复习DNA重组技术的基本工具.pptx

一、基因工程的概念理解一、基因工程的概念理解1.1.供体：提供供体：提供_2.2.操作环境：操作环境：_3.3.操作水平：操作水平：_4.4.原理：原理：_5.5.受体：表达目的基因受体：表达目的基因6.6.本质：性状在本质：性状在_体内表达体内表达7.7.优点：克服优点：克服_障碍，定向障碍，定向改造生物改造生物_目的基因目的基因体外体外分子水平分子水平基因重组基因重组受体受体远缘杂交不亲和远缘杂交不亲和性状性状一、基因工程诞生的理论基础一、基因工程诞生的理论基础1 1基因拼接的理论基础基因拼接的理论基础(1)DNA(1)DNA是生物的主要遗传物质。是生物的主要遗传物质。(2)DNA(2)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。酸。(3)(3)双链双链DNADNA分子的空间结构都是规则的双分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。螺旋结构。化学本质相同，都是化学本质相同，都是DNADNA；基因与；基因与质粒质粒的的结构相同结构相同 2外源基因在受体内表达的理论基础外源基因在受体内表达的理论基础(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。基因是控制生物性状的独立遗传单位。(2)遗传信息的传递都遵循中心法则阐述遗传信息的传递都遵循中心法则阐述的信息流动方向。的信息流动方向。(3)生物界共用一套遗传密码。生物界共用一套遗传密码。胰岛素胰岛素基因重组基因重组后能在细菌细胞内表达，后能在细菌细胞内表达，还说明所有生物共用一套还说明所有生物共用一套遗传密码遗传密码 二、二、DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具1.1.限制性核酸内切酶（简称：限制酶）限制性核酸内切酶（简称：限制酶）（1 1）来源：主要从）来源：主要从_生物中分离纯化生物中分离纯化出来。出来。议一议：限制酶主要存在于原核生物中，它议一议：限制酶主要存在于原核生物中，它有什么意义？答案：有什么意义？答案：限制酶在原核生物中主限制酶在原核生物中主要是切割外源要是切割外源DNADNA，使之失效，从而达到保，使之失效，从而达到保护自己的目的。护自己的目的。原核原核（2 2）作用：识别特定的）作用：识别特定的_并切开并切开相应两个核苷酸之间的相应两个核苷酸之间的_。核苷酸序列核苷酸序列磷酸二酯键磷酸二酯键（3 3）结果：产生）结果：产生_或平末端。或平末端。黏性末端黏性末端2.DNA2.DNA连接酶连接酶（1 1）种类：按来源可分为）种类：按来源可分为E EcoliDNAcoliDNA连接酶连接酶和和T4DNAT4DNA连接酶。连接酶。（2 2）作用：在两个核苷酸之间形成）作用：在两个核苷酸之间形成_以连接以连接_。两段两段DNADNA片段片段磷酸二酯键磷酸二酯键3.3.载体载体（1 1）种类：）种类：_、噬菌体的衍生物、动噬菌体的衍生物、动植物病毒等。植物病毒等。能能_ 有一个至多个有一个至多个_ 有特殊的有特殊的_【点拨点拨】提取目的基因和切割载体使用同一提取目的基因和切割载体使用同一种限制酶，目的是能形成相同的黏性末端，种限制酶，目的是能形成相同的黏性末端，形成重组形成重组DNADNA分子。分子。质粒质粒自我复制自我复制限制酶切割位点限制酶切割位点标记基因标记基因2 2）质粒）质粒 特点特点(3)作用：作用：作为运载工具，将目的基因作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。转移到宿主细胞内。利用它在宿主细胞内对目的基因进行利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。大量复制。(4)一般来说，天然载体往往不能满足人一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。改造。基因工程的工具基因工程的工具1.1.