天美公司LC高效液相色谱仪水行业.pptx

液相历史现状简介液相历史现状简介液相色谱的简史及现状液相色谱的简史及现状（一）（一）液相色谱的雏形液相色谱的雏形 薄层色谱薄层色谱经典的液相色谱制备色谱的雏形制备色谱的雏形1、早在古罗马时期，人们就知道将一滴混合色素的溶液滴在一块布或一张纸上，观察溶液展开产生的一个个同心圆来分析染料和色素。2、1906年，俄国植物学家茨年，俄国植物学家茨维特使用图所示的装置分离维特使用图所示的装置分离绿叶素，柱管是采用碳酸钙，绿叶素，柱管是采用碳酸钙，溶剂加在上端，在地球引力溶剂加在上端，在地球引力的作用下迁移，而组分的检的作用下迁移，而组分的检测则依靠肉眼的观察。测则依靠肉眼的观察。2020多年后，人们又成功多年后，人们又成功地用液相色谱证实了蛋地用液相色谱证实了蛋黄内的叶黄素是植物叶黄内的叶黄素是植物叶黄素和玉米黄的混合物，黄素和玉米黄的混合物，这就是今天制备色谱提这就是今天制备色谱提纯的雏形纯的雏形气相色谱理论的引入第一台液相色谱的诞生液相色谱的现状液相色谱的简史及现状液相色谱的简史及现状（二）（二）19601960年代末世界上第年代末世界上第一台液相色谱诞生，一台液相色谱诞生，开启了液相色谱的时开启了液相色谱的时代。代。采用高压泵输送采用高压泵输送流动相代替重力作用，流动相代替重力作用，使柱效率提高，加快使柱效率提高，加快分析速度；而柱分离分析速度；而柱分离技术与光学检测器相技术与光学检测器相结合也使得液相色谱结合也使得液相色谱由最初的以分离目的由最初的以分离目的为主发展成为可以同为主发展成为可以同时完成时完成分离分析分离分析目的目的的重要分析方法。的重要分析方法。19601960年代，由于气相年代，由于气相色谱对高沸点有机物色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物不易气化的大分子物质，气相色谱的理论质，气相色谱的理论和方法被重新引入经和方法被重新引入经典液相色谱，研制成典液相色谱，研制成功多种细粒度高效填功多种细粒度高效填充柱，大大提高了液充柱，大大提高了液相色谱的分离能力。相色谱的分离能力。1、食品安全、药品安全、环境卫生、生命科学等都需要液相色谱2、液相色谱占全世界分析仪器市场销售总额近20%，而且每年按10%左右的增长率稳步上升。3、液相色谱的发展朝着更加自动化，智能化、和其它仪器联用技术方向发展，比如液相和质谱联用，液相和红外联用，以利于更快速、更准确的定性、定量分析。OUTINABCDLOCKOFF检测器器!BeLOCKOFF自自动进样器器LOCKOFF溶溶剂箱箱高高压泵单元元液相色谱的简史及现状液相色谱的简史及现状（三）（三）液相色谱整体及概念液相色谱整体及概念分析柱分析柱六通阀六通阀检测器检测器废液瓶废液瓶保护柱保护柱流动相在线脱气比例电磁阀输液泵输液泵排放阀混合器液相色谱的流程图梯度篇液相色谱的基本概念（一）液相色谱的基本概念（一）高分离度液相液相色谱的叫法高效液相色谱高压液相色谱高速液相色谱液相色谱的几个重要概念（二）液相色谱的几个重要概念（二）一、液相色谱和气相色谱的区别分析对象分离的形式液相色谱气相色谱 适用分离分子量小的，适用分离分子量小的，挥发性化合物。如蔬菜、挥发性化合物。如蔬菜、水果中有机磷的农药残留，水果中有机磷的农药残留，茶叶中有机氯，引用水中茶叶中有机氯，引用水中三氯甲烷、四氯化碳检测三氯甲烷、四氯化碳检测 适用分离大适用分离大分子量的，低挥分子量的，低挥发性或不挥发、发性或不挥发、热稳定性差的物热稳定性差的物质，如食品添加质，如食品添加剂、色素、苏丹剂、色素、苏丹红等等红等等样品形式 主要是通过改主要是通过改变流动比例，改变流变流动比例，改变流动相的洗脱强度，从动相的洗脱强度，从而达到分离，色谱柱而达到分离，色谱柱最常用的是最常用的是C18C18这一这一类柱，还有氨基柱、类柱，还有氨基柱、氰基柱等，色谱柱种氰基柱等，色谱柱种类少。类少。主要是通过色谱柱的不同极性来进行分离，从非极性到中等极性，再到强极性，做一类样品需要一根专用的色谱柱，所以有很多的色谱柱，使用成本较高。样品形式为：液体样品形式为：液体既可以分析气体，既可以分析气体，也可以分析液体也可以分析液体液相色谱的几个重要概念（三）液相色谱的几个重要概念（三）分析对象固定相区别出峰顺序 常用于分离中常用于分离中等极性和极性等极性和极性较强的化合物较强的化合物（如酚类、胺（如酚类、胺类、羰基类及类、羰基类及氨基酸类等）氨基酸类等）适用于分离非极适用于分离非极性和弱极性的化性和弱极性的化合物，此种色谱合物，此种色谱应用最为广泛，应用最为广泛，它占整个液相色它占整个液相色谱应用的谱应用的80%80%左右。左右。