高效液相色谱法的应用讲座文稿.pdf

高效液相色谱法的应用讲座?HPLC 仪器的介绍，基础知识。?HPLC 在各项分析技术中应用，及一些主要的技术要求、技术细节，着重讲解方法认证的各要素应如何理解和进行试验。并将举更多的实例，使大家对原理和应用有一个更深的认识和体会。?同时，还将讲述在新药申报和审评中，应注意的问题和事项，并就各剂型的注意事项逐一讲解。?有关物质的测定方法如何建立，和如何做到更科学、合理地制订一个产品的质量标准，和今后应如何去完善，修改。?我将还介绍以下 Excel 软件在我们分析工作中的应用。?演示一下 HP-1100 高效液相色谱仪软件的使用技巧?大家在工作中应经常总结，理论联系实际，重视文献的查询，不要匆匆忙忙地就进行试验，搞清楚原理，做好试验计划、设计好试验后，再有条不紊地进行。期间不要怕遇到问题，越是遇到问题，解决问题，提高得越快，如果长时间下来，都没有问题，都“一帆风顺”，那将会一直没有提高。这就是同样学历的大学生毕业几年后，水平差异很大的主要原因所在。建立一新药的质量标准时，可查阅其相关品种（结构式很像的），或其前几代品种的质量标准（USP、BP、JP 等），一定会有所启发和帮助的。?工作的出发点也应一切以工作为主、以人为本！这一点是非常重要的，所有的工作都应该是有意义的，应把力气花在“刀刃”上。不要片面地追求数量，尽量把每一个工作把它做透、做明白，力争做到举一反三、融会贯通，这样遇到问题才能够解决。否则，将会事倍功半。大家应尽量多动脑筋，多思考，如何去提高工作效率，避免人力和物力的不必要浪费！?HPLC 仪的一般操作 1.几大仪器生产厂商的介绍和使用下来的体会。2.流动相的配制 全部混合好后，泵抽滤、超声。不要用两个泵分别将流动相输入，即便是带了脱气机也不要这样操作，除非摸索试验条件。另应特别注意，抽滤所采用的膜。现市场上分别三种：用于水相、有机相，以及混用膜。最好采用混用膜，有一些厂家已发生将膜使用错，将泵堵塞的情况发生。抽滤后最好能再超声片刻。基线如波动过大，或出现毛刺基线时，基本上为气泡所至，再进行一遍抽滤和超声脱气。尤其是梯度洗脱时，更 1 应注意气泡的产生。如有两个泵，最好集中使用一个泵，另一个以备用。3.柱子的安装 一般都有箭头指向，如无，按照文字方向。4.操作顺序 先冲洗外管路，再进柱子，流速应逐渐增加，观察流出情况和柱压。尤其是厂里质检科，这项工作是十分有意义的。5.平衡时间 一般大流速，1 小时即可，测斜率，不看视野，定一常规数值；如有十二烷基硫酸钠等表面活性剂，可采用小流速冲过夜，第二天再加大流速 12 小时即可，否则保留时间将一直变化。6.如有气泡，无法实验，不要慌张，可将泵头上的旋扭拧下进行处理（详细讲解）。7.仪器维修 最好单位里能培养一位对仪器兴趣的同志，小毛病可自己修理，免去许多维修费，同时可马上解决问题。（1）分析生化样品或血液制品时，最好加一预柱，还有用手性色谱柱时，也最好加一预柱以保护价格昂贵的手性色谱柱。（2）最好能配一柱温箱，以保证试验的重现性和降低柱压以及清洗色谱柱时容易清洗干净。（3）最好能配一电脑，国产软件 40005000 即可。数据便于处理，储存。（4）压力不稳时，绝大多数情况是有气泡混入。应排除。（5）试验后色谱柱冲洗。一般采用 10%20%的甲醇水溶液冲洗 1020 个柱体积即可，即流速为 1.0ml/min，冲洗 40 左右即可。