与与DNADNA相关的酶（相关的酶（1 1）五种）五种DNADNA相关酶的比较：相关酶的比较：作用底物作用底物作用部位作用部位形成产物形成产物限制酶限制酶DNADNA连连接酶接酶DNADNA聚聚合酶合酶DNADNA解解旋酶旋酶DNADNA分子分子磷酸二酯键磷酸二酯键黏性末端或黏性末端或平末端平末端DNADNA片段片段磷酸二酯键磷酸二酯键重组重组DNADNA分子分子脱氧核苷脱氧核苷酸酸磷酸二酯键磷酸二酯键子代子代DNADNADNADNA分子分子DNADNA分子分子碱基对间的氢键碱基对间的氢键磷酸二酯键磷酸二酯键形成脱氧核形成脱氧核苷酸单链苷酸单链游离的脱氧游离的脱氧核苷酸核苷酸DNA(DNA(水水解解)酶酶（2 2）限制酶和）限制酶和DNADNA连接酶之间的关系图示：连接酶之间的关系图示：2.2.作为载体的条件作为载体的条件条件条件适应性适应性稳定并能复制稳定并能复制目的基因稳定存在且数量目的基因稳定存在且数量可扩大可扩大有一个至多个限制有一个至多个限制酶切割位点酶切割位点可携带多个或多种外源基可携带多个或多种外源基因因具有特殊的标记基具有特殊的标记基因因便于重组便于重组DNADNA的鉴定和选的鉴定和选择择【高考警示钟高考警示钟】1.1.切割切割质粒质粒需使用需使用限制酶限制酶1 1次次，切割目的基因则需，切割目的基因则需要使用相同的要使用相同的限制酶限制酶2 2次次。因为质粒是环状。因为质粒是环状DNADNA，而，而目的基因在目的基因在DNADNA分子链上。分子链上。2.2.质粒质粒DNADNA分子上限制酶切割位点的选择必须保证分子上限制酶切割位点的选择必须保证至少有一个标记基因是完整的至少有一个标记基因是完整的，如果标记基因全部，如果标记基因全部被切开则不便于鉴定与选择。被切开则不便于鉴定与选择。3.3.基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同，同，基因工程中的载体是基因工程中的载体是DNADNA分子分子，能将目的基因，能将目的基因导入受体细胞内，导入受体细胞内，膜载体是蛋白质膜载体是蛋白质，与细胞膜的通，与细胞膜的通透性有关。透性有关。【典例训练典例训练1 1】我国科学家成功克隆了控制水稻我国科学家成功克隆了控制水稻理想株型的关键多效基因理想株型的关键多效基因IPA1IPA1。研究发现，基因。研究发现，基因IPA1IPA1发生突变后，会使水稻穗粒数和千粒重（以发生突变后，会使水稻穗粒数和千粒重（以克表示的一千粒种子的重量）增加，同时茎秆变克表示的一千粒种子的重量）增加，同时茎秆变得粗壮，增加了抗倒伏能力。实验显示，将突变得粗壮，增加了抗倒伏能力。实验显示，将突变后的后的IPA1IPA1基因导入常规水稻品种，可以使其产量基因导入常规水稻品种，可以使其产量增加增加1010以上。下图表示该水稻新品种的简易培以上。下图表示该水稻新品种的简易培育流程，据图回答：育流程，据图回答：（1 1）上图所示流程中步骤）上图所示流程中步骤是实验所用技术的核是实验所用技术的核心步骤。此步骤使心步骤。此步骤使_ _ 和和_构成构成_，常用的工具酶，常用的工具酶是是_。突变的突变的IPA1IPA1基因基因TiTi质粒质粒重组重组DNADNA限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶、DNADNA连接酶连接酶（2 2）若要在体外扩增）若要在体外扩增IPA1IPA1基因可采用基因可采用PCRPCR技术。标技术。标准的准的PCRPCR过程分为三个步骤，第一步是过程分为三个步骤，第一步是“变性变性”即即解旋，这一步骤如果发生在细胞内，是在解旋，这一步骤如果发生在细胞内，是在_的作用下完成的的作用下完成的（3 3）从变异类型上分析，该水稻的新性状应该属）从变异类型上分析，该水稻的新性状应该属于可遗传变异中的于可遗传变异中的_ 。（4 4）过程应用的主要生物技术是过程应用的主要生物技术是_。DNADNA解旋酶解旋酶基因重组基因重组植物组织培养植物组织培养【解析解析】图中图中为基因表达载体的构建，把目的基因和载体用为基因表达载体的构建，把目的基因和载体用同种限制性核酸内切酶切割，在同种限制性核酸内切酶切割，在DNADNA连接酶的作用下，构成重组连接酶的作用下，构成重组质粒；质粒；PCRPCR过程中第一步的变性就是过程中第一步的变性就是“解旋解旋”，在体外是通过加，在体外是通过加热使热使DNADNA解旋，在细胞内则是在解旋，在细胞内则是在DNADNA解旋酶的作用下完成的；基解旋酶的作用下完成的；基因突变发生于重组前，重组细胞中组合的是突变后的因突变发生于重组前，重组细胞中组合的是突变后的IPA1IPA1基因基因与水稻与水稻DNADNA；过程为胚细胞发育成植株的过程，应用的技术为过程为胚细胞发育成植株的过程，应用的技术为植物组织培养技术。