反相色谱正相色谱固定相为极性的，固定相为极性的，流动相为非极性流动相为非极性（如氨基柱、氰基（如氨基柱、氰基柱，流动相为正己柱，流动相为正己烷、环己烷等，常烷、环己烷等，常加入乙醇、异丙醇加入乙醇、异丙醇等以调节组分的保等以调节组分的保留时间留时间固定相为非极性的固定相为非极性的（C18C18、C8C8），流），流动相极性的动相极性的(如水如水或缓冲液，常加入或缓冲液，常加入甲醇、乙腈等有机甲醇、乙腈等有机溶剂调节保留时间溶剂调节保留时间极性大的物质极性大的物质先出峰。先出峰。极性小物质极性小物质先出峰。先出峰。梯度和等度的区别梯度和等度的区别（四）（四）（四）（四）等度模式梯度模式高压梯度和低压梯度的区别高压梯度和低压梯度的区别（五）（五）LOCK OFF!BeLOCK OFFOUTINABCDOUTINABCDLOCK OFF溶溶剂箱箱检测器器柱温箱柱温箱自自动进样器器泵2 泵 1OUTINABCDLOCK OFF检测器器!BeLOCK OFF自自动进样器器LOCK OFF溶溶剂箱箱高高压泵单元元高压梯度低压梯度高压梯度和低压梯度的区别高压梯度和低压梯度的区别（五）（五）高压梯度和低压梯度的区别高压梯度和低压梯度的区别（五）（五）高压梯度LOCK OFF!BeLOCK OFFOUTINABCDOUTINABCDLOCK OFF溶溶剂箱箱检测器器柱温箱柱温箱自自动进样器器泵2 泵 1工作过程采用两个或多个高压泵将采用两个或多个高压泵将不同的溶剂分别增压后输不同的溶剂分别增压后输送到同一个梯度混合器进送到同一个梯度混合器进行混合，混合后的流动相行混合，混合后的流动相再进入进样阀和色谱柱的再进入进样阀和色谱柱的方法。方法。优点优点1 1、可获得任意形式的梯、可获得任意形式的梯度洗脱曲线，精度高。梯度洗脱曲线，精度高。梯度方式度方式 可以是连续的，可以是连续的，也可以是分段台阶式的，也可以是分段台阶式的，还可以是凹形或凸形的，还可以是凹形或凸形的，实际中应用较少。实际中应用较少。2 2、不同组分的溶剂在高、不同组分的溶剂在高压下混合，不易产生气泡，压下混合，不易产生气泡，对流动相的脱气要求相对对流动相的脱气要求相对较低较低缺点：缺点：1 1、高压梯度需使用多台高压输、高压梯度需使用多台高压输液泵，流动相需要变化几种组分液泵，流动相需要变化几种组分即需要几台高压输液泵，即所说即需要几台高压输液泵，即所说的几元梯度，如二元梯度需要两的几元梯度，如二元梯度需要两台输液泵，三元需要三台泵，成台输液泵，三元需要三台泵，成本高。本高。2 2、梯度曲线与设定值可能会、梯度曲线与设定值可能会存在一定的滞后和偏离，因为大存在一定的滞后和偏离，因为大部分液体的压缩性为每增加部分液体的压缩性为每增加105 105 PaPa压力导致压力导致0.01%0.015%0.01%0.015%的体积的体积减小，加上某些溶剂混合时还伴减小，加上某些溶剂混合时还伴随着体积变化，所以会导致梯度随着体积变化，所以会导致梯度曲线与设定值可能会存在一定的曲线与设定值可能会存在一定的滞后和偏离。滞后和偏离。OUTINABCDLOCK OFF检测器器!BeLOCK OFF自自动进样器器LOCK OFF溶溶剂箱箱高高压泵单元元低压梯度高压梯度和低压梯度的区别高压梯度和低压梯度的区别（五）（五）工作过程在常压下，将不同组分的溶剂混合后，再用高压输液泵送入进样阀和色谱柱的方法。优点1 1、采用一台高压输液泵，结合、采用一台高压输液泵，结合电磁比例阀就可以完成多元梯电磁比例阀就可以完成多元梯度洗脱操作，成本大大降低，度洗脱操作，成本大大降低，所以比高压梯度装置的适用性所以比高压梯度装置的适用性强。强。2 2、与高压梯度相比，在流动相、与高压梯度相比，在流动相被加压输入到色谱柱前，不同被加压输入到色谱柱前，不同组分溶剂混合产生的体积变化组分溶剂混合产生的体积变化已完成，可避免高压梯度流动已完成，可避免高压梯度流动相体积变化引起的流量变化。相体积变化引起的流量变化。1 1、采用低压梯度装置时，各流采用低压梯度装置时，各流动相组分混合前需要严格进行脱动相组分混合前需要严格进行脱气，否则混合过程易产生气泡，气，否则混合过程易产生气泡，如加配在线脱气装置可很好解决如加配在线脱气装置可很好解决此问题。此问题。2 2、低压梯度装置同样要求泵和混、低压梯度装置同样要求泵和混合室的死体积尽量小，使梯度变合室的死体积尽量小，使梯度变化更接近于连续变化（低压梯度化更接近于连续变化（低压梯度变化呈台阶式，当每一个台阶很变化呈台阶式，当每一个台阶很小时，可接近连续变化）。小时，可接近连续变化）。