高效液相色谱技术(HPLC) 影响因素的选择.pdf

高效液相色谱技术(HPLC)影响因素的选择赵轶男(大连民族学院 生命科学学院,大连116600)摘 要:阐述了高效液相色谱技术的应用,介绍了高效液相色谱技术影响因素的选择,如流动相、固定相、柱温、监测器等等。关键词:高效液相色谱;影响因素;固定相;流动相;检测器1 高效液相色谱技术应用高效液相色谱法(HPLC),是具有分离分析效能高、速度快、检测灵敏度高等特点的分离技术。以其不受试样挥发性和相对分子质量的限制,可用于分离分析高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的有机化合物,还可用于各种离子的分离分析;HPLC还可利用组份分子尺寸大小的差别、离子交换能力的差别以及生物分子间亲和力的差别进行分离;可用多种溶剂作为流动相,对于性质和结构类似的物质,分离的可能性比气相色谱法更大。因此高效液相色谱的应用领域不断扩大和深入,目前已成为化学化工、商品检验、食品卫生、环境保护、生命科学和药品分析等诸多领域中重要的分离分析技术。目前高效液相色谱仪与结构仪器的联用技术是一个重要的分析检测手段。液相色谱2质谱联用技术,使得液相色谱的高分析能力和质谱高鉴定能力相结合,对复杂样品体系,特别是生物医学领域的研究提供了更进一步的有效方法1;HPLC2NMR的分析方法已经被证明为生物化学和药物化学分析中重要的分子结构鉴定方法之一2,3。2 高效液相色谱技术影响因素的选择2.1 固定相的选择液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相(或在惰性载体表面涂上一层液膜)、离子交换树脂或多孔性凝胶。固定相的选择应符合:颗粒细且均匀;传质快;机械强度高,能耐高压;化学稳定性好,不与流动相发生化学反应。固定相以承受高压能力来分类,可分为刚性固体和硬胶两类。刚性固体以二氧化硅为基质,可承受7.0108Pa1.0109Pa的高压,可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团,可扩大应用范围,它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中,它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。固定相按孔隙深度分类,可分为表面多孔型和全多孔型固定相。表面多孔型固定相的多孔层厚度小、孔浅,相对死体积小,出峰迅速、柱效亦高;颗粒较大,渗透性好,装柱容易,梯度淋洗时能迅速达到平衡,适合进行常规分析,但由于多孔层厚度薄,最大允许量受到限制。全多孔型固定相由直径为10 nm的硅胶微粒凝聚而成。由于颗粒很细(510m),孔仍然较浅,传质速率快,易实现高效、高速。适合复杂混合物分离及痕量分析。2.2 流动相在液相色谱中,当固定相选定时,流动相的种类、配比能显著地影响分离效果,因此流动相的选择非常重要。2.2.1 流动相的性质要求 第一、在选择流动相时,一般采用色谱纯试剂,必要时需进一步纯化,以除去有干扰的杂质。因为在色谱柱整个试用期间,流过色谱柱的溶剂是大量的,如溶剂不纯,则长期积累杂质而导致检测器噪声增加4。第二、流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩,从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动3 作者简介:赵轶男(1979-),女,硕士,助教043第26卷增刊2007年12月分析试验室Chinese Journal of Analysis LaboratoryVol.26.Suppl.2007-12相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。第三、流动相必须与检测器匹配。使用UV检测器时,所用流动相在检测波长下应没有吸收,或吸收很小。当使用示差折光检测器时,应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相,以提高灵敏度。第四、流动相粘度要低(应 2 cp)。高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质,降低柱效,还会使柱压降增加,使分离时间延长。最好选择沸点在100 以下的流动相。第五、流动相对样品的溶解度要适宜。如果溶解度欠佳,样品会在柱头沉淀,不但影响了纯化分离,且会使柱子恶化。2.2.2 流动相的pH 采用反相色谱法分离弱酸(3pKa7)或弱碱(7pKa8)样品时,通过调节流动相的pH,来抑制样品组分的解离,增加组分在固定相上的保留,并改善峰形。分析弱酸样品时,通常在流动相中加入少量弱酸,常用50mmolL磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液;分析弱碱样品时,通常在流动相中加入少量弱碱,常用50mmolL磷酸盐缓冲液和30 mmolL三乙胺溶液。流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用,减轻或消除峰拖尾现象。2.2.3 流动相的选择 正相色谱的流动相通常采用低极性溶剂如正己烷、苯、氯仿等加适量极性调整剂,如醚、酯、酮、醇和酸等。反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂,再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂,如甲醇、乙腈、二氧六环、四氢呋喃等。极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响。一般情况下,甲醇2水系统已能满足多数样品的分离要求,且流动相粘度小、价格低,是反相色谱最常用的流动相。但与甲醇相比,乙腈的溶剂强度较高且粘度较小,并可满足在紫外185205 nm处检测的要求,因此,乙腈2水系统要优于甲醇2水系统。2.3 柱温的选择柱温是最重要的色谱操作条件,它直接影响色谱柱的选择性、色谱峰区域展宽和分析速度。柱温不能高于固定相的最高使用温度,否则会造成固定相的大量挥发流失;柱温也不能低于固定相的熔点,以免影响其分配作用提高柱温,柱温的选择,要依据具体情况而定:若分离是关键,则应采用较低的柱温;若主要研究的是分析速度,则应采用较高的柱温;若既要获得较高的分离度,又要缩短分析时间,一般采用较低的柱温与较低的固定液配比相配合的方法。液相色谱中,一般在室温条件下进行分离分析,适当提高柱温有利于改善传质和提高分析速度。2.4 监测器的选择检测器是液相色谱仪的关键部件之一。一个理想的检测器应具有灵敏度高、重复性好、响应块、线性范围宽、适用范围广、对流动相温度和流量的变化不敏感、死体积小等特点。在液相色谱中,有两种类型的监测器,一类是溶质性监测器,如紫外、荧光、电化学检测器等,它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应。紫外检测器具有很高的灵敏度,即使是那些对紫外光吸收较弱的物质也可用来检测。此外紫外检测器对温度和流速不敏感,可用于梯度洗提,但不适用于对紫外光完全不吸收的试样。荧光检测器比紫外光检测器的灵敏度要高2个数量级,许多物质,特别是具有对称共轭结构的有机芳环分子受紫外光激发后,能辐射出比紫外光波长较长的荧光,例如多环芳烃、维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物等,许多生化物质包括某些代谢产物、药物、氨基酸、胺类、甾族化合物都可用荧光检测器检测5。另一类是总体监测器,如示差折光检测器,它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应。几乎每种物质都有各自不同的折射率,因此都可用差示折光检测器来检测,它是一种通用型的浓度检测器,但是对温度变化很敏感,不能用于梯度洗脱。参考文献1 杨松成.第十届全国有机质谱学学术会议,19992S Strohschein,M Pursch,KAlbert.J PharmBiomed Anal,1999,21:6693Nicholson J K,Holmes E,Sidelmann U G.Pharm Sci,1996,2(3):1274 朱明华.仪器分析(第三版),高等教育出版社,20015 夏立娅.仪器分析,北京:中国计量出版社,2006143第26卷增刊2007年12月分析试验室Chinese Journal of Analysis LaboratoryVol.26.Suppl.2007-12