植物组织培养技术。答案：答案：（1 1）（重组质粒）（重组质粒）（2 2）（3 3）（）（4 4）【解题指南解题指南】1.1.知识储备知识储备熟悉熟悉DNADNA重组技术操作过程需要的工重组技术操作过程需要的工具，包括相关的酶和载体，及相关具，包括相关的酶和载体，及相关酶的作用特点。酶的作用特点。2.2.解题思路解题思路（1 1）首先明确目的基因与载体形成）首先明确目的基因与载体形成重组质粒的过程需用的酶及重组质粒的过程需用的酶及 该过程的原理；该过程的原理；（2 2）明确由胚细胞发育成完整植株）明确由胚细胞发育成完整植株所用的生物技术。所用的生物技术。三、基因工程的基本操作程序三、基因工程的基本操作程序1.1.目的基因的获取目的基因的获取（1 1）目的基因：编码蛋白质的）目的基因：编码蛋白质的_。从从_中获取中获取（2 2）获取方法）获取方法 利用利用_扩增目的基因扩增目的基因 通过通过_用化学方法直接用化学方法直接 人工合成人工合成 基因基因基因文库基因文库PCRPCR技术技术DNADNA合成仪合成仪2.2.基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因工程的核心基因工程的核心（1 1）由图可知载体的组成：）由图可知载体的组成：_、启动子、终止子、启动子、终止子、_ _ _。（2 2）构建目的：）构建目的：使使_在在_中稳定存在，并且可以遗传给下一代；中稳定存在，并且可以遗传给下一代；使使_能够表达和发挥作用。能够表达和发挥作用。目的基因目的基因标记标记基因基因目的基因目的基因目的基因目的基因受体细胞受体细胞3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞（1 1）转化）转化:目的基因进入受体细胞内目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持并且在受体细胞内维持_的过程。的过程。（2 2）常用方法）常用方法 ：导入植物细胞导入植物细胞:_:_、基因枪法、花粉管通、基因枪法、花粉管通 道法道法 导入动物细胞导入动物细胞:_:_ 导入微生物细胞导入微生物细胞:感受态细胞法（或感受态细胞法（或CaCa2+2+处理法）处理法）稳定和表达稳定和表达农杆菌转化法农杆菌转化法显微注射技术显微注射技术4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定（1 1）_目的基因的有无目的基因的有无（2 2）分子杂交技术）分子杂交技术_（3 3）_目的基因是否翻译目的基因是否翻译（4 4）生物性状的表达与否）生物性状的表达与否目的基因是否表达（个体水平）目的基因是否表达（个体水平）【点拨点拨】启动子、终止子与起始密码子、终止密码子不同：启动启动子、终止子与起始密码子、终止密码子不同：启动子、终止子在子、终止子在DNA DNA 上上,在遗传信息转录时起调控作用；而起始密码在遗传信息转录时起调控作用；而起始密码子、终止密码子在子、终止密码子在mRNAmRNA上上,在翻译时起作用在翻译时起作用,决定翻译的开始和结决定翻译的开始和结束。束。分分子子水水平平DNADNA分子杂交技术分子杂交技术目的基因是否转录目的基因是否转录抗原抗原抗体杂交抗体杂交 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.1.目的基因的获取目的基因的获取（1 1）从基因文库中获取目的基因：如从基因组文库或）从基因文库中获取目的基因：如从基因组文库或cDNAcDNA文库文库 中获取。中获取。（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基因：利用技术扩增目的基因：利用DNADNA复制的原理在体外特复制的原理在体外特 异性的复制某异性的复制某DNADNA片段以获得呈指数方式增加的目的基因。片段以获得呈指数方式增加的目的基因。（3 3）人工合成法：通过）人工合成法：通过DNADNA合成仪用化学方法直接人工合成。合成仪用化学方法直接人工合成。2.2.