缺点液相色谱的关键技术液相色谱的关键技术高压输液泵高压输液泵恒流泵恒流泵恒压泵恒压泵注射型泵注射型泵往复型泵往复型泵双泵头往复双泵头往复式柱塞泵式柱塞泵双柱塞往复双柱塞往复式串联泵式串联泵液相色谱发展的瓶颈-泵是关键泵体材料耐腐蚀泵体材料耐腐蚀泵腔的体积要泵腔的体积要小，以便快小，以便快速更换溶剂速更换溶剂能在高压下连续能在高压下连续工作工作,耐压耐压40-40-50MPa.cm50MPa.cm2 2压力平稳，无压力平稳，无脉冲脉冲高压输液泵高压输液泵输出流量稳定，输出流量稳定，重复性高重复性高,输出输出流量范围宽流量范围宽液相色谱发展的瓶颈-泵是关键液相色谱发展的瓶颈-泵是关键单柱塞泵单柱塞泵双柱塞串联往复泵结构双柱塞串联往复泵结构RR实施压力控制区域高速反馈、实时控制的流量控制技术 系统系统系统系统采用一个高速采用一个高速采用一个高速采用一个高速CPUCPU对内部压力进行实时对内部压力进行实时对内部压力进行实时对内部压力进行实时监控，在柱塞换向的时间区段内，系统压力有下监控，在柱塞换向的时间区段内，系统压力有下监控，在柱塞换向的时间区段内，系统压力有下监控，在柱塞换向的时间区段内，系统压力有下降趋势时快速反馈给降趋势时快速反馈给降趋势时快速反馈给降趋势时快速反馈给CPUCPU，并发出指令使电机加，并发出指令使电机加，并发出指令使电机加，并发出指令使电机加速运转，消除脉动。反之，当系统压力升高时，速运转，消除脉动。反之，当系统压力升高时，速运转，消除脉动。反之，当系统压力升高时，速运转，消除脉动。反之，当系统压力升高时，则电机减慢运转。则电机减慢运转。则电机减慢运转。则电机减慢运转。采用这种技术，可实时补偿溶剂压缩率和单采用这种技术，可实时补偿溶剂压缩率和单采用这种技术，可实时补偿溶剂压缩率和单采用这种技术，可实时补偿溶剂压缩率和单向阀换向时的泄漏引起的压力波动。系统中无须向阀换向时的泄漏引起的压力波动。系统中无须向阀换向时的泄漏引起的压力波动。系统中无须向阀换向时的泄漏引起的压力波动。系统中无须任何缓冲装置，也可以稳定输液。任何缓冲装置，也可以稳定输液。任何缓冲装置，也可以稳定输液。任何缓冲装置，也可以稳定输液。日立传统的日立传统的日立传统的日立传统的HPLCHPLC泵就是采用这种设计，而泵就是采用这种设计，而泵就是采用这种设计，而泵就是采用这种设计，而在在在在L-2000L-2000系列的泵中，这种实时控制方法在较早系列的泵中，这种实时控制方法在较早系列的泵中，这种实时控制方法在较早系列的泵中，这种实时控制方法在较早的时间段就开始执行，以便进一步降低波动。的时间段就开始执行，以便进一步降低波动。的时间段就开始执行，以便进一步降低波动。的时间段就开始执行，以便进一步降低波动。LC2000输液泵采用日立特有输液泵采用日立特有“泵前合流、泵泵前合流、泵后直接混合后直接混合”技术，克服传统概念上低压梯技术，克服传统概念上低压梯度（比例阀梯度）稳定性差的问题。日立比度（比例阀梯度）稳定性差的问题。日立比例阀梯度系统由于是在泵后高压部分进行混例阀梯度系统由于是在泵后高压部分进行混合，不容易产生气泡，稳定性与多泵梯度合，不容易产生气泡，稳定性与多泵梯度（高压梯度或直接混合梯度）相同，同时又（高压梯度或直接混合梯度）相同，同时又具有极高的梯度精度具有极高的梯度精度。泵前合流、泵后直接的比例阀梯度混合技术LC2000液相色谱简介液相色谱简介-LC2130泵泵比例阀、混合器比例阀、混合器泵泵进样阀进样阀检测器检测器低压区低压区低压区低压区 高压区高压区高压区高压区传统低压梯度传统低压梯度传统低压梯度传统低压梯度混合方式混合方式混合方式混合方式 由于在泵前低压状态下进由于在泵前低压状态下进由于在泵前低压状态下进由于在泵前低压状态下进行梯度混合，容易产生气泡，行梯度混合，容易产生气泡，行梯度混合，容易产生气泡，行梯度混合，容易产生气泡，气泡易累积在输液泵中，引起气泡易累积在输液泵中，引起气泡易累积在输液泵中，引起气泡易累积在输液泵中，引起泵输液不稳；同时混合精密度泵输液不稳；同时混合精密度泵输液不稳；同时混合精密度泵输液不稳；同时混合精密度低。低。低。低。泵头泵头比例阀比例阀流通池流通池色谱柱色谱柱混合器混合器进样阀进样阀流动相流动相废液阀废液阀日立最新比例阀梯度混合系统泵后高压状态下混合：不易产生气泡泵后高压状态下混合：不易产生气泡 混合精密度高！混合精密度高！LC2000液相色谱简介液相色谱简介-LC2130泵泵紫外检测器的工作原理紫外检测器的工作原理可变波长的紫外吸收检测器可变波长的紫外吸收检测器LC2000液相色谱简介液相色谱简介 -LC2030检测器检测器比例双光路设计丰富的程序功能符合 GLP/GMP 要求关键元件进口LC2000液相色谱简介液相色谱简介 -LC2030检测器检测器LC2030监测器光路示意图三三 比例双光路设计比例双光路设计 LC2030检测器采用检测器采用双光路设计，可以克双光路设计，可以克服用于电路、光源等服用于电路、光源等的漂移产生的检测器的漂移产生的检测器输出信号变化，提高输出信号变化，提高了仪器的稳定性和样了仪器的稳定性和样品检测能力。