HbAc基础知识培训.pptx

HbA1c定义定义l HbA1c:葡萄糖与血红蛋白葡萄糖与血红蛋白链氨基酸末端的链氨基酸末端的6 6个氨基酸个氨基酸结结合产生的一种特定的糖化血红蛋白合产生的一种特定的糖化血红蛋白l血红蛋白被糖化后，氨基酸末端所带血红蛋白被糖化后，氨基酸末端所带负电荷负电荷会增加会增加l Hb HbA A0 0：没有结合葡萄糖的血红蛋白没有结合葡萄糖的血红蛋白链氨基酸末端的链氨基酸末端的6 6个氨个氨基酸基酸l HbAHbA1c1c以百分比表示，即以以百分比表示，即以和葡萄糖结合的血红蛋白占全部血红蛋白的比例l正常参考范围：正常参考范围：4%-6%4%-6%（NGSP/DCCTNGSP/DCCT标化的方法）标化的方法）糖化血红蛋白-血红蛋白的糖基化产物葡萄糖进入红细胞，在内部与血红蛋白发生反应葡萄糖进入红细胞，在内部与血红蛋白发生反应血红蛋白葡萄糖红细胞糖化血红蛋白的生物合成过程（两步）血红蛋白葡萄糖中间产物中间产物-LA1c Schiff碱碱HbA1c第一部：快速反应，生成不稳定A1c（LA1c）第二步：缓慢反应，生成稳定的A1c（HbA1c）糖化和非糖化的血红蛋白HbHbA0HbA1HbA1aHbA1bHbA1cHbA()HbA2()HbF()95%2%1-3.5%成人血红蛋白分三种成人血红蛋白分三种HbA为主要成人为主要成人Hb非糖化非糖化Hb糖化糖化Hb6-8%87-89%血红蛋白血红蛋白HbA1c是如何计算的？A1c%=A1c/A0+HbA1离子交换色谱所分离的组分解释（非糖尿病样本）HbHb的组成的组成%of Hb Hb%of Hb Hb与糖类的结合与糖类的结合HbA1a 1%HbA1a 1%HbA1与1,6-二磷酸果糖结合而成 HbA1b 1%HbA1b 1%丙酮酸与链氨基末端缬氨酸结合而成 HbF 1%HbF 1%胎儿血红蛋白胎儿血红蛋白LA1c 1%LA1c 1%血红蛋白形成血红蛋白形成HbA1cHbA1c之前的中间产物之前的中间产物HbA1c 46%HbA1c 46%链链氨基酸端与葡萄糖结合的产物氨基酸端与葡萄糖结合的产物HbA0 HbA0 90%90%非糖化血红蛋白非糖化血红蛋白 胎儿血红蛋白在胎儿及出生6个月以内的新生儿体内为高浓度，6个月后基本降为成人水平妇产科 HbA1c主要用于糖尿病妊娠的筛查色谱图举例 HbA1a&HbA1b HbA的次要组分的次要组分LA1c(希夫碱希夫碱)和氨甲基乙和氨甲基乙酰化的酰化的 Hb HbA1c A0总面积为 100万万-500万万 A1c 结果结果小结什么是HbA1c和HbA0？A1c被糖化后什么电荷增加了？为什么糖化血红蛋白在A0峰之前被洗脱下来？测量糖化血红蛋白为什么要先对样本溶血？HbA1c是如何计算的？成人血红蛋白包括哪几种？HbF是什么？浓度高时是否会对A1c造成干扰？为什么？伯乐的糖化试剂能报告HbF吗？为什么？糖化的血红蛋白包括哪几种？HbA1c实验室检测方法常见的HbA1c检测方法 主要有三种检测方法:1.离子交换高压液相色谱（离子交换高压液相色谱（HPLCHPLC）直接分离直接分离HbA1cHbA1c2.硼酸亲和高压液相色谱 检测产物为总糖化血红蛋白3.