冲洗柱子 实验结束后，如有盐，先采用纯水冲洗1520 分钟（流速 1.0ml/min），如有十二烷基硫酸钠等表面活性剂，可时间再长一些；然后用 20%甲醇冲洗 1020 个柱体积，1.0ml/min 流速，1 小时即可，不可冲洗时间过长，相反会损伤柱子，且不要用纯水长时间冲洗。（6）色谱柱不用、存放时，两头柱塞一定塞住，否则容易挥发干损伤柱子。（7）建立仪器使用登记本，把每次仪器测定地样品名、流动相、柱压、柱温等参数记录下来，由于测定的品种不多，这就可很好地对仪器进行监控。?HPLC 仪的性能 1定义 HPLChigh performance liquid chromatography 2分析物质的分子量大小分子量一般在 2001000 之间，太大的分子量（多肽类药物，如“瑞林”系列，“奥曲肽”等药物）将会导致脱尾严重，此时可采用其他方法进行分析，如毛细管电泳，凝胶色谱等。3分析的特点 2 适用范围宽：现在决大部分化学类药品皆可采用该仪器分析。分离效率高：复方分析（提及一下紫外法测定复方成分的应用）、辅料干扰时（提及溶出度、含量测定时，尤其是溶出量明显大于含量时）等情况下，更显示其威力。速度快：在摸索色谱条件时，一般使主成分出峰时间在 30min 以内（太快可以，详细说明）；但如为有关物质测定，当然是主成分与杂质分离为首要条件（列举国外药典的例子）。这里需要强调的是，通常采用流速为 1.0ml/min，柱温 3040的测定条件。这里指的是在新建立一个分析方法时；但当实际应用时，是可以任意改变的。一般含量测定、溶出度可调整为出峰时间快一些，有关物质测定一般调整的慢一些，最好 1015min 左右出锋，采用 25cm 长的色谱柱为好，但出峰时间过长，又会使峰形变得较差，具体问题具体分析。流速和柱温均可适当改变，以适应测定的需要。如含量测定时，可适当加大流速（流速提高依柱压而定）和提高柱温（60以下没问题）；柱温和流速降低均可对分离效果产生一定的影响，但有限，仅在边缘时起作用。分离度的调节，关键还是流动相的配比。顺便提级：同样的测定条件，不同公司生产的色谱柱 C18柱，出峰时间都有可能相差很大，测定结果也相差很大（尤其是有关物质的测定），这十分正常（处理方法后面详细讲解）。对一些较为特殊的柱子，质量标准中应详细注明，否则无法重现（举复方含量测定的例子）。国内虽做不到，但可在色谱条件上下工夫，以适应不同的色谱柱型号（列举不同色谱柱测定结果不一致的实例），因为药典本身规定流动相组成是可以调节的，即后面即将讲到的方法认证中的系统耐用性。灵敏度高：可检测物质达10-9g左右（即ng级），一般最低检测浓度均可达10-110-3g/ml（进样体积 1020l），因此，目前有关物质的测定方法最好建立时为 HPLC 法，一者灵敏度高，二者可准确定量，易于稳定性考核的数据比较。这是紫外和薄层所无法匹敌的。有些浓度非常低的，紫外检测不到或者说紫外无法测定的，应用 HPLC 仪器均可得到满意的结果！如 HPLC 的紫外检测器也达不到测定“要求”，可通过加大进样量，调节仪器灵敏度，或使用其他检测器来解决。色谱柱可反复使用：一般保存好，均可达 2 年以上。流出的组分容易收集：可用于制备色谱或价格极为昂贵的、量比较少的物质收集。安全：仅是一些有机溶剂的污染（使用时，流动相口要密封，一者避免挥发，使流动相中各组分比例不准，二者防止污染环境），比气相要安全的多。还有一个优点，就是成功率较高：一般条件确定好后，均可得满意的结果，这也是与 3 气相、毛细管电泳比最大的优点（略带一下气相的知识介绍）。自动化：现在自动进样系统，普及很快，利用好可大大地提高工作效率。