免疫分析法.pptx

第三章第三章免疫分析法免疫分析法一、一、概述概述二、二、抗原抗原三、三、抗体与免疫反应抗体与免疫反应四、四、免疫分析方法及应用免疫分析方法及应用五、五、免疫扩散法免疫扩散法主要内容主要内容一、一、概述概述二、抗原二、抗原三、抗体与免疫反应三、抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用四、免疫分析方法及应用五、免疫扩散法五、免疫扩散法主要内容主要内容 什么叫免疫分析？什么叫免疫分析？基于抗原和抗体的特异性反应基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种技术手段。抗原抗体反应是指抗原与相应的抗体之间发生的特异性结合反应。它既可以发生在体内，也可以发生在体外。高选择性和低检出限。在体内发生的抗原抗体反应为体液免疫应答的效应作用。体外的抗原抗体结合反应主要用于抗原或抗体的检测，用于免疫学诊断。一、概述一、概述(1)在实验药物动力学和临床药物学中在实验药物动力学和临床药物学中，测定生物利用度和药物代谢动力学参数等生物药剂学中的重要数据，以便了解药物在体内的吸收、分解、代谢和排泄情况；(2)在药物的临床检测中在药物的临床检测中，对治疗指数小、超过安全剂量易发生严重不良反应或最佳治疗浓度和毒性反应浓度有交叉的药物血液浓度进行监测；(3)在药物生产中在药物生产中，从发酵液或细胞培养液中快速测定有效组分的含量，以实现对生产过程的在线监测；(4)对药品中是否存在特定的微量有害杂质进行评价。在药物分析中，免疫分析法的在药物分析中，免疫分析法的应用主要集中在以下几方面：应用主要集中在以下几方面：免疫分析免疫分析：利用抗原与抗体的特异性结合作用，来选择性识别和测定，可以作为抗体或抗原的待测物.免疫分析方法免疫分析方法非标记免疫分析（抗原抗体结合理化性质发生变化非标记免疫分析（抗原抗体结合理化性质发生变化）标记免疫分析标记免疫分析标记物标记物有无有无非放射免疫分析非放射免疫分析放射免疫分析（放射污染）放射免疫分析（放射污染）酶联免疫分析酶联免疫分析荧光免疫分析荧光免疫分析电化学免疫分析电化学免疫分析化学发光免疫分析化学发光免疫分析免疫分析免疫分析免疫分析检测的发展免疫分析检测的发展放射免疫检测放射免疫检测（兴起于（兴起于2020世纪世纪7070年代年代)酶联免疫检测酶联免疫检测（兴起于（兴起于2020世纪世纪8080年代，年代，各临床机构普遍使用）；各临床机构普遍使用）；以化学发光为代表的光生物学标记及免以化学发光为代表的光生物学标记及免疫检测技术疫检测技术（2020世纪世纪9090年代开始推广使年代开始推广使用，产品步入成长期）三个阶段。用，产品步入成长期）三个阶段。特点特点可逆性可逆性比例性比例性反应阶段性反应阶段性特异性特异性免疫分析法的特点免疫分析法的特点特异性特异性特异性特异性：抗原与抗体结合反应的专一性：抗原与抗体结合反应的专一性分子基础分子基础:抗原表位与抗体分子高变区之间抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性空间构型的互补性可逆性可逆性可逆性：可逆性：抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体，件下又可解离为游离抗原与抗体，解离后的抗原或抗解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。体均能保持原有的结构和活性。影响因素：影响因素：抗体对相应抗原的亲合力亲合力越高，结合越抗体对相应抗原的亲合力亲合力越高，结合越牢固，越不易解离牢固，越不易解离 环境因素对复合物的影响环境因素对复合物的影响pH、离子强度、离子强度 比例性和比例性和反应阶段性反应阶段性比例性：比例性：抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系量比关系前带前带(prezone)：抗体过量：抗体过量后带后带(postzone)：抗原过量：抗原过量等价带等价带(equivalence zone)：抗原抗体比例合适：抗原抗体比例合适 一、概述一、概述二、二、抗原抗原三、抗体与免疫反应三、抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用四、免疫分析方法及应用五、免疫扩散法五、免疫扩散法主要内容主要内容抗原（抗原（antigen,Ag)：是一类能刺激机体免疫系统发生免疫应答，并能与相应免疫应答产物（抗体和致敏淋巴细胞)在体内外发生特异性结合的物质抗原的两种特性：免疫原性和抗原特异性抗原的两种特性：免疫原性和抗原特异性免疫原性（免疫原性（immunogenicity)，能刺激机体发生免疫应答，产生抗体和致敏淋巴细胞的能力。