免疫法 检测产物为检测产物为HbA1cHbA1c各检测方法的精密度 方法 精密度 电泳 +免疫法 +低压液相色谱（LPLC）+高压液相色谱（HPLC）+各检测方法的分析物HbA(a a2 2)HbA1HbA0HbA1aHbA1bHbA1c非糖化成分非糖化成分糖化成分糖化成分离子交换色谱和免疫法检测物离子交换色谱和免疫法检测物硼酸亲和色谱检测物硼酸亲和色谱检测物离子交换HPLC检测糖化血红蛋白HbA1c的金标准方法 DCCT研究中唯一所采用的HbA1c检测方法 NGSP标准化的参考方法 检测原理：基于HbA1c 与其它血红蛋白组分所带电荷不同，在一定的缓冲液离子强度下可与分析柱树脂表面偶联的离子基团有不同程度的结合，从而将HbA1c与其它组分(HbA1b,HbA1a,HbF,HbA0)区分开而得到分离。离子交换HPLC检测原理色谱图的横坐标是时间，纵坐标是信号强度，反映Hb各分析峰浓度的高低被校准的峰被阴影化被校准的峰被阴影化离子交换HPLC的特点采用采用离子交换原理离子交换原理基于基于HPLCHPLC的平台的平台HPLC方法的试剂组成包括：分析柱、缓冲液、校准品q采用分析柱内填充的离子交换树脂作为固定相，树脂上面偶采用分析柱内填充的离子交换树脂作为固定相，树脂上面偶联了带电荷基团联了带电荷基团q以可形成以可形成不同离子强度不同离子强度洗脱梯度的缓冲试剂作为流动相。洗脱梯度的缓冲试剂作为流动相。q溯源性由试剂盒配套的校准品保证溯源性由试剂盒配套的校准品保证分离效果的影响因素分离效果的影响因素分析柱内的填充物（颗粒越小，分离效果越好，速度越慢）分析柱内的填充物（颗粒越小，分离效果越好，速度越慢）分析柱柱长（越长，分离效果越好，速度越慢）分析柱柱长（越长，分离效果越好，速度越慢）离子交换HPLC的优缺点优点：优点：1.全自动 2.结果准确，可靠 分析物为HbA1c。高分辨率方法可同时区分常见血红蛋白变异体，给临床医生已额外的医疗提示 3.精密度好 CV5%CV%5%）只报只报HbA1cHbA1c一个数值，不能检测血红蛋白变异体一个数值，不能检测血红蛋白变异体高血红蛋白高血红蛋白F F样本的样本的HbA1cHbA1c检测结果偏低检测结果偏低严重的黄疸和高脂血影响比色结果严重的黄疸和高脂血影响比色结果国产糖化试剂的国产糖化试剂的非标准化问题非标准化问题小结糖化血红蛋白的主要检测方法有什么？检测产物分别是什么？HPLC的中文全称是什么？HbA1c检测的金标准方法是？为什么？离子交换HPLC的检测原理是基于什么的不同？检测试剂应该包括哪些主要的组分？分析柱中填充的是什么？上面偶联了什么？不同缓冲液的区别是什么？不同离子交换HPLC方法的分辨率一样吗？分辨率的关键影响因素是什么？糖化血红蛋白检测结果的溯源性由哪种试剂保证？伯乐糖化产品的色谱图横坐标是什么？纵坐标是什么？硼酸亲和色谱法的检测原理是基于什么？色谱图有几个峰？分别是什么？硼酸亲和色谱法是怎么检测HbA1c的？免疫法检测糖化血红蛋白的原理是基于什么反应？国产免疫法试剂的缺点有哪些？HbA1c实验室检测干扰因素常见检测干扰因素非方法学特异的干扰因素改变红细胞寿命的生理条件可影响 HbA1c结果导致检测结果假性偏低 镰刀细胞性贫血和溶血性贫血 维他命 C和 E（抑制糖化作用）导致检测结果假性偏高 铁缺乏性贫血，脾切除术后 真性红细胞增多症（高原地区）妊娠期 Hb浓度偏低，HbA1c比正常人偏低 方法学特异的干扰因素血红蛋白变异体(如.HbS,HbC，HbD,HbE)血红蛋白衍生物(乙酰化、甲酰化衍生物等)长期服用阿斯匹林的病人，体内乙酰化Hb高，结果偏高 肾衰病人的氨甲酰基化，导致结果偏高Schiff碱（A1c中间产物）某些血糖浓度急剧变化的1型糖尿病人，Schiff碱升高，胎儿血红蛋白HbF严重的黄疸、高血脂血红蛋白变异体的发生率全世界已经发现了超过一千种血红蛋白变异体全世界已经发现了超过一千种血红蛋白变异体全球的血红蛋白变异体发生率的最新数据是全球的血红蛋白变异体发生率的最新数据是7%*7%*非洲裔美国人：HbSHbS 