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二、共聚焦激光扫描显微镜应用领域二、共聚焦激光扫描显微镜应用领域只要目的结构是用荧光探针标记的，都可用共聚焦激光扫描荧只要目的结构是用荧光探针标记的，都可用共聚焦激光扫描荧光显微镜观察。光显微镜观察。形态学研究：形态学研究：细胞凋亡、肿瘤细胞分类细胞凋亡、肿瘤细胞分类 分子生物学：分子生物学：原位杂交，原位杂交，DNA、RNA定量，定量，DNA损伤修复、损伤修复、外外源性基因在真核细胞的表达、定位源性基因在真核细胞的表达、定位，荧光能量共振转移荧光能量共振转移大分子构大分子构象的改变、受体与配体相互作用象的改变、受体与配体相互作用 活细胞动态荧光测量：活细胞动态荧光测量：细胞内细胞内Ca+、K+、H+等离子的动态分布及等离子的动态分布及动态定量、动态定量、荧光漂白恢复荧光漂白恢复细胞连接间的信息沟通细胞连接间的信息沟通 直接对活组织或整体胚胎观察：直接对活组织或整体胚胎观察：单光子共聚焦激光扫描系统的局单光子共聚焦激光扫描系统的局限性：荧光漂白限性：荧光漂白l l(一一一一)在细胞原位检测核酸在细胞原位检测核酸在细胞原位检测核酸在细胞原位检测核酸l l(二二二二)原位检测蛋白质原位检测蛋白质原位检测蛋白质原位检测蛋白质,抗体及其他分抗体及其他分抗体及其他分抗体及其他分子子子子l l(三三三三)检测细胞凋亡检测细胞凋亡检测细胞凋亡检测细胞凋亡l l(四四四四)细胞器观察及测定细胞器观察及测定细胞器观察及测定细胞器观察及测定l l(五五五五)检测细胞融合检测细胞融合检测细胞融合检测细胞融合l l(六六六六)观察细胞骨架观察细胞骨架观察细胞骨架观察细胞骨架l l(七七七七)检测细胞间缝隙连接通讯检测细胞间缝隙连接通讯检测细胞间缝隙连接通讯检测细胞间缝隙连接通讯l l(八八八八)检测细胞内脂肪检测细胞内脂肪检测细胞内脂肪检测细胞内脂肪形态学观测形态学观测(一一)在细胞原位检测核酸在细胞原位检测核酸l l检测核酸的荧光探针检测核酸的荧光探针检测核酸的荧光探针检测核酸的荧光探针l l1 1 碘化丙啶碘化丙啶碘化丙啶碘化丙啶(PI)-(PI)-不能进入完整的细胞膜不能进入完整的细胞膜不能进入完整的细胞膜不能进入完整的细胞膜l l其最大吸收光谱为其最大吸收光谱为其最大吸收光谱为其最大吸收光谱为536nm536nm，最大发射光谱为，最大发射光谱为，最大发射光谱为，最大发射光谱为617nm617nm l l2 Hoechst33342,Hoechst33258 2 Hoechst33342,Hoechst33258 和和和和DAPIDAPIl l最大吸收光谱为最大吸收光谱为最大吸收光谱为最大吸收光谱为345nm345nm（紫外光激发），最大发射光谱为（紫外光激发），最大发射光谱为（紫外光激发），最大发射光谱为（紫外光激发），最大发射光谱为460nm460nm，发射明亮的蓝色荧光发射明亮的蓝色荧光发射明亮的蓝色荧光发射明亮的蓝色荧光 l l3 AO(3 AO(吖啶橙吖啶橙吖啶橙吖啶橙)l l标记标记标记标记DNADNA时主要通过嵌入式结合（时主要通过嵌入式结合（时主要通过嵌入式结合（时主要通过嵌入式结合（AOAO分子插入双链分子插入双链分子插入双链分子插入双链DNADNA碱基对之碱基对之碱基对之碱基对之间），其最大吸收光谱为间），其最大吸收光谱为间），其最大吸收光谱为间），其最大吸收光谱为502nm502nm，最大发射光谱为，最大发射光谱为，最大发射光谱为，最大发射光谱为530nm530nm，呈绿色，呈绿色，呈绿色，呈绿色荧光；标记荧光；标记荧光；标记荧光；标记RNARNA时通过静电吸引结合方式，其最大吸收光谱为时通过静电吸引结合方式，其最大吸收光谱为时通过静电吸引结合方式，其最大吸收光谱为时通过静电吸引结合方式，其最大吸收光谱为460nm460nm，最大发射光谱为，最大发射光谱为，最大发射光谱为，最大发射光谱为650nm650nm，呈红色荧光，呈红色荧光，呈红色荧光，呈红色荧光 PI标记的细胞核（红色），绿色显示标记的细胞核（红色），绿色显示FITC标记的微管标记的微管 Hoechst 33342标记的细胞核标记的细胞核（蓝色）（蓝色）640480-染色染色方法：AO描述：细胞多角形，贴壁良好，铺展面积大(二二)原位检测蛋白质原位检测蛋白质,抗体及其他分子抗体及其他分子l l常用的荧光探针常用的荧光探针常用的荧光探针常用的荧光探针:l l荧光染料荧光染料荧光染料荧光染料FITC:FITC:蓝光激发蓝光激发蓝光激发蓝光激发,发出发出发出发出明亮绿色明亮绿色明亮绿色明亮绿色荧光荧光荧光荧光l lFITCFITC的最大吸收光谱为的最大吸收光谱为的最大吸收光谱为的最大吸收光谱为490495nm490495nm，最大发射光谱为，最大发射光谱为，最大发射光谱为，最大发射光谱为520530nm520530nm l l罗丹明罗丹明罗丹明罗丹明Rhodamine:Rhodamine:比比比比FITCFITC光稳定性好光稳定性好光稳定性好光稳定性好,在在在在生理条件下对生理条件下对生理条件下对生理条件下对PHPH变化不敏感变化不敏感变化不敏感变化不敏感,荧光强度受细荧光强度受细荧光强度受细荧光强度受细胞自发荧光的干扰较小胞自发荧光的干扰较小胞自发荧光的干扰较小胞自发荧光的干扰较小l