抗原特异性抗原特异性能与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的能力。凡具有免疫原性和抗原性的物质称为完全抗原完全抗原只有抗原特异性而不具有免疫原性的物质称为半抗原半抗原 半抗原+蛋白质完全抗原赋予半抗原以免疫原性的蛋白质称为载体。载体。定义定义1.抗原的免疫原性抗原的免疫原性抗原物质必须具备的条件：一、异物性二、一定的理化性状三、完整性四、宿主的遗传性一、异物性一、异物性异物是指化学结构与宿主的自身成分相异或机体的免疫细胞从未与它接触过的物质。异物性的物质包括以下几类：1、异种物质如：马血清蛋白、各种微生物及其代谢产物对人体而言都是异种物质，具有强的免疫原性。2、同种异体物质如：ABO血型抗原、人类主要组织相容性抗原。3、自身抗原物质如：自身组织成分结构改变、隐蔽性自身成分暴露构成自身抗原。二、一定的理化性状二、一定的理化性状大分子胶体物质凡具有免疫原性的物质，分子量都较大，一般在10kDa以上,在一定范围内,分子量越大免疫原性越强。一定的化学组成和结构从化学组成来看，凡含有芳香族氨基酸（尤其是酪氨酸）的蛋白质，其免疫原性较强。从结构来看，结构越复杂其免疫原性越强。分子构象与易接近性分子构象是指抗原分子中一些特殊化学基团的三维结构，它决定抗原分子是否能与淋巴细胞表面的抗原受体相互吻合。易接近性是指抗原分子的特殊化学基团与淋巴细胞表面相应的抗原受体相互接触的难易程度。三、完整性三、完整性具有一定理化性状的物质须经非消化道途径进入机体（包括注射、吸入、混入伤口等），并接触淋巴细胞，才能成为良好抗原。如果是口服后可被消化酶水解成胨、氨基酸，破坏了其结构，就丧失了免疫原性。自然界中天然的抗原物质有：蛋白质、多糖、核蛋白四、宿主遗传性四、宿主遗传性 抗原的免疫原性也与机体的应答能力有关，同种动物不同个体对同一种抗原的免疫应答存在明显的差异，这种差异受遗传因素控制，控制免疫应答的基因称为免疫应答基因（immuneresponse,Ir)。2.抗原特异性抗原特异性抗原决定簇（基）载体决定簇和半抗原决定簇共同抗原和交叉反应一、抗原决定簇一、抗原决定簇1、概念抗原决定簇（antigenicdeterminant,AD)是指抗原中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称为表位（epitope)。表位的性质、数目和空间构象决定着抗原的特异性。抗原通过AD与相应淋巴细胞表面的抗原受体结合，激活淋巴细胞，引起免疫应答。2、种类和数量一个抗原分子可以有一种或多种不同的AD，一种AD决定着一种特异性，多种AD决定着多种特异性3、部位位于抗原表面的AD能直接被相应淋巴细胞所识别，称功能性决定簇，存在抗原分子内部的AD无激发免疫应答的功能，称隐蔽决定簇。只有经理化因素处理后，使之暴露可能成为新的功能决定簇。4、大小抗原决定簇的大小与相应抗体的抗原结合部位相当。一个蛋白质抗原决定簇含5-7个氨基酸残基一个多糖抗原决定簇含5-7个单糖一个核酸半抗原决定簇含6-8个核苷酸5、抗原结合价（antigenicvalence)是指能和抗体分子结合的抗原决定簇的总数。半抗原为一价天然抗原的分子结构复杂，分子表面有多个决定簇为多价构象决定簇：序列上不相连而依赖于蛋白质或多糖的空间构象形成的决定簇，多暴露于分子表面。顺序决定簇：一段相连的氨基酸序列所形成的决定簇，多位于抗原分子内部。功能性AD：分子表面，易被识别。隐蔽性AD：分子内部。B细胞决定簇：分子表面。T细胞决定簇：分子内部。二、二、AD的分类的分类三、共同抗原和交叉反应三、共同抗原和交叉反应两种来源不同的抗原，除各有其主要的特异性抗原决定簇外，相互之间也存在部分相同的抗原决定簇，这种共有的抗原决定簇称为共同抗原。亲缘关系很近的生物之间存在的共同抗原称为类属抗原。