一些软件的开发，也使计算大大地简便（后面将介绍 HP-1100 软件）；一些国产软件虽无计算功能，但可通过编辑 Excel 软件进行计算，效率也很高。4分离原理 就是利用不同物质间的性质差别，使得在色谱柱上所显现的保留行为有所不同进行分离测定。分离是高效液相色谱仪的灵魂、核心所在，即分离度是根本，后面我还会讲到。几个主要参数：(1)柱效用理论板数来表达：22/1)(54.5WtnR=或2)60065.1(54.5HAtnR=上面两式需要注意的是：第一个为基本公式，有的软件均可自动给出；第二个公式为推导公式，即假设拖尾因子为1.0，即色谱峰完全对称时，用峰面积和峰高来表示半峰宽，因此两者是有区别的，当峰形拖尾或前沿严重时，两者差异将较大。介绍以下各国药典计算方法和柱效的一般要求与实际情况（举例）。(2)分离度：2112)(2WWttRRR+=或221112)(60065.12HAHAttRRR+=该公式应用时的注意事项，同上式相同，一般要求1.5以上。(3)拖尾因子 dWTh205.0=决定峰形的对称性，保留时间越长，有时拖尾越厉害，峰形越难看；有时虽拖尾，但分离效果好，或精密度依然很好，当然也适用。5色谱柱类型 C18柱（ODS是其中的一种，主要区别是将未键合的OH基遮盖，而ODS是其商品名）、C8柱、氨基柱、苯基柱、阳（阴）离子交换色谱柱等，这些都是固定相表面键合的极性有机基团不同所至。一般不能混用。这里需要说明的是，不同厂家生产的，不同型号的同一种类型的柱子，差异有时很大，无任何可比性。6流动相常用溶剂的极性和截止波长 溶 剂 水 甲醇 乙醇 异丙醇 乙腈 四氢呋喃极性常数 1.00 0.95 0.88 0.82 0.65 0.57 由极性可以看出，在反相色谱中，要使出峰时间加快，可增加流动相中的乙腈比例，但要注意分离度的减小；若要使出峰时间减慢，可增加流动相中水的比例，增加水的比例 4 还会引起分离度的增加；两者之间综合来考虑。举例说明：以乙腈-水-冰醋酸(35:65:5)为流动相测定某一物质时，主成分出峰时间达30min左右，与已知杂质的分离度达2.62；增加其中乙腈比例，至乙腈-水-冰醋酸(43:57:5)，主成分出峰时间9min左右，与已知杂质的分离度为1.75，仍满足测定的要求，还是选择后者。反相系统转为正相系统，必须使用异丙醇、甲醇过度；四氢呋喃使用时注意波长。必须选用色谱级的有机溶剂，最好为进口的。溶 剂 水 甲醇 乙醇 异丙醇 乙腈 四氢呋喃 正己烷 截止波长(nm)170 210 210 210 190 210 210 由于甲醇的极限波长为210nm左右，故短波长测定时，最好不要采用甲醇，而用乙腈，极限波长曾见过195nm的测定。样品稀释用溶剂的选择：当然首选能溶解主成分，能将主成分100%提取出来的溶剂。如流动相能做到，当然首选。测定有关物质时最好选用流动相，以避免溶剂峰的干扰，水往往出倒峰。含量测定时，溶剂依情况而定，有时选用流动相费用太高，或是不易于操作。注意小体积，辅料占有一定体积，引起较大误差，可采用加入法。进样量最好选用定量环的量，以避免由于进样不准而引起的偏差。定量环可进行更换。7，检测器类型 最通用的紫外检测器：注意测定波长较短或梯度洗脱时，基线有可能会飘；洗柱子时，尽量关闭光源，以延长使用寿命。二极管阵列检测器：目前使用者越来越多。用于多波长检测、峰纯度测定（详细讲解）、对被测定物质进行紫外扫描后选择波长（详细讲解）等用途。荧光检测器：灵敏度更高，对那些g级的制剂品种，有时适用。