l最大吸收光谱为最大吸收光谱为最大吸收光谱为最大吸收光谱为550nm550nm，最大发射光谱，最大发射光谱，最大发射光谱，最大发射光谱620nm620nm呈呈呈呈橙红色橙红色橙红色橙红色荧光荧光荧光荧光 l l荧光双标，荧光多标荧光双标，荧光多标荧光双标，荧光多标荧光双标，荧光多标蓝色示细胞核（蓝色示细胞核（DAPI）,绿色示微管（绿色示微管（FITC），），红色示微丝（红色示微丝（TRITC）Confocal image showing a macrophage in the lung of a mouse infected with SARS-corona virus.Double immunofluorescence labels the macrophage in red with antibodies against Mac-2 and viral protein in green with antibodies against spike 3 绿色荧光蛋白（绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein GFP）蓝色荧光蓝色荧光 GFP 绿色荧光绿色荧光 Ca2+肠腔素肠腔素Aequoren+n*可对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察可对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察Confocal microscope image of GFP-tagged Merlin(green),in the larval salivary gland.The Merlin protein is cytoplasmic but closely associated with the plasma membrane in the apical end of epithelial cells.The polytene chromosomes in the nuclei are stained with propidium iodide(red).(三三)检测细胞凋亡检测细胞凋亡l l通常用的方法通常用的方法:l l1 细胞核形态观察细胞核形态观察l l2 脱氧核苷酸未端转移酶介导的缺口脱氧核苷酸未端转移酶介导的缺口末端标记法末端标记法(TUNEL)l l3 Annexin-V试剂盒是检测凋亡细胞试剂盒是检测凋亡细胞膜损伤的新方法膜损伤的新方法凋亡形态学变化凋亡形态学变化-凋亡小体凋亡小体1细胞核形态观察I期细胞核成波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态Iia期细胞核的染色质高度聚集，边缘化Iib期细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。(三三)检测细胞凋亡检测细胞凋亡l l2 2 脱氧核苷酸未端转移酶介导的缺口末端标记法脱氧核苷酸未端转移酶介导的缺口末端标记法脱氧核苷酸未端转移酶介导的缺口末端标记法脱氧核苷酸未端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)(TUNEL)TUNEL is a common method for detecting DNA fragmentation that results from apoptotic signaling cascades.The assay relies on the presence of nicks in the DNA which can be identified by terminal deoxynucleotidyl transferase,an enzyme that will catalyze the addition of dUTPs that are secondarily labeled with a marker.It may also label cells that have suffered severe DNA damagel l3 Annexin-V3 Annexin-V试剂盒是检测凋亡细胞膜损伤的新方法试剂盒是检测凋亡细胞膜损伤的新方法试剂盒是检测凋亡细胞膜损伤的新方法试剂盒是检测凋亡细胞膜损伤的新方法 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为3536kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（FITC、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。