基因表达载体的构建基因表达载体的构建（1 1）基因表达载体组成：）基因表达载体组成：启动子、终止子启动子、终止子:是基因转录的起点和终点，在转录过程中是基因转录的起点和终点，在转录过程中 起调控作用。起调控作用。标记基因标记基因:作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从从 而将含有目的基因的细胞筛选出来而将含有目的基因的细胞筛选出来,如抗生素抗性基因。如抗生素抗性基因。目的基因：能控制特定性状的外源基因。目的基因：能控制特定性状的外源基因。（2 2）基因表达载体的构建步骤：）基因表达载体的构建步骤：载体载体(质粒质粒)同一种限制酶切割同一种限制酶切割带有黏性带有黏性末端切口末端切口带有相同黏性末端带有相同黏性末端的目的基因片段的目的基因片段重组重组DNA(DNA(环状重组质粒环状重组质粒)DNADNA连接酶连接酶DNADNA分子分子(含目的基因含目的基因)3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞生物种类生物种类植物植物动物动物微生物微生物常用方法常用方法受体细胞受体细胞转化过程转化过程农杆菌转化法农杆菌转化法显微注射技术显微注射技术感受态细胞法感受态细胞法体细胞体细胞受精卵受精卵原核细胞原核细胞将目的基因插将目的基因插入到入到TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA上上农农杆菌杆菌导入植导入植物细胞物细胞整合整合到受体细胞的到受体细胞的DNADNA上上表达表达将含有目的基将含有目的基因的表达载体因的表达载体提纯提纯取卵取卵(受受精卵精卵)显微注显微注射射受精卵发受精卵发育育获得具有获得具有新性状的动物新性状的动物CaCa2+2+处理细处理细胞胞感受态细感受态细胞胞重组表达重组表达载体载体DNADNA分子分子与感受态细与感受态细胞混合胞混合感感受态细胞吸受态细胞吸收收DNADNA分子分子4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定【高考警示钟高考警示钟】1.1.目的基因的插入位点不是随意的目的基因的插入位点不是随意的基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。启动子与终止子之间的部位。2.2.基因工程操作过程中第三步没有碱基互补配对现象基因工程操作过程中第三步没有碱基互补配对现象第一步存在逆转录法获得第一步存在逆转录法获得DNADNA，第二步存在黏性末端连接现象，第二步存在黏性末端连接现象，第四步检测存在分子水平杂交方法。第四步检测存在分子水平杂交方法。【典例训练典例训练2 2】（20112011山东高考改编）人类疾病的转基因动物山东高考改编）人类疾病的转基因动物模型常用于致病机理的探讨及治疗药物的筛选。利用正常大鼠模型常用于致病机理的探讨及治疗药物的筛选。利用正常大鼠制备遗传性高血压转基因模型大鼠的流程如图所示。制备遗传性高血压转基因模型大鼠的流程如图所示。（1 1）图中的高血压相关基因作为）图中的高血压相关基因作为_，质粒作为，质粒作为_，二者需用二者需用_切割后连接成重组载体，该过程与质粒上切割后连接成重组载体，该过程与质粒上 含有含有_有关。有关。（2 2）重组）重组DNADNA导入的受体细胞是大鼠的导入的受体细胞是大鼠的_细胞，常用的细胞，常用的 方法是方法是_。在。在DNADNA重组过程中核心的操作是重组过程中核心的操作是_。（3 3）子代大鼠如果）子代大鼠如果_和和_，即可分别在分子，即可分别在分子 水平和个体水平上说明高血压相关基因已成功表达，然后可用水平和个体水平上说明高血压相关基因已成功表达，然后可用 其建立高血压转基因动物模型。其建立高血压转基因动物模型。（4 4）在上述转基因大鼠的培育过程中，所用到的主要胚胎工程）在上述转基因大鼠的培育过程中，所用到的主要胚胎工程 技术是体外受精、早期胚胎培养和技术是体外受精、早期胚胎培养和_。【解题指南解题指南】1.1.考查实质考查实质本题主要考查基因工程的操作程序，涉及到胚胎工程技术。本题主要考查基因工程的操作程序，涉及到胚胎工程技术。2.2.解题关键解题关键高血压相关基因与质粒形成重组高血压相关基因与质粒形成重组DNADNA后导入到受精卵细胞中，是后导入到受精卵细胞中，是DNADNA重组技术。重组技术。