品检测能力。LC2000液相色谱简介液相色谱简介 -LC2030检测器检测器四四 功能强大功能强大波长扫描波长扫描 摸索未知组分的检测条件（寻找合摸索未知组分的检测条件（寻找合摸索未知组分的检测条件（寻找合摸索未知组分的检测条件（寻找合 适的检测波长）适的检测波长）适的检测波长）适的检测波长）波长时间程序波长时间程序 为样品中含有不同灵敏响应波长的为样品中含有不同灵敏响应波长的为样品中含有不同灵敏响应波长的为样品中含有不同灵敏响应波长的 组分都能高灵敏检测提供了可能组分都能高灵敏检测提供了可能组分都能高灵敏检测提供了可能组分都能高灵敏检测提供了可能 谱图谱图/程序存储程序存储 波长时间程序、扫描程序可自动保波长时间程序、扫描程序可自动保波长时间程序、扫描程序可自动保波长时间程序、扫描程序可自动保 存、扫描谱图可保存和输出存、扫描谱图可保存和输出存、扫描谱图可保存和输出存、扫描谱图可保存和输出符合符合GLP/GMP 要求要求要求要求 换灯日期、点灯次数、点灯换灯日期、点灯次数、点灯换灯日期、点灯次数、点灯换灯日期、点灯次数、点灯 总时间等都可被自动记录；对基线总时间等都可被自动记录；对基线总时间等都可被自动记录；对基线总时间等都可被自动记录；对基线 噪音、波长准确度等仪器性能可自噪音、波长准确度等仪器性能可自噪音、波长准确度等仪器性能可自噪音、波长准确度等仪器性能可自 动评价动评价动评价动评价 液相色谱的定性、定量方法液相色谱的定性、定量方法色谱峰定性色谱峰定性n n鉴别每个色谱峰n n通过比较保留值通过比较保留值(通常是保留时间通常是保留时间)的方法，找的方法，找到各色谱峰所对应的组份到各色谱峰所对应的组份n n大多数情况下用比较保留时间来定性大多数情况下用比较保留时间来定性即所谓：保留时间相同，可能是同样的组份保留时间相同，可能是同样的组份保留时间不同，肯定不是同样的组份保留时间不同，肯定不是同样的组份用保留时间定性用保留时间定性n n用“标样”的保留值定出被测组份的位置进一步的确认进一步的确认n n标准加入n n同时用其他方法n n其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色谱其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色谱柱）柱）n n其他检测器其他检测器n nPDAPDA，光谱图比较、谱库检索，光谱图比较、谱库检索n nMSMS，质谱图解析、谱库检索，质谱图解析、谱库检索n n其他仪器方法其他仪器方法常用的定量方法常用的定量方法n n峰面积百分比法n n由于检测技术的影响，在液相色谱中不常用由于检测技术的影响，在液相色谱中不常用n n外标法n n在液相色谱中用的最多在液相色谱中用的最多n n内标法n n准确，但是麻烦准确，但是麻烦n n在标准方法中用的最多在标准方法中用的最多外标法定量外标法定量n n配制一系列已知浓度的标样外标法定量（二）外标法定量（二）n n实际色谱图标准曲线外标法定量（三）外标法定量（三）n n计算公式n n特点n n无需各组份都被检出、洗脱无需各组份都被检出、洗脱n n需要标样需要标样n n标样及样品测定的条件要一致标样及样品测定的条件要一致n n进样体积要准确进样体积要准确进样技术对定量结果的影响进样技术对定量结果的影响n n固固定定体体积积定定量量管管（looploop）的的进进样样器器精精度度最最好好，其其准确度取决于进样器的结构准确度取决于进样器的结构n n可可变变体体积积进进样样器器的的精精度度取取决决于于操操作作者者的的技技术术，准准确确度度通通常常更更高高，因因为为进进样样用用的的注注射射器器结结构构的的准准确确度高，操作者的技术水平也有影响，但不大度高，操作者的技术水平也有影响，但不大n nWISPWISP自自动动进进样样器器精精确确度度及及准准确确度度都都可可达达到到定定量量管管进进样样器器的的水水平平，因因为为其其每每一一微微升升分分2727步步以以上上。