无种属关系的生物之间存在的共同抗原称为异嗜性抗原。一种共同抗原刺激机体产生的抗体，可与其他含有共同抗原的物质发生结合反应，称为交叉反应。2.2 药物分子的抗原性药物分子的抗原性1、药物分子的免疫原性、药物分子的免疫原性大多数的药物分子通常都是半抗原；一些蛋白类药物、多肽类药物、激素类药物大部分属于完全抗原。2、药物分子的抗原特异性、药物分子的抗原特异性药物分子和蛋白质载体结合后，抗原特异性可能会发生改变。3、药物分析中，为了得到高效价的抗血清，通常会与蛋白质载体合成人工抗原与蛋白质载体合成人工抗原进行试验。常用载体：牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OA）、破伤风类毒素（TT）、钥孔蛋白（KLH）等。（1）半抗原和载体结合的化学反应）半抗原和载体结合的化学反应多肽类激素多肽类激素：活化蛋白质或多肽的游离羧基形成肽键；与蛋白质或多肽的游离氨基缩合形成肽键甾体甾体：甾体激素的羟基和酮基不能直接和载体蛋白形成有效的共价键，需要制备甾体的衍生物，通过含游离羧基的甾体衍生物与载体蛋白相连抗生素抗生素：-内酰胺环在偏碱性条件下可以与蛋白质的自由氨基以酰胺键的形式共价结合；氨基糖苷类抗生素用碳化二亚胺为连接剂实现药物和载体蛋白的连接在选择结合半抗原的化学反应时，应考虑不同的连接方式可能对抗体的专一性产生不同的影响。半抗原没有可以结合的官能团时需要合成适当的衍生物。为得到特定抗原决定簇相对单纯的合成抗原，需要根据半抗原的化学特性及连接产物的化学特性选择连接的半抗原。（2）半抗原和载体的选择原则）半抗原和载体的选择原则p半抗原选择原则：半抗原选择原则：最好含有芳香结构；应考虑抗原抗体反应的微环境；合理利用分子类似物之间的交叉反应。p载体选择原则：载体选择原则：应考虑载体对检测系统的影响：选择的载体应和检测体系不发生交叉反应；用于包被合成抗原的载体和用于免疫动物产生抗体的合成抗原的载体蛋白不同。免疫过程中考虑载体效应的影响：抗体的特异性依赖于半抗原分子结构中的免疫决定区，但整个载体蛋白大分子对于抗体反应的性质和量也有影响；应使用相同载体的合成抗原制备半抗原抗体。（3）合成抗原的测定p定性测定方法：定性测定方法：光谱分析：半抗原和载体蛋白的结合导致蛋白构象的改变，改变程度和半抗原的结合量有关，半抗原结合量越大，构象改变程度越大。热力学分析：半抗原和载体蛋白结合后热力学特征会有变化，差异可通过差示扫描量热法（DCS）等方法测定。p定量测定方法定量测定方法 相对含量测定法：通过ELISA法比较半抗原与载体蛋白的相对结合量。绝对含量测定法：半抗原具有与载体蛋白完全不同的广谱吸收特征，且半抗原在此特定波长下具有较强的吸收；或能利用特定的化学反应定量测定半抗原的量，且不与载体蛋白发生反应。一、概述一、概述二、抗原二、抗原三、三、抗体与免疫反应抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用四、免疫分析方法及应用五、免疫扩散法五、免疫扩散法主要内容主要内容免疫分析实际上是一种特殊的试剂分析，特点是抗体抗体/抗原成为分析试剂抗原成为分析试剂。1、抗体的结构与功能抗体泛指机体经抗原刺激由免疫活性细胞泛指机体经抗原刺激由免疫活性细胞产生的一组免疫球蛋白，通常由两条相同产生的一组免疫球蛋白，通常由两条相同的重链和两条相同的轻链组成的重链和两条相同的轻链组成常用的是IgG分子，其在血清免疫球蛋白中的含量约70%1.抗体（抗体（antibody,Ab）功能性概念）功能性概念 是由抗原刺激而产生并能与刺激其产生的抗原发生特异性结合的、具有免疫功能的球蛋白。抗体主要存在血清中，也存在于呼吸道粘膜液、小肠粘膜液、唾液以及乳汁等其它体液中。2.免疫球蛋白（免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）结构性概念结构性概念 具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。所有抗体都是免疫球蛋白，但是并非所有免疫球蛋白都是抗体。免疫球蛋白的基本结构 IgG分子基本结构是由四个肽链组成的，二条较小的轻链和二条较大的重链，轻链与重链是由二硫键连接形成，分为氨基端（N端），羧基端（C端）。