【解析解析】（1 1）根据题干中）根据题干中“利用正常大鼠制备遗传性高血压转基利用正常大鼠制备遗传性高血压转基因模型大鼠因模型大鼠”推出，目的基因为与高血压相关的基因。为使目的基推出，目的基因为与高血压相关的基因。为使目的基因与载体结合需用同一种限制性核酸内切酶切割。因与载体结合需用同一种限制性核酸内切酶切割。（2 2）重组）重组DNADNA分子导入受体细胞中，植物细胞、动物细胞和微生物分子导入受体细胞中，植物细胞、动物细胞和微生物细胞导入目的基因的方式不同，动物细胞主要用显微注射技术将重细胞导入目的基因的方式不同，动物细胞主要用显微注射技术将重组组DNADNA分子导入细胞中。基因工程操作的第二步，即基因表达载体分子导入细胞中。基因工程操作的第二步，即基因表达载体的构建是整个过程中的关键。的构建是整个过程中的关键。（3 3）如果检测到相应蛋白质，即可在分子水平说明目的基因已）如果检测到相应蛋白质，即可在分子水平说明目的基因已经表达，如果检测子代大鼠已患高血压，即可在个体水平说明经表达，如果检测子代大鼠已患高血压，即可在个体水平说明目的基因已经表达。目的基因已经表达。(4)(4)在上述转基因大鼠的培育过程中，所用到的主要胚胎工程在上述转基因大鼠的培育过程中，所用到的主要胚胎工程技术是体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植。早期胚胎需要移技术是体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植。早期胚胎需要移植入体内，以提供一个稳定的环境和充足的营养供应。植入体内，以提供一个稳定的环境和充足的营养供应。答案：答案：（1 1）目的基因）目的基因 载体载体 同一种限制性核酸内切酶同一种限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的切割位点限制性核酸内切酶的切割位点（2 2）受精卵）受精卵 显微注射技术显微注射技术 基因表达载体的构建基因表达载体的构建（3 3）检测到相应蛋白质）检测到相应蛋白质已患高血压已患高血压（4 4）胚胎移植）胚胎移植1.1.（20122012福州模拟）浙江大学农学院喻景权教授的课题组最福州模拟）浙江大学农学院喻景权教授的课题组最新研究发现，一种植物激素新研究发现，一种植物激素油菜素内酯能促进农药在植物油菜素内酯能促进农药在植物体内的降解和代谢。研究人员发现，用油菜素内酯处理后，许体内的降解和代谢。研究人员发现，用油菜素内酯处理后，许多参与农药降解的基因多参与农药降解的基因(如如P450P450和和GsT)GsT)的表达和酶活性都得到提的表达和酶活性都得到提高，在这些基因的高，在这些基因的“指导指导”下合成的蛋白酶能把农药逐渐转化下合成的蛋白酶能把农药逐渐转化为水溶性物质或低毒无毒物质，有的则被直接排出体外。某课为水溶性物质或低毒无毒物质，有的则被直接排出体外。某课题组进一步进行了如下的实验操作，请回答：题组进一步进行了如下的实验操作，请回答：（1 1）获得油菜素内酯基因的方法有）获得油菜素内酯基因的方法有_（举二项即（举二项即可）。第可）。第步用步用PCRPCR技术扩增基因时用到的耐高温的酶通常是指技术扩增基因时用到的耐高温的酶通常是指_。步骤。步骤用到的酶有用到的酶有_。（2 2）图中导入重组质粒的方法是）图中导入重组质粒的方法是_。在导入之前。在导入之前 应用应用_处理。处理。（3 3）导入重组质粒以后，往往还需要进行检测和筛选，可用）导入重组质粒以后，往往还需要进行检测和筛选，可用 _制成探针，检测是否导入了重组基因；在培养制成探针，检测是否导入了重组基因；在培养 基中加入基中加入_可将含有目的基因的细胞筛选出来。可将含有目的基因的细胞筛选出来。（4 4）请你为该课题命名）请你为该课题命名_。（5 5）请你说说该研究发现的生态学意义：）请你说说该研究发现的生态学意义：_ _ _。【解析解析】（1 1）油菜素内酯基因是目的基因，获得目的基因的方）油菜素内酯基因是目的基因，获得目的基因的方法有：从法有：从cDNAcDNA文库中获取、从基因文库中获取、人工合成目的基文库中获取、从基因文库中获取、人工合成目的基因或利用因或利用PCRPCR技术扩增等。技术扩增等。PCRPCR技术中耐高温的酶是技术中耐高温的酶是DNADNA聚合酶聚合酶（TaqTaq酶）。步骤酶）。步骤是对质粒进行剪切和拼接，要用到限制酶和是对质粒进行剪切和拼接，要用到限制酶和DNADNA连接酶。