然然而它又保留了可变体积进样器的优点而它又保留了可变体积进样器的优点内标法定量（一）内标法定量（一）n n配制一系列浓度的标样，其中加有内标样内标法定量（二）内标法定量（二）n n实际色谱图标准曲线内标法定量（三）内标法定量（三）n n计算公式：n n特点：n n无需各组份都被检出、洗脱无需各组份都被检出、洗脱n n需要标样，需要内标样需要标样，需要内标样n n结果与进样体积无关结果与进样体积无关内标法定量（四）内标法定量（四）n n对内标物的要求n n化学结构与待测组分相似化学结构与待测组分相似(同系物、异构体同系物、异构体)n n在样品中不存在在样品中不存在n n不与样品中组份发生任何化学反应不与样品中组份发生任何化学反应n n保留值与待测组分接近保留值与待测组分接近n n浓度（响应值）与待测组分相当浓度（响应值）与待测组分相当n n其色谱峰与其他色谱峰分离好其色谱峰与其他色谱峰分离好峰面积百分比法定量峰面积百分比法定量n n公式：n n特点：n n各组分要全部流出、全部被检测，并对检测器各组分要全部流出、全部被检测，并对检测器的响应值一样简单，液相色谱目前很难做到这的响应值一样简单，液相色谱目前很难做到这点点n n与进样量无关与进样量无关n n不需标样不需标样n n简单简单可接收的检测范围可接收的检测范围n n校正曲线只有在建立这条曲线的浓度范围内有效，高或低于这些点都可能引起计算错误液相色谱定量的精度液相色谱定量的精度n n 测量的精度定量的准确度定量的准确度n n 误差n nE=O-TE=O-Tn nOO 观测到的值观测到的值n nT T 真值真值液相色谱定量精度的计算液相色谱定量精度的计算n n 测量精度的计算准确度的衡量准确度的衡量n n色谱方法是相对定量方法，如不考虑损失及杂质干扰等的因素，其结果同“标样”的准确程度关系密切n n一般的衡量方法是做回收率实验或不同方法之间的比较：相关系数n n相关系数：n n其中，其中，X X及及Y Y分别代表不同方法的实验值及平均值分别代表不同方法的实验值及平均值准确度的影响因素准确度的影响因素n n标样的可靠性及其配制的准确度n n色谱方法的可靠性n n色谱泵的精确度（GPC的影响更大）n n进样器的准确度，进样技术色素、防腐剂分析举例色素、防腐剂分析举例标准解读标准解读日常的使用维护事项日常的使用维护事项液相色谱的流程图（总图）液相色谱的流程图（总图）在线脱气比例电磁阀检测器分析柱混合器六通进样阀流动相排放阀输液泵输液泵预柱预柱废液瓶废液瓶分析柱分析柱六通阀六通阀检测器检测器废液瓶废液瓶保护柱保护柱流动相在线脱气比例电磁阀输液泵输液泵排放阀混合器液相色谱的维护分图梯度篇流动相流动相n n1、试剂的要求1、流动相必须用、流动相必须用HPLC级级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用使用0.45um或更细的膜过滤或更细的膜过滤)。2、流动相过滤后要用超声波、流动相过滤后要用超声波脱气脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。，脱气后应该恢复到室温后使用。1、流流动动相相应应选选用用色色谱谱纯纯试试剂剂、高高纯纯水水或或双双蒸蒸水水，酸酸碱碱液液及及缓缓冲冲液液需需经经过过滤滤后后使使用用，过过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围；滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围；2、水相流动相需经常更换（一般不超过、水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质；天），防止长菌变质；3、溶剂的截至波长、溶剂的截至波长 流动相流动相5 5重新连接色谱柱，设定适当流速，当流动相流出重新连接色谱柱，设定适当流速，当流动相流出约约3030倍于色谱柱体积，并且检测器基线平衡后，倍于色谱柱体积，并且检测器基线平衡后，流动相更换完毕流动相更换完毕流动相的更换流动相的更换更换互溶流动相更换互溶流动相1 1将新流动相置于储液瓶中将新流动相置于储液瓶中2 2打开放空阀，启动泵使新的流动相从入空阀出口打开放空阀，启动泵使新的流动相从入空阀出口流出流出20ml20ml左右左右3 3关闭放空阀，然后将进样阀与色谱柱相连接端卸关闭放空阀，然后将进样阀与色谱柱相连接端卸开，用小容器放置于过样阀的出口处开，用小容器放置于过样阀的出口处4 4启动恒流泵，让流动相从进样阀出口流出启动恒流泵，让流动相从进样阀出口流出10ml10ml左左右右溶剂过滤和超声脱气溶剂过滤和超声脱气溶剂过滤头的清洗溶剂过滤头的清洗1.取下过滤头放在取下过滤头放在(1:4,V/V)的硝酸溶液烧杯中超的硝酸溶液烧杯中超声清洗声清洗15分钟分钟;2.取出后用蒸馏水超声清洗取出后用蒸馏水超声清洗10分钟分钟;3.用吸球吹出过滤头中的液体用吸球吹出过滤头中的液体;4.再用蒸馏水超声清洗再用蒸馏水超声清洗10分钟分钟;5.