一、多克隆抗体一、多克隆抗体（polyclonal antibodypolyclonal antibody）1.定义：抗原分子通常具有多个抗原决定簇，动物免疫后可刺激多种具有相应抗原受体的B细胞发生免疫应答，因而可产生多种针对不同抗原决定簇的抗体。这些由不同B细胞克隆产生的抗体称为多克隆抗体（polycolonal antibody,PcAb）。2.实际意义（1）预防、治疗感染性疾病（特异性差，可发生超 敏反应）（2）临床诊断二、单克隆抗体二、单克隆抗体（monoclonal antibody,McAbmonoclonal antibody,McAb）1.定义：由单一克隆B细胞杂交瘤产生的、只识别 抗原分子某一特定抗原决定簇的、具有高度特异性的 抗体。每种单克隆抗体其类、亚类、型及亲和力完全 相同，具有高度均一性。2.特点 具有高度均一性。3.杂交瘤细胞 骨髓瘤细胞无限增殖；免疫B细胞合成、分泌特异性抗体。4.杂交瘤技术 HAT培养基：次黄嘌(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺 嘧啶核苷(T)。三、基因工程抗体三、基因工程抗体 基因工程抗体是通过PCR技术获得抗体基因或抗体基因片段，与适当载体重组后引入不同表达系统所产生的抗体，被广泛应用于疾病的临床诊断、预防和治疗及基础理论研究等领域。人-鼠嵌合抗体（chimeric antibody）；人改型抗体（reshaped humanized antibody）；小分子抗体；双特异性抗体（bispecific antibody）等。2抗体作为分析试剂的评价抗体作为分析试剂的评价抗体的特异性抗体的特异性是无与伦比的，不需或只需要简单的预处理。有较高的稳定性较高的稳定性。这两点奠定了分析免疫高度灵敏和高度专一的基础。此外，抗体还有一个独特的性质：每个抗体分子有两个抗原的结合点，即多价性。然而抗体缺乏高灵敏试剂应具备的分析信号反差。3、抗体的制备、抗体的制备（1）常规抗血清（多克隆抗体多克隆抗体）：指人工被动免疫后制成的多克隆抗体，是免疫分析中的重要工具。免疫原的制备、动物免疫、放血、抗血清分离及抗血清的分析鉴定。免疫原的制备免疫原的制备免疫原由质量好的抗原与佐剂制成。通常有免疫原水剂、福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。水剂由无菌生理盐水将抗原制成一定浓度的免疫原。弗氏佐剂是由一定量的羊毛脂和石蜡油，以及一定浓度的分支杆菌混合而成，经研磨达到油包水的程度。不完全福氏佐剂即不含有分支杆菌。动物免疫动物免疫通常的免疫动物为家兔和羊。免疫的部位多采用脚掌、腹股沟淋巴结、大腿肌肉、皮下多点、静脉。免疫抗原量通常为110mg或50100mg。试血及效价测定试血及效价测定家兔的试血通常可由耳缘静脉取血，取血量0.5ml。不同稀释度的抗血清和1%的血细胞悬液按1:1混合，37保温2h后观测血细胞的凝聚情况，即可测得免疫血清的效价。（2）单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体是建立在经细胞融合而获得的杂交瘤细胞基础上的。所获得的抗体具有均一的特异性。高度均质性的特异性抗体，由一个识别单一抗原表位的B细胞克隆所分泌。一般来自杂交瘤细胞细胞培养法&接种动物体内生产法2、抗体的纯化利用化学方法提纯或浓缩某一类的免疫球蛋白。利用免疫吸附剂和亲和色谱得到免疫学上专一性的抗体。2024/9/25 周三49沉淀分离通过改变溶液的条件或添加某种物质，降低溶液中某一成分的溶解度，使其从溶液中沉淀析出，与其它成分分离的技术。是纯化生物大分子物质常用的经典方法包括盐析沉淀法、有机溶剂沉淀法和非离子聚合物沉淀法等。2024/9/25 周三50（一）盐析法在物质的水溶液中添加一定浓度的中性盐，使物质的溶解度减小而沉淀析出，这一过程称为“盐析”。优点：成本低，不需要昂贵的设备；操作简便，安全；对许多生物活性物质具有稳定作用；对pH、温度要求不严格。缺点：分离效果有限2024/9/25 周三51盐析的基本原理盐析的基本原理蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质亲水基团、与水形成水化膜的程度、以及所带有电荷的情况决定的。当中性盐加入蛋白质溶液中，盐离子对水分子的亲和力大于蛋白质，于是减弱甚至消除蛋白质分子周围的水化膜。