Light and confocal micrographs showing cellular and nuclear morphology in human preimplantation embryos.Nuclei are labeled DAPI(blue).(A)Fragmenting day 2 human embryo,with fragments arrowed.(B)Nuclei from a day 6 blastocyst showing TUNEL-labeled(pink)fragmented nuclei Annexin-V-FITC与与PI显示细胞凋亡显示细胞凋亡(四四)细胞器观察及测定细胞器观察及测定1线粒体线粒体 Mitochondria Rodamin 123 Mitotracker Green FM Mitotracker Orange CMTMRos Mitotracker Orange 2 溶酶体溶酶体 Lysosome 中性红中性红 AO LysoTracker Green DND-26/Blue/Red3 内质网内质网 Endoplasmic Reticulum DiOC64 高尔基体高尔基体 Golgi apparatus NBD C6-ceramie细胞内线粒体线粒体LysoTracke标记溶酶体溶酶体，绿色示微管，核DAPI复染ER-Tracker Blue-White DPX标记细胞内质网标记细胞内质网高尔基复合体染色Golgiapparatus(green),microtubules(red),andDNA(blue).(五五)观察细胞骨架观察细胞骨架l l骨架骨架(微丝微丝,微管和中等纤维微管和中等纤维)直标直标:一抗一抗+荧光探针荧光探针(如如:肌动蛋白肌动蛋白actin Rhodamine-phalloidin)间标间标:二抗二抗+荧光探针荧光探针(如如:微管蛋白微管蛋白tublin)细胞骨架染色，肌动蛋白Rhodamine-phalloidin)细胞骨架染色，微丝微丝细胞骨架染色微管微管(六六)检测细胞间缝隙连接通讯检测细胞间缝隙连接通讯l l染料荧光染料荧光染料荧光染料荧光黄黄黄黄(LY)-(LY)-黄色带电荷的小分子强荧光物黄色带电荷的小分子强荧光物黄色带电荷的小分子强荧光物黄色带电荷的小分子强荧光物质质质质,不通过细胞膜不通过细胞膜不通过细胞膜不通过细胞膜,但可以很容易通过细胞间隙连但可以很容易通过细胞间隙连但可以很容易通过细胞间隙连但可以很容易通过细胞间隙连接通讯（接通讯（接通讯（接通讯（GJICGJIC）,从标记的细胞从标记的细胞从标记的细胞从标记的细胞(划痕法划痕法划痕法划痕法)传输到传输到传输到传输到邻近细胞邻近细胞邻近细胞邻近细胞.l l观察观察观察观察LYLY向邻近细胞的传输速率向邻近细胞的传输速率向邻近细胞的传输速率向邻近细胞的传输速率,用以表示用以表示用以表示用以表示GJICGJIC连连连连接通讯功能接通讯功能接通讯功能接通讯功能星标：外源性注射荧光黄的细胞(七七)检测细胞内脂肪检测细胞内脂肪l l尼罗红尼罗红(Nile red):是一个理想的脂肪染色剂是一个理想的脂肪染色剂,它只在疏水环境中显示很强的荧光它只在疏水环境中显示很强的荧光.除了在所除了在所需显示的脂质中被溶解外需显示的脂质中被溶解外,尼罗红与组织不发尼罗红与组织不发生任何反应生任何反应.Nilered标记细胞内脂滴，蓝色为细胞核l l利用相应的特异荧光控针标记后利用相应的特异荧光控针标记后l l观察单个细胞不同部位或不同组织区域接受观察单个细胞不同部位或不同组织区域接受刺激后的整个变化过程刺激后的整个变化过程l l(一一)实时定量测定细胞内实时定量测定细胞内Ca2+的变化的变化l l(二二)测定细胞内测定细胞内PH变化变化l l(三三)检测膜电位的变化检测膜电位的变化l l(四四)检测细胞内活性氧物种的产生检测细胞内活性氧物种的产生l l(五五)检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其定位定位l l(六六)检测荧光共振能量转移检测荧光共振能量转移(FRET)l l(七七)检测荧光漂白恢复检测荧光漂白恢复(FRAP)（一一）实时检测细胞内实时检测细胞内CaCa的变化的变化l l l lFluo-3Fluo-3较为常用较为常用l la其乙酰羟甲基酯其乙酰羟甲基酯(AM)形式是形式是Fluo-3AM,无荧光无荧光,为不带电荷的亲脂性化合物为不带电荷的亲脂性化合物,易于渗透脂膜进入活易于渗透脂膜进入活细胞内细胞内l l l lb在胞内被非特异酯酶水解在胞内被非特异酯酶水解,释放出游离酸形式的释放出游离酸形式的荧光探针分子荧光探针分子,此游离态也无荧光此游离态也无荧光,不易漏出胞外不易漏出胞外l lc一旦与一旦与Ca2+结合后便形成复合物结合后便形成复合物,并有较强的荧并有较强的荧光产生光产生,从而发挥其钙探针的作用从而发挥其钙探针的作用.KCL诱导的细胞外诱导的细胞外Ca+内流测量内流测量培养培养/分离的细胞分离的细胞 20 M Fluo 3-AM负载液负载液30-60min 清洗、换液清洗、换液 扫描扫描KCL若须快速测量若须快速测量1.