用吸球吹净过滤头中的水份用吸球吹净过滤头中的水份;6.将过滤头重新插入溶剂瓶中将过滤头重新插入溶剂瓶中(正相系统注意将过正相系统注意将过滤头烘干滤头烘干)流程恒流泵中气泡的排除恒流泵中气泡的排除打开放空阀打开放空阀打开放空阀打开放空阀,开泵开泵开泵开泵,按仪器前面板的按仪器前面板的按仪器前面板的按仪器前面板的”Purge”Purge”Purge”Purge”功能键功能键功能键功能键,用大流量溶剂冲洗系统直到流出的液体连续用大流量溶剂冲洗系统直到流出的液体连续用大流量溶剂冲洗系统直到流出的液体连续用大流量溶剂冲洗系统直到流出的液体连续,证证证证明气泡已经排除明气泡已经排除明气泡已经排除明气泡已经排除;如果用如果用如果用如果用”冲洗冲洗冲洗冲洗”状态仍不能吸液状态仍不能吸液状态仍不能吸液状态仍不能吸液,可以用吸耳球或可以用吸耳球或可以用吸耳球或可以用吸耳球或注射器在排液口抽吸注射器在排液口抽吸注射器在排液口抽吸注射器在排液口抽吸,直至液体流出直至液体流出直至液体流出直至液体流出;如果仍然无液体流出如果仍然无液体流出如果仍然无液体流出如果仍然无液体流出,可能是阀球阀座粘连可能是阀球阀座粘连可能是阀球阀座粘连可能是阀球阀座粘连,取出单取出单取出单取出单向阀向阀向阀向阀,向单向阀两端分别吹气向单向阀两端分别吹气向单向阀两端分别吹气向单向阀两端分别吹气,一通一堵为正常一通一堵为正常一通一堵为正常一通一堵为正常,两两两两端均堵说明阀球座粘连端均堵说明阀球座粘连端均堵说明阀球座粘连端均堵说明阀球座粘连,需清洗阀球阀座需清洗阀球阀座需清洗阀球阀座需清洗阀球阀座.流动相的更换流动相的更换换缓冲液流动相换缓冲液流动相1 1、用水更换色谱系统中缓冲液、用水更换色谱系统中缓冲液2 2、用水含水量量、用水含水量量10%60%10%60%范围的溶剂冲洗色范围的溶剂冲洗色谱柱中的盐谱柱中的盐3 3、用新流动相更换水或冲洗色谱柱溶剂、用新流动相更换水或冲洗色谱柱溶剂流程样品准备样品准备单向阀的清洗单向阀的清洗排放阀清洗排放阀清洗滤头清洗滤头清洗泄露传感器的安装位置泄露传感器的安装位置色谱柱的保养色谱柱的保养良好的色谱实验习惯良好的色谱实验习惯n n拿到一根新色谱柱时，先测柱效n n保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件n n定期检测柱效n n定期检测仪器的谱带展宽色谱柱的使用及操作色谱柱的使用及操作n n流动相的转换n n特别是特别是GPCGPC柱柱n n流速(压力)的变化幅度n n温度的变化幅度n n专用色谱柱样品及溶剂的要求色谱柱的保养（一）色谱柱的保养（一）n n样品方面n n除去微粒及杂质除去微粒及杂质n n了解样品在流动相中的溶解度了解样品在流动相中的溶解度n n如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出止其在流动相中析出 n n了解样品与色谱柱的基质了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用填料是否相互作用色谱柱的保养（二）色谱柱的保养（二）n n流动相方面n n除去微粒除去微粒n n纯度的要求纯度的要求n n超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低n n缓冲液的缓冲液的pHpH值，在填料的允许范围内值，在填料的允许范围内n n缓冲液（盐）的浓度缓冲液（盐）的浓度n n溶剂：色谱纯，并与填料相匹配溶剂：色谱纯，并与填料相匹配n n溶剂中的杂质含量溶剂中的杂质含量n n流动相对样品的溶解度流动相对样品的溶解度n n有机溶剂或水的比例有机溶剂或水的比例可换芯式保护柱可换芯式保护柱色谱柱的清洗色谱柱的清洗n n对所做的样品要有充分的了解n n用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗n n硅胶柱的一般方法n n先用甲醇洗去极性杂质先用甲醇洗去极性杂质n n用干燥的二氯甲烷、正庚烷用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml100200ml依次活化依次活化n n键合相柱(烷基)的一般方法n n2020倍柱体积的：甲醇倍柱体积的：甲醇-氯仿氯仿-甲醇甲醇-水依次冲洗水依次冲洗色谱柱的存放色谱柱的存放n n存放前的处理n n除去杂质、盐除去杂质、盐 n n合适的存放溶剂n n避免色谱柱床的干枯n n避免机械震动n n防止细菌生长n n注意存放的温度色谱柱常见毛病色谱柱常见毛病n n柱压过高n n多少才算高多少才算高?n n不同色谱柱有差异不同色谱柱有差异n