（连接酶。（2 2）将重组质粒导入受体细菌中，采用）将重组质粒导入受体细菌中，采用CaCa2+2+转化转化法，导入前应用法，导入前应用CaClCaCl2 2溶液处理，成为感受态细胞，增加受体细溶液处理，成为感受态细胞，增加受体细菌细胞壁的通透性。（菌细胞壁的通透性。（3 3）对目的基因进行检测和筛选中应用红）对目的基因进行检测和筛选中应用红霉素抗性基因制成探针，检测是否导入重组基因；为筛选出含有霉素抗性基因制成探针，检测是否导入重组基因；为筛选出含有目的基因的细胞可在培养基中加入红霉素。（目的基因的细胞可在培养基中加入红霉素。（4 4）课题命名可以）课题命名可以是：探究油菜素内酯能否促进土壤中农药的分解。（是：探究油菜素内酯能否促进土壤中农药的分解。（5 5）该项研该项研 究的意义：加速农药的分解，降低植物体内的农药含量，有利究的意义：加速农药的分解，降低植物体内的农药含量，有利于环境保护和人体健康。于环境保护和人体健康。答案：答案：（1 1）从）从cDNAcDNA文库中获取、从基因文库中获取、人工合成文库中获取、从基因文库中获取、人工合成目的基因或利用目的基因或利用PCRPCR技术扩增（任答两项即可）技术扩增（任答两项即可）TaqTaq酶酶 限制酶和限制酶和DNADNA连接酶连接酶（2 2）CaCa2+2+转化法转化法 氯化钙溶液氯化钙溶液（3 3）红霉素抗性基因）红霉素抗性基因红霉素红霉素 （4 4）探究油菜素内酯能否促进土壤中农药的分解）探究油菜素内酯能否促进土壤中农药的分解（5 5）加速农药的分解，降低植物体内的农药含量，有利于环境保）加速农药的分解，降低植物体内的农药含量，有利于环境保护和人体健康护和人体健康2.(20102.(2010福建高考福建高考)红细胞生成素（红细胞生成素（EPOEPO）是体内促进红细胞生）是体内促进红细胞生成的一种糖蛋白，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然成的一种糖蛋白，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPOEPO来源极为有限，目前临床使用的红细胞生成素主要来自于基因来源极为有限，目前临床使用的红细胞生成素主要来自于基因工程技术生产的重组人红细胞生成素（工程技术生产的重组人红细胞生成素（rhEPOrhEPO），其简要生产流），其简要生产流程如图。程如图。请回答：请回答：（1 1）图中）图中所指的是所指的是_技术。技术。（2 2）图中）图中所指的物质是所指的物质是_，所指的物质是所指的物质是 _。（3 3）培养重组）培养重组CHO CHO 细胞时，为便于清除代谢产物，防止细胞产细胞时，为便于清除代谢产物，防止细胞产 物积累对细胞自身造成危害，应定期更换物积累对细胞自身造成危害，应定期更换_。（4 4）检测）检测 rhEPOrhEPO的体外活性需用抗的体外活性需用抗rhEPOrhEPO的单克隆抗体。分泌的单克隆抗体。分泌 该单克隆抗体的该单克隆抗体的_细胞，可由细胞，可由rhEPOrhEPO免疫过的小鼠免疫过的小鼠B B 淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而成。淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而成。【解析解析】本题主要以人红细胞生成素生产为材料来考查基因工本题主要以人红细胞生成素生产为材料来考查基因工程和细胞工程中动物细胞培养技术、制备单克隆抗体技术。获程和细胞工程中动物细胞培养技术、制备单克隆抗体技术。获取目的基因的方法有四种（从基因文库中获取、用取目的基因的方法有四种（从基因文库中获取、用PCRPCR扩增技术、扩增技术、用反转录法、用化学合成法），由图以核用反转录法、用化学合成法），由图以核DNADNA为模板获得目的基为模板获得目的基因的方法可知因的方法可知为为PCRPCR技术。进行反转录的模板是技术。进行反转录的模板是mRNAmRNA。由题意。由题意可知重组可知重组CHOCHO细胞适用于生产重组人红细胞生成素细胞适用于生产重组人红细胞生成素(rhEPO(rhEPO），所），所以重组以重组CHOCHO细胞能够表达出重组人红细胞生成素细胞能够表达出重组人红细胞生成素(rhEPO(rhEPO）或者红）或者红细胞生成素。