7.8%；HbC 2.3%19881988年年,2.5,2.5,河南河南*20012001年年,3.2,3.2 ,丝绸之路丝绸之路*云南：云南：4%4%云南省的阿昌族HbE的发病率为41.2%*Kohne E.Hemoglobinopathies:clinical manifestations,diagnosis,and treatment.1.Dtsch Arztebl Int.2011;108(31-32):532-540.*河南省异常血红蛋白的调查与化学结构的分析研究,新乡医学院学报,1988,(02)9-12*中国丝绸之路地区血红蛋白病的遗传流行病学的特点，人类学学报，2001，V20变异体对HbA1c准确性的影响Ross J.Molinaro,Targeting HbA1c:standardization and clinical laboratory measurement.MLO Jan,2008,血红蛋白变异体对HbA1c结果准确性的影响对部分方法的检测结果对部分方法的检测结果准确性有影响准确性有影响例：例：A0A0后有变异体的糖尿病后有变异体的糖尿病人样本，人样本，HbFHbF正常正常G8G8标准模式试剂的检测标准模式试剂的检测结果结果偏低偏低1%1%G8 Variant 模式试剂（1.6分钟/test）G8 标准模式试剂（1.0分钟/test）血红蛋白变异体与血糖监控血红蛋白变异体会影响红细胞的寿命，红细胞的寿命血红蛋白变异体会影响红细胞的寿命，红细胞的寿命会影响糖化血红蛋白的生成会影响糖化血红蛋白的生成这些病人或许应该有不同的糖化血红蛋白的监控时间这些病人或许应该有不同的糖化血红蛋白的监控时间或者改用其他指标来评估血糖或者改用其他指标来评估血糖小结影响HbA1c检测结果的非方法学特异的干扰因素影响HbA1c检测的方法学特异的干扰因素有哪些？变异体与A0没有分离开的情况下会导致检测结果偏高还是偏低？为什么？变异体与A1c没有分离开的情况下会导致检测结果偏高还是偏低？为什么？血红蛋白变异体会通过两个方面影响糖化血红蛋白，请详述。临床上对于有血红蛋白变异体的病人有什么建议？实验室应该怎么满足临床的这一需求？糖化血红蛋白实验室检测指南的要求20132013年中国糖尿病杂志年中国糖尿病杂志8 8月刊月刊分析系统的要求分析系统的要求1.1.测定方法要求溯源到测定方法要求溯源到IFCCIFCC参考方法，如参考方法，如NGSPNGSP认证方法认证方法 （NGSPNGSP认证的有效期是认证的有效期是1 1年）年）2.2.实验室要知晓所选分析系统可能存在的干扰因素实验室要知晓所选分析系统可能存在的干扰因素3.POCT3.POCT方法的精确性不能满足临床要求，目前不能用于糖尿病方法的精确性不能满足临床要求，目前不能用于糖尿病的诊断的诊断中国三级医院的实验室检测情况数据统计于NCCL历年室间质评数据采用NGSP标准化方法的实验室占比81%HbA1cTotalGHBHbA1在在DCCT和和UKPD结果发表之前，美国有结果发表之前，美国有800个试验室在做个试验室在做A1c检测，检测，CAP实验调查实验调查显示在不同的实验室，用不同的检测方法得出的显示在不同的实验室，用不同的检测方法得出的A1c结果存有巨大的差异。结果存有巨大的差异。HbA1c检测的标准化美国从1996年起开展国家糖化血红蛋白标准化计划国家糖化血红蛋白标准化计划（NGSP），在HbA1c的检测值一致性方面取得了巨大成功在在NGSPNGSP的中心实验室所采用的参考方法是的中心实验室所采用的参考方法是 离子交换离子交换HPLCHPLC NGSP 由指导委员会和实验室网络组成。