但缺点是，基线稳定需平衡时间较长，且稳定性较差。示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器（电导检测器）等，依情况而定，会逐渐普及，有时会使方法更简便。8定量分析方法 8.1 外标法：计算公式：样品样品对照品对照品校正因子ACACf=)(，样品平均校正因子样品AfC=)(首先讲述线性原理，回归原理，所以应注意，尽量使样品测定浓度与对照品浓度一致，一般在80%120%附近，举例说明气雾剂中每揿含量；说明缓释样品测定时，溶出度测定的对照品溶液最好为中间浓度点，50%左右，这样误差较小；气相有机溶剂测定时，对照 5 溶液的配制。计算将与Excel软件结合来讲。规范性的操作：含量测定时，先取对照品溶液进样35针，通过峰面积或校正因子计算RSD，如小于2.0%，则基本可认为仪器稳定，此时保留时间也已基本无变化。然后进样供试品溶液测定，结束后，应再回校一针对照品溶液，看其浓度是否偏差在2.0%以内，则认为测定过程中仪器是保持稳定的。对照品配制两份，尤其是原料药含量测定采用对照品法时，更需注意称量（天平的精密度）、转移的误差，计算RSD，确保准确，最后测定完应回较对照，这样所得的数据才准确可靠。8.2 内标法：计算公式：内标内标样品样品内标内标对照品对照品校正因子ACACACACf=)(内标样品样品内标对照品对照品校正因子AACAACf=)(（使对照品溶液和样品溶液中内标物的浓度一致，否则计算将极为烦琐）。该法仅是由于以前仪器的性能还不十分良好，进样体积还不能准确控制时开发出来的一种方法。现在随着定量阀和自动进样器的使用，该方法已毫无必要，无意义，相反由于操作步骤增加，会增大误差，除非进样阀进样量不准时，应急采用。但该法在气相色谱中还是十分具有价值的。因此，大家工作中完全可以将内标法改为外标法，活学活用。8.3 归一化法和自身对照法：为有关物质（杂质）测定时采用的方法。这是通过峰面积的比较来推算出各物质质量比例的方法。目前多采用自身对照法来进行。原理：(1)归一化法：即一个峰的峰面积（杂质峰）占总峰面积或占主峰面积的多少。由于有关物质测定时，总峰面积的绝大部分均为主峰面积，故两者结果差不多，结果基本一致。(2)自身对照法：通常是将供试品溶液稀释一定倍数后（通常为100倍）作为对照溶液（这里对照溶液与对照品溶液的区别需要强调一下），将其和供试品溶液分别进样测定，供试品溶液色谱图中的每个杂质峰面积，与对照溶液主成分峰面积进行比较或计算进行对杂质的判断。如比较，直接比峰面积大小，如计算，则采用公式%0.1%0.1自身对照主峰面积杂质峰面积AA，计算杂质含量。这里，需要讲解的是：如果该物质线性关系良好，稀释100倍，峰面积还呈线性的话，那么，归一化法和自身对照法所得结果基本是一致的（最多差0.02%左右）。但如果稀释100倍，峰面积不呈线性的话，那么，归一化法和自身对照法所得结果将有所差异，如此时采用归一化法，将得不到正确的结果，因为此时，峰面积已不能较为准确地表示质量；6 而采用自身对照法，则可避免该情况的发生，这也是目前推荐采用该法的原因所在。目前我们通常测定的化合物，一般为碳、氢、氧、氮组成的，线性关系均很好，稀释100倍，峰面积完全呈线性，原因是因为采用紫外检测器，一般化合物的线性范围可达1106或107，但也有一些测定物质，线性范围较窄，此时便需要摸索其线性范围，但又不能单纯考虑线性范围，还应着重考虑供试品溶液的浓度才是最为重要的。举“唑来膦酸”的实例。