培养动物细胞是用液体培养基即培养液，细胞从细胞生成素。培养动物细胞是用液体培养基即培养液，细胞从培养液中吸收营养，并同时向培养液中排放代谢废物，当代谢培养液中吸收营养，并同时向培养液中排放代谢废物，当代谢废物积累时会危害细胞，因此要不断更新培养液。制备单克隆废物积累时会危害细胞，因此要不断更新培养液。制备单克隆抗体是让抗体是让B B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，然后由杂淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，然后由杂交瘤细胞来分泌抗体。交瘤细胞来分泌抗体。答案：答案：（1 1）PCR PCR （2 2）mRNA rhEPO mRNA rhEPO （3 3）培养液）培养液 （4 4）杂交瘤）杂交瘤3.(20113.(2011海南高考海南高考)回答有关基因工程的问题：回答有关基因工程的问题：（1 1）构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割）构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNADNA 后，可能产生黏性末端，也可能产生后，可能产生黏性末端，也可能产生_末端。若要在限末端。若要在限 制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生二者产生_（相同、不同）黏性末端的限制酶。（相同、不同）黏性末端的限制酶。（2 2）利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰）利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是_。在用表达载体转化大肠杆菌时，常用在用表达载体转化大肠杆菌时，常用_处理大肠杆处理大肠杆菌，以利于表达载体进入；为了检测胰岛素基因是否转录出了菌，以利于表达载体进入；为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNAmRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与，可用标记的胰岛素基因片段作探针与mRNAmRNA杂交，该杂交杂交，该杂交技术称为技术称为_。为了检测胰岛素基因转录的。为了检测胰岛素基因转录的mRNAmRNA是否是否翻译成翻译成_，常用抗原，常用抗原抗体杂交技术。抗体杂交技术。（3 3）如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先）如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌要将目的基因插入农杆菌TiTi质粒的质粒的_中，然后用该农中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过杆菌感染植物细胞，通过DNADNA重组将目的基因插入植物细胞的重组将目的基因插入植物细胞的_上。上。【解析解析】（1 1）限制酶切割产生两种末端：黏性末端和平末端；）限制酶切割产生两种末端：黏性末端和平末端；若用若用DNADNA连接酶连接两个末端，两个末端必须是相同的。连接酶连接两个末端，两个末端必须是相同的。（2 2）基因工程检测的方法：检测目的基因是否导入，使用）基因工程检测的方法：检测目的基因是否导入，使用DNADNA分子杂交技术；检测目的基因是否转录，使用分子杂交技术；分子杂交技术；检测目的基因是否转录，使用分子杂交技术；检测是否形成蛋白质，使用抗原检测是否形成蛋白质，使用抗原抗体杂交技术。抗体杂交技术。（3 3）基因工程的目的是获得稳定遗传的新品种，因此要把目的）基因工程的目的是获得稳定遗传的新品种，因此要把目的基因插入到染色体的基因插入到染色体的DNADNA分子中。分子中。答案：答案：（1 1）平）平 相同相同（2 2）RNARNA聚合酶识别和结合的部位聚合酶识别和结合的部位 CaCa2+2+分子杂交技术分子杂交技术 蛋白质蛋白质（3 3）T-DNAT-DNA 染色体染色体DNADNA4.4.如图为利用生物技术获得生物新品种的过程，据图回答：如图为利用生物技术获得生物新品种的过程，据图回答：