实验室网络包括一级中心参考实验室（CPRL）、一级参考实验室（PRL）和二级参考实验室（SRL）目的:1.糖化血红蛋白检测项目实现标准化2.以使各临床试验室的检测结果与DCCT的报告结果具有可比性(该DCCT试验建立了平均血糖与糖尿病并发症的发病风险之间的关系)www.ngsp.org临床实验室临床实验室NGSP 网络网络 厂商厂商 校准品校准品1 新鲜血新鲜血NGSP 程序程序(精密度与偏差精密度与偏差)认证认证2 新鲜血新鲜血能力比对测试能力比对测试3 新鲜血新鲜血NGSP标准化对标准化对A1c检测的贡献检测的贡献从无序到有序从无序到有序2008年调查显示2000多家CAP实验室间使用不同的检测方法的CVs在1.3-7.1%之间，基于A1c检测结果已经能够有效的标准化 IFCC标准化20022002年年IFCCIFCC发表文件，发表文件，正式推荐正式推荐 HbA1c HbA1c检测的参考方法为检测的参考方法为HPLC-MS(HPLC-MS(质谱质谱)或或HPLC-CE(HPLC-CE(毛细管电泳毛细管电泳)校准品为纯化的校准品为纯化的 HbAo HbAo 和和 HbA1c HbA1c 混合物，共混合物，共 6 6 个浓度个浓度室内室内CV0.47CV0.472.07%2.07%；室间；室间CV1.35CV1.352.27%2.27%但是，NGSP和IFCC方法检测HbA1c值存在1%-2%的差异IFCC%HbA1c2.13.2 4.3 5.4 6.4 7.5 8.6 9.710.7 NGSP%HbA1c456789101112偏差偏差 1.9 1.8 1.7 1.6 1.6 1.5 1.4 1.3 1.3非糖尿病范围非糖尿病范围控制目标控制目标需采取治疗措施需采取治疗措施各个标准与各个标准与IFCC之间的转换之间的转换JDS/JSCC%=0.927*IFCC%+1.73NGSP%=0.915*IFCC%+2.15Sweden%=0.989*IFCC%+0.88IFCCIFCC%HbA1c%HbA1cJDSJDS%HbA1c%HbA1c2.02.03.63.64.34.35.65.66.46.47.67.68.68.69.69.610.810.811.611.6NGSPNGSP%HbA1c%HbA1c4 46 68 8101012121.1.HbA1cHbA1c的检测必须在世界范围内标准化，包括参考系统和数值报告的检测必须在世界范围内标准化，包括参考系统和数值报告 2.IFCC的参考系统是唯一的标准化是唯一的标准化参考系统3.3.HbA1cHbA1c以以IFCCIFCC单位单位(mmol/mol)(mmol/mol)以及转换的以及转换的NGSP units(%)NGSP units(%)报告，使用报告，使用IFCC-NGSPIFCC-NGSP换算换算公式公式 4.4.需要确保基层糖尿病容易获得需要确保基层糖尿病容易获得IFCCIFCC和和NGSPNGSP转换公式转换公式 5.5.杂志编辑和出版物建议采用杂志编辑和出版物建议采用SI(IFCC)SI(IFCC)和和NGSPNGSP双重单位报告双重单位报告HbA1c HbA1c 6.6.