n不同系统有差异不同系统有差异n n不同溶剂有差异不同溶剂有差异n n柱效低n n重复性差n n不出峰，回收率低柱压过高柱压过高n n 为什么柱压会过高n n微粒堵塞微粒堵塞n n样品样品n n流动相流动相n n密封垫密封垫n n柱床膨胀柱床膨胀n n不可逆吸附不可逆吸附n n细菌生长细菌生长柱效低柱效低n n为什么柱效低n n色谱柱被污染色谱柱被污染n n过滤片部分堵塞过滤片部分堵塞n n样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞n n色谱柱内的死体积色谱柱内的死体积n n流动相流动相pHpH值及组成不合适造成固定相流失值及组成不合适造成固定相流失n n流速急剧变化造成固定相物理损坏流速急剧变化造成固定相物理损坏n n机械震动造成固定相产生裂缝机械震动造成固定相产生裂缝n n柱床收缩或干枯柱床收缩或干枯重复性差、回收率低重复性差、回收率低n n实验的重复性差n n色谱柱被污染色谱柱被污染n n流动相流动相pHpH值及组成不合适造成键合相流失值及组成不合适造成键合相流失n n样品溶剂不同或样品本身不稳定样品溶剂不同或样品本身不稳定n n回收率低，不出峰n n“不可逆不可逆”吸附吸附n n固定相过强或流动相过弱固定相过强或流动相过弱n n非特异性吸附非特异性吸附色谱柱以外的因素（一）色谱柱以外的因素（一）n n“柱效”问题，不一定是色谱柱问题！n n仪器问题：连接不好造成死体积仪器问题：连接不好造成死体积n n进样器进样器n n检测器检测器n n管路，连接口管路，连接口n n保护柱保护柱n n在线过滤器堵塞在线过滤器堵塞n n流动相问题：色谱柱未平衡好流动相问题：色谱柱未平衡好n n进样量太大进样量太大不同的不同的Stop-Depth长度长度色谱柱以外的因素（二）色谱柱以外的因素（二）n n柱压过高问题，不一定是色谱柱问题！n n系统反压问题系统反压问题n n阻尼器堵塞阻尼器堵塞n n进样器堵塞进样器堵塞n n管路或连接口堵塞管路或连接口堵塞n n在线过滤器不干净在线过滤器不干净n n保护柱保护柱n n压力传感器不准确压力传感器不准确n n流速是否错误流速是否错误?色谱柱以外的因素（三）色谱柱以外的因素（三）n n实验的重复性差n n梯度实验时平衡时间不足梯度实验时平衡时间不足n n温度波动温度波动n n流动相组成改变流动相组成改变n n样品溶剂不同样品溶剂不同n n样品稳定性不好样品稳定性不好n n方法的开发不好方法的开发不好n n缓冲液的缓冲液的pHpH值不合适值不合适n n缓冲液的缓冲能力不足缓冲液的缓冲能力不足简单的判别方法简单的判别方法n n高的柱反压是否伴随着n n保留时间变化保留时间变化?n n峰形变坏峰形变坏?n n分辨率变坏分辨率变坏?n n测量色谱系统的谱带展宽n n典型的分析系统应远小于典型的分析系统应远小于 100 100 微升微升n n如大于此数应检查仪器系统如大于此数应检查仪器系统常见问题的处理常见问题的处理85一、一、保留时间变化保留时间变化1.1.1.1.柱温变化柱温变化柱温变化柱温变化2.2.2.2.等度与梯度间未能充分平衡等度与梯度间未能充分平衡等度与梯度间未能充分平衡等度与梯度间未能充分平衡3.3.3.3.缓冲液容量不够缓冲液容量不够缓冲液容量不够缓冲液容量不够4.4.4.4.柱污染柱污染柱污染柱污染5.5.5.5.柱内条件变化柱内条件变化柱内条件变化柱内条件变化6.6.6.6.柱快达到寿命柱快达到寿命柱快达到寿命柱快达到寿命1.柱恒温2.至少用10倍柱体积的流动相平衡柱3.用25mmol/L的缓冲液4.每天冲洗柱5.稳定进样条件,调节流动相6.采用保护柱86二、二、保留时间缩短保留时间缩短 1.1.1.1.流速增加流速增加流速增加流速增加2.2.2.2.样品超载样品超载样品超载样品超载3.3.3.3.键合相流失键合相流失键合相流失键合相流失4.4.4.4.流动相组成变化流动相组成变化流动相组成变化流动相组成变化5.5.5.5.温度增加温度增加温度增加温度增加1.检查泵,重新设定流速2.降低样品量3.流 动 相 PH值 保 持 在37.5检查柱的方向4.防止流动相蒸发或沉淀5.柱恒温87三、三、保留时间延长保留时间延长 1.1.1.1.流速下降流速下降流速下降流速下降2.2.2.2.硅胶柱上活性点变化硅胶柱上活性点变化硅胶柱上活性点变化硅胶柱上活性点变化3.3.3.3.键合相流失键合相流失键合相流失键合相流失4.4.4.4.流动相组成变化流动相组成变化流动相组成变化流动相组成变化5.5.5.5.温度降低温度降低温度降低温度降低1.管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡2.