改变扫描速度改变扫描速度2.采用双向扫描采用双向扫描3.减少采样点数减少采样点数(牺牲空间分辨率）牺牲空间分辨率）4.采用线扫描采用线扫描(xt)KCL(二二)测定细胞内测定细胞内PHPH变化变化l l常用的荧光探针有常用的荧光探针有BCECF和和6-COFDAl lBCECF的激发光谱是的激发光谱是PH依赖性依赖性的。的。在适在适当的当的pH值情况下可以被激发形成绿色荧光。值情况下可以被激发形成绿色荧光。(二二)测定细胞内测定细胞内PHPH变化变化l l最大激发波长和发射波长因最大激发波长和发射波长因最大激发波长和发射波长因最大激发波长和发射波长因pHpH的不同而有所的不同而有所的不同而有所的不同而有所不同，最大激发波长大致在不同，最大激发波长大致在不同，最大激发波长大致在不同，最大激发波长大致在503nm503nm左右，最大左右，最大左右，最大左右，最大发射波长大致在发射波长大致在发射波长大致在发射波长大致在520nm520nm左右，实际检测时推荐左右，实际检测时推荐左右，实际检测时推荐左右，实际检测时推荐使用的激发波长为使用的激发波长为使用的激发波长为使用的激发波长为488nm488nm，发射波长为，发射波长为，发射波长为，发射波长为535nm535nm。BCECFBCECF在不同在不同在不同在不同pHpH条件下的发射光谱参考下图。条件下的发射光谱参考下图。条件下的发射光谱参考下图。条件下的发射光谱参考下图。(三三)检测膜电位的变化检测膜电位的变化l l快响应探针快响应探针:膜电位直接影响探针分子的电分布而膜电位直接影响探针分子的电分布而改变其光谱改变其光谱,响应快响应快l l慢响应探针慢响应探针:主要通过改变其在膜内外的分布来对主要通过改变其在膜内外的分布来对膜电位的变化作出反应膜电位的变化作出反应.跨膜运动需要一定的时间跨膜运动需要一定的时间,所以反应慢所以反应慢.依探针对电位变化响应速度依探针对电位变化响应速度,将电位敏感探针分为快响应探针和慢响应探针将电位敏感探针分为快响应探针和慢响应探针(四四)检测细胞内检测细胞内活性氧物质的产生活性氧物质的产生l l基本原理基本原理:l la DCFH-DA进入细胞后进入细胞后l lb 经酯酶作用脱去二酯经酯酶作用脱去二酯,生成不发荧光的生成不发荧光的DCFHl lc 被超氧阴离子被超氧阴离子,过氧化氢等活性氧化生成发荧光的过氧化氢等活性氧化生成发荧光的DCF l ld 活性氧自由基的含量与荧光探针之荧光强度成正活性氧自由基的含量与荧光探针之荧光强度成正相关相关DCFH-DA常用于直接测定细胞内活性氧自由基的动态变化常用于直接测定细胞内活性氧自由基的动态变化(四四)检测细胞内检测细胞内活性氧物质的产生活性氧物质的产生DCFH-DA常用于直接测定细胞内活性氧自由基的动态变化常用于直接测定细胞内活性氧自由基的动态变化(五五)检测药物等跨膜进入组织检测药物等跨膜进入组织/细胞过程及定位细胞过程及定位l l为检测药物分子为检测药物分子,病毒病毒,细菌等外界物质能否跨膜进入细菌等外界物质能否跨膜进入细胞细胞/组织组织,需利用这些物质特异性自发荧光需利用这些物质特异性自发荧光/对其进对其进行荧光标记行荧光标记.(六六)检测荧光共振能量转移检测荧光共振能量转移(FRET)(FRET)l l由于荧光蛋白的独特优点由于荧光蛋白的独特优点由于荧光蛋白的独特优点由于荧光蛋白的独特优点,其特定的荧光对理论上其特定的荧光对理论上其特定的荧光对理论上其特定的荧光对理论上可用于活细胞中实时研究大分子间的相互作用可用于活细胞中实时研究大分子间的相互作用可用于活细胞中实时研究大分子间的相互作用可用于活细胞中实时研究大分子间的相互作用.荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体 Donor）的发射光谱与另一个基团（受体 Acceptor）的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时（一般小于100A0），就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光,同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。荧荧光光能能量量共共振振转转移移(Fluorescence Resonance Energy Transfer)I.荧光能量共振转移荧光能量共振转移:受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫供体荧光素供体荧光素，能量的接受者叫能量的接受者叫受体荧光素受体荧光素。供体荧光素供体荧光素 受体荧光素受体荧光素1.供体与受体间的距离供体与受体间的距离 10nm或或=1-7nm2.供体的供体的发射光谱发射光谱与受体的与受体的吸收光谱吸收光谱有实质性的重叠有实质性的重叠II.