糖化血红蛋白的标准化称谓为糖化血红蛋白的标准化称谓为HbA1cHbA1c，在指南或教育材料中也可以简写为，在指南或教育材料中也可以简写为A1C A1C 2010年HbA1c标准化第二次全球共识(ADA、EASD、IDF、IFCC和ISPAD)2010 in Annals of Clinical Biochemistry,Clinical Chemistry,Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,Diabetes Care,Diabetes Research and Clinical Practice,Diabetologia,Diabetic Medicine and Pediatric Diabetes.NGSP=0.09148*IFCC+2.152 NGSP和IFCC之间的转换NGSP=0.09148*IFCC+2.152 糖化血红蛋白糖化血红蛋白HbA1cHbA1c HbA1c的临床应用与实验室检测相符相承实验室实验室检测标准化检测标准化血糖监控血糖监控指标指标 糖尿病筛糖尿病筛查与诊断查与诊断19932010分析系统性能指标要求1.1.报告结果：以报告结果：以HbA1cHbA1c相当于相当于HbA1cHbA1c报告结果，因为只有这一个分析项报告结果，因为只有这一个分析项目才有评估并发症发生的优良数据库。目才有评估并发症发生的优良数据库。2.2.精密度：精密度：室内室内CV3%,CV3%,以小于以小于2%2%为宜；为宜；测定质量目标：测定质量目标：0.5%HbA1c0.5%HbA1c3.3.准确度：与可接受参考值的差值在准确度：与可接受参考值的差值在 0.5%HbA1c0.5%HbA1c范围内范围内4.4.准确度验证方法：准确度验证方法：1 1）参加室间质评活动参加室间质评活动 2 2）检测有证参考物质；检测有证参考物质；3 3）与运行经过认证系统的有资质实验室的测定结果进行比对与运行经过认证系统的有资质实验室的测定结果进行比对注意：没有直接的证据显示其它检查的数据与糖尿病长期并发症风险有关(例如：总糖化血红蛋白、果糖胺或糖化血清蛋白)实验室不精密度对检测结果变异性的影响6.5%6.5%的的 HbA1cHbA1c在不同分析不精密度水平下的在不同分析不精密度水平下的95.5%95.5%离散程度离散程度不同室内不同室内CV对对 A1C 分析的影响分析的影响（95%的可信区间）的可信区间）CV%6.0%A1C6.5%A1C7.0%A1C25.76-6.246.24-6.766.72-7.2835.64-6.366.11-6.896.58-7.4255.4-6.65.85 7.156.3 7.7正常人和病人无正常人和病人无法区分法区分血糖控制好坏无血糖控制好坏无法区分法区分HbA1c结果不准确对临床医生判断的影响结果不准确对临床医生判断的影响l正常值与医学决定水平差值小lHbA1c可诊断DM（只有室内CV3%,才能室间CV5%）为什么A1c有严格的精密度要求？部分仪器的国内外差距巨大伯乐公司的三款仪器的CV%国内外表现一致而Primus、G7和Roche的仪器国内外精密度差异显著数据来源：数据来源：NCCL 糖化等糖化等7项室间质评会（项室间质评会（2011年）年）原因？p 超柱效p 与国际不同试剂型号p 日立开放试剂5.色谱柱适用于使用色谱柱方法实验室应知晓本室所使用色谱柱可检测样品的数量达到检测数量限应及时更换，不可超量使用不同方法的色谱柱可检测样品数量不同异常结果处理(需在需在NGSP认证的方法下使用认证的方法下使用)HbA1c检测结果低于4%或大于15%的样品应进行复查，并与临床医生沟通 如Bio-Rad D-10的线性范围是3.8%-18.5%对测定结果与临床表现不符的样品应进行进一步检测