8月第一版。