荧光能量共振转移的条件荧光能量共振转移的条件488nm520nm650nm540nm650nm488nm520nm供体荧光素供体荧光素(Cy2)受体荧光素受体荧光素(Cy3)供体荧光素供体荧光素(Cy2)受体荧光素受体荧光素(Cy3)(七七)检测荧光漂白恢复检测荧光漂白恢复(FRAP)(FRAP)l lFRAP:是将待测细胞用荧光物质标记是将待测细胞用荧光物质标记,借助高强度借助高强度脉冲式激光照射细胞的某一区域脉冲式激光照射细胞的某一区域,从而造成该区域从而造成该区域荧光分子的光淬灭荧光分子的光淬灭;通过低强度激光扫描成像通过低强度激光扫描成像,可以可以探测到该区域周围的非淬灭荧光分子向受照射区探测到该区域周围的非淬灭荧光分子向受照射区域扩散的速率域扩散的速率.l l从理论上讲从理论上讲,凡是能够标记待测分子凡是能够标记待测分子,并且能够发生并且能够发生荧光淬灭的荧光物质都可以使用荧光淬灭的荧光物质都可以使用.IntensityBeforebleachAfterbleach90minafterbleach荧光漂白恢复荧光漂白恢复 (Fluorescence Recover after photobleaching;FRAP)检测细胞连接间的信息传递Laser Scanning Confocal Microscope1.普通荧光显微镜的不足普通荧光显微镜的不足 使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅图像与对比度增强，而使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅图像与对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使用短波长的紫外光，大大提高了分辩率且由于许多荧光显微镜的光源使用短波长的紫外光，大大提高了分辩率（=0.61/NA）。但当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅）。但当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率大大降低收，这些来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是层次（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构）。区别的重叠结构）。一、激光扫描共聚焦显微镜的成像基本原理一、激光扫描共聚焦显微镜的成像基本原理2.共聚焦扫描显微镜的成像原理共聚焦扫描显微镜的成像原理采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，约孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，约100-200nm；相对于焦平面上的光点，；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。Confocal Principle每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横短面总是有一定厚度的，又称为光学这个光学横短面总是有一定厚度的，又称为光学薄片。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，薄片。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深近似为零，沿景深近似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学层扫描，形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学切片。把切片。把X-Y平面（焦平面）扫描与平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。图像。荧光探针的选择荧光探针的选择原则：尽量减小不同荧光物质间激发原则：尽量减小不同荧光物质间激发/发射光谱的重叠。发射光谱的重叠。标记要求标记要求荧光素选择荧光素选择/组合组合核复染核复染单标单标 无特殊限制。无特殊限制。FITC,Cy2最佳；尽量不选择最佳；尽量不选择Cy5,Cy5.5（红外（红外)与与自发荧光自发荧光冲突时，采用冲突时，采用Texas Red。Propedium Iodide(PI)/DAPI双标双标FITC/Cy2+TEXAS REDFITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3DAPI三标三标FITC/Cy2+TEXAS RED+Cy5.5FITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3+Cy5.5活细胞追活细胞追踪踪 能被细胞主动摄取、对细胞无毒性作用、能在活细胞内能被细胞主动摄取、对细胞无毒性作用、能在活细胞内长时间长时间 存在、随细胞分裂进入子细胞存在、随细胞分裂进入子细胞 (http:/)显微注射；转基因技术显微注射；转基因技术（GFP；GFP-ACTIN）