对照一份即可，没必要逐一稀释。唑来膦酸的结构式：PPHOOOHOHOOHOHNN所以，目前通常均采用自身对照法的原因就是为避免产生错误的判断。9流动相的调节 为了得到较好的分离效果和柱效，有时要在流动相中加入一些少量的有机溶剂，如三乙胺来调节峰形变“瘦”；或加入缓冲盐，调节流动相的pH值或离子强度，以改变组分的保留时间达到分离效果等。这些物质称为“改性溶剂”。大家如要建立色谱条件，应先去查询文献资料，再进行适当的修改。一般情况下，乙腈比例增加，保留时间加快；乙腈比例减少、水相增加，保留时间延长。前面提到的阳（阴）离子交换色谱柱，现多采用C18柱、流动相中加入表面活性剂以代替，但此时注意流动相平衡时间较长，最好小流速晚间过夜平衡后再进行试验，如何判定仪器平衡下面将介绍。pH值，一般色谱柱用28左右；目前一些新型色谱柱也可用于211的范围。一些物质，流动相的pH值影响极为显著，有时可以牺牲流动相的pH值，以满足测定的需要。10方法认证的工作如何进行：10.1含量测定时的浓度应比有关物质测定时的浓度低1020倍（往往一个色谱条件），如有关物质测定时的浓度已非常大，甚至超过检测器测定范围时，甚至可以降低50100倍。稀释的主要目的是使杂质经稀释后已检测不出，不再可能干扰主成分的测定；同时也使主成分浓度降低，柱效提高，积分更为准确，以得到准确的结果。10.2含量测定时的浓度如何来定义，依据经验而定。峰面积不要太大、也不要太小。有关物质测定时的浓度设定与下面讲到的方法认证中最低检出限息息相关，紧密相连。10.3应尽量保持样品溶液和对照品溶液使用同一溶剂。含量测定时一般可以做到，溶出度测定时，往往有所差异，通过先浓配后，再用该溶剂稀释的办法进行，比例尽可能小。7 举例USP的事例。10.4应尽量保持样品溶液和对照品溶液浓度相同，这是由外标一点法的原理所决定的，如相差较大，将得到错误的结果。举一气雾剂的实例。（1）精密度试验 取对照品溶液和供试品溶液均测定，分别连续进样6次以上，以峰面积计算RSD，应在2.0%以内。之所以如此试验，是分别观察带测物质在溶剂和辅料存在下与色谱柱的关系是否稳定，通过精密度来衡量。中间精密度和重现性试验通过溶液稳定性试验来体现。一般没有不好的，但有时浓度过大或过小，故项目必须进行。列举小规格样品溶出度测定时，可加大进样量，或改变测定测定波长，牺牲最大吸收峰，用末端吸收进行测定。“调节仪器灵敏度或加大进样量，使对照品溶液连续进样6次的主峰峰面积的RSD小于2.0%”。（2）专属性试验 取辅料或已知杂质，分别单独配制后，进样测定观察其是否有干扰，随后，将辅料或已知杂质按比例与主成分混合，进样测定，再次观察与主成分的分离情况。含量测定、含量均匀度和溶出度测定方法，经验证，HPLV法与UV法结果一致，可采用UV法，以提高工作效率。化学鉴别反应时，该项试验十分重要。（3）准确度试验 是通过专属性试验和回收率试验来共同体现的。回收率试验是将待测物质的粉末与辅料粉末混合按比例混合后，稀释测定。此时应做35点，即选择以测定浓度为100%的80%120%之间进行，之所以如此进行，是因为供试品溶液浓度一般都在对照品溶液浓度的附近，不可能相差很大。这里，插入一点说明的是：大家有可能在工作中遇到这种情况，含量测定为98%左右，溶出度测定采用UV法，均值却为112%左右。这是不可能的，这主要就是方法的问题。（4）线性试验 一般进行20%200%的线性范围 考察，以浓度或进样量对峰面积进行回归，得回归方程和相对系数，一般相关系数要求要在0.999以上。