用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱3.流动相PH值保持在37.5检查柱的方向4.防止流动相蒸发或沉淀5.柱恒温88四四、出现肩峰或分叉出现肩峰或分叉 1.样品体积过大2.样品溶剂过强3.柱塌陷或形成短路通道4.柱内烧结不锈钢失效5.进样器损坏1.用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.采用较弱的样品溶剂3.更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4.更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.更换进样器转子89五、五、鬼峰鬼峰 1.1.1.1.进样阀残余峰进样阀残余峰进样阀残余峰进样阀残余峰2.2.2.2.样品中未知物样品中未知物样品中未知物样品中未知物3.3.3.3.柱未平衡柱未平衡柱未平衡柱未平衡4.4.4.4.三氟乙酸三氟乙酸三氟乙酸三氟乙酸(TFA)(TFA)(TFA)(TFA)氧化氧化氧化氧化(肽谱肽谱肽谱肽谱)5.5.5.5.水污染水污染水污染水污染(反相反相反相反相)1.每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗2.处理样品3.重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱)4.每天新配,用抗氧化剂5.通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水90六、六、基线噪声基线噪声 1.1.1.1.气泡气泡气泡气泡(尖锐峰尖锐峰尖锐峰尖锐峰)2.2.2.2.污染污染污染污染(随机噪声随机噪声随机噪声随机噪声)3.3.3.3.检测器灯连续噪声检测器灯连续噪声检测器灯连续噪声检测器灯连续噪声4.4.4.4.电干扰电干扰电干扰电干扰(偶然噪声偶然噪声偶然噪声偶然噪声)5.5.5.5.检测器中有气泡检测器中有气泡检测器中有气泡检测器中有气泡1.流动相脱气,加柱后背压2.清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂3.更换氘灯4.采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)5.流动相脱气,加柱后背压91七、七、峰拖尾峰拖尾 1.1.1.1.柱超载柱超载柱超载柱超载2.2.2.2.峰干扰峰干扰峰干扰峰干扰3.3.3.3.硅羟基作用硅羟基作用硅羟基作用硅羟基作用4.4.4.4.柱内烧结不锈钢失效柱内烧结不锈钢失效柱内烧结不锈钢失效柱内烧结不锈钢失效5.5.5.5.柱塌陷或形成短路通道柱塌陷或形成短路通道柱塌陷或形成短路通道柱塌陷或形成短路通道6.6.6.6.死体积或柱外体积过大死体积或柱外体积过大死体积或柱外体积过大死体积或柱外体积过大7.7.7.7.柱效下降柱效下降柱效下降柱效下降1.降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相2.清洁样品,调整流动相3.加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品4.更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件6.连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管7.用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱92八、八、峰展宽峰展宽 1.1.1.1.进样体积过大进样体积过大进样体积过大进样体积过大2.2.2.2.在进样阀中造成峰扩展在进样阀中造成峰扩展在进样阀中造成峰扩展在进样阀中造成峰扩展3.3.3.3.数据系统采样速率太慢数据系统采样速率太慢数据系统采样速率太慢数据系统采样速率太慢4.4.4.4.检测器时间常数过大检测器时间常数过大检测器时间常数过大检测器时间常数过大1.用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.进样前后排出气泡以降低扩散3.设定速率应是每峰大于10点4.设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%93八、八、峰展宽峰展宽5.5.5.5.流动相粘度过高流动相粘度过高流动相粘度过高流动相粘