大家工作中，可能百分之百的呈线性，这是因为目前仪器的发展已使化合物的线性范围可达1106或107。（前面有关物质测定时使用自身对照法处已经讲到）。哪为什么还要做该项试验。这是因为毕竟还有极少部分的物质线性范围很窄的原因。着重讲解，外标一点法的使用原理。辅料有时影响色谱峰，充分利用线性范围宽的特点，距离说明。（5）最低检出限 此项试验含量测定方法认证时不需要做。仅在进行有关物质测定时必须要做的，而且十分重要。请大家讲述一下平时如何进行测定的？灵敏度分可调节和不可调节两种情况。试验结果如何利用、怎么利用，着重讲解。（6）溶液稳定性试验 非常重要，一定要做。分别取对照品溶液和供试品溶液，测定仪 8 器在不关闭、流动相不改变的情况下，12或24小时以内稳定性如何，可分别间隔一段时间进样测定。通过观察主成分峰面积的RSD值和杂质有无增加（归一化法），确证该项，以做出准确的判断适应试验的要求，否则将得到错误的结果。（7）耐受性试验 是指更换试验因素，如不同人员、不同仪器，不同色谱柱型号、厂家，不同试剂等因素。这一点才是真正至关重要的、问题的核心所在！认证时不可能做到这一点，出现问题时往往要考虑到。目前往往被人们所忽略。11各剂型的注意事项（1）片剂 辅料极易吸潮的，采用“投片法”试验。含量均匀度 10mg规格以下，或主药占总片重的2%以下，或精神类药物等，脆碎度检查，应用于主药占总重的比例很大时，一般要测定。咀嚼片、分散片时，也需要测定。溶出度或释放度才是关键，水浴温度，水面高度均应注意。国内外仪器的差别，尤其在低转速时，应注意。转蓝超声处理，否则影响溶出。尤其缓释片时，更应注意。加薄膜衣的片剂，无需剥除后处理，直接研磨，没问题，文献报道多次。（2）注射剂 注射用无菌粉末含量测定采用“投片法”进行，避免水分的干扰，否则含量偏低。注射用无菌粉末应做含量均匀度，讲述原理。大输液研制时最好测定渗透压，以后可以考虑不测。质量标准也可不拟订。注射用混悬液 粒度尤为重要。有详细的规定（同软膏剂）装量与液体粘稠程度有密切关系。液体粘稠程度还与取样所采用的器皿有关系，粘稠液体应采用内容量移液管，之后应冲洗。（3）酊剂 含量测定可直接稀释后测定，与糖浆剂相同。不要采用萃取法。（4）栓剂 融变时限 十分重要。（5）胶囊剂 溶出度测定时，漂浮。可采取先转一段时间，使气泡消除，放置时仅贴杆处，不要使其靠杯壁。9 10（6）软膏剂、眼膏剂 最头疼的问题就是萃取。处理方法主要是将主药与基质分离后，直接进HPLC测定。含量往往偏低。粒度尤其重要，它决定了吸收，1995年版没有，2000年版增加了（7）滴眼剂 必须测定渗透压，且质量标准中应制订，一般270330mosl/mol。（8）糖浆剂 测定方法，直接稀释后测定，大体积稀释。举例说明。如提高质量标准，应拟订测定防腐剂。（8）气(粉)雾剂和喷雾剂 含量测定采用浓度，测定较为烦琐（9）颗粒剂和口服混悬剂(包括干混悬剂)粒度与沉降体积比只能选一，向一边靠。（10）散剂 干燥失重仅是对水分的控制，排除辐料干扰，规定时间。（11）凝胶剂 基质卡波姆的破坏，一般采用离子水溶液，否则会损伤柱子。12HPLC法测定有关物质的方法建立介绍 13Excel的使用（1）基本操作的介绍。（2）常用函数：均值（AVERAGE）、标准差（STDEV）、相对标准差、截距（INTERCEPT）、斜率（SLOPE）、相关系数（CORREL）等。（3）溶出度、含量均匀度、含量测定等的计算，（4）稳定性考核的大批样品数据处理。