同时，盐离子所带的电荷中和部分蛋白质分子表面电荷，更加导致其溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。2024/9/25 周三52盐类和浓度的选择盐类和浓度的选择p常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等p硫酸铵最为常用硫酸铵最为常用，其优点是：溶解度大；温度系数小；密度小，有利于析出蛋白的离心分离；蛋白沉淀物在2 mol/L3 mol/L硫酸铵溶液中稳定，低温下可保存一年；价廉易得；分离效果比其它盐好。p但硫酸铵缓冲能力比较弱，pH难控制；铵离子干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。p高浓度盐析法高浓度盐析法是粗纯样品的常用方法。2024/9/25 周三53脱盐脱盐 蛋白质用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的方法有：透析法透析法超滤法超滤法葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G50G50层析法。层析法。2024/9/25 周三54（二）有机溶剂沉淀法p利用待分离物质与杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使某一溶质沉淀析出，从而与其它成分分离的方法。p有机溶剂破坏溶质分子周围的水化层；有机溶剂降低溶液的介电常数，使蛋白质的溶解度降低。2024/9/25 周三55p优点：优点：分辨率比盐析法高，即一种溶质发生沉淀的有机溶剂浓度范围比较窄；溶剂容易除去，并可以回收；沉淀无需脱盐，易于离心或过滤分离。p缺点：缺点：有机溶剂可使某些生物大分子变性失活，操作常需在低温下进行；有机溶剂具有一定毒性。2024/9/25 周三56有机溶剂的选择p选择有机溶剂的原则：选择有机溶剂的原则：有机溶剂的水溶性好；沉淀效率高；毒性小，避免损害工作人员的健康和污染环境；不与溶质分子发生化学反应，价格便宜。p使用较多的是乙醇、丙酮、甲醇等。使用较多的是乙醇、丙酮、甲醇等。2024/9/25 周三57p残留的有机溶剂去除的方法：残留的有机溶剂去除的方法：自然蒸发或负压蒸发，可在室温进行；凝胶过滤除去。（三）离子交换层析法 离离子子交交换换层层系系（ion exchange chromatography，IEC）是利用离子交换剂上可交换离子与组分中的离子发生可逆交换时结合力的差别，而进行分离的一种技术。广泛应用于很多生命物质的分析、制备和纯化等。优点：优点：重现性好，简单易行；分辨力强，回收率高；具有多孔性，表面积大、交换容量大；具有亲水性，对大分子的吸附不牢固，层析条件温和，不致引起物质变性或失活。2024/9/25 周三59离子交换法的固定相是离子离子交换法的固定相是离子交换剂；交换剂；若担体带有正电荷，可吸附若担体带有正电荷，可吸附着负电荷分子，则为阴离子着负电荷分子，则为阴离子交换法；不带净电荷的分子，交换法；不带净电荷的分子，以及阳离子则直接流出，不以及阳离子则直接流出，不会被吸会被吸附上去。附上去。这些被固相单体所吸附的离这些被固相单体所吸附的离子，统称为子，统称为 counter ioncounter ion，因为其电荷与担体上的电荷因为其电荷与担体上的电荷相反相反 (counter(counter 是是 相反相反 的意思的意思)离子交换剂为人工合成的惰性高分子聚合物，其上带有许多可电离基团，根离子交换剂为人工合成的惰性高分子聚合物，其上带有许多可电离基团，根据这些基团所带电荷的不同，可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。它可分据这些基团所带电荷的不同，可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。它可分三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。基本原理基本原理2024/9/25 周三60阳离子交换反应：阳离子交换反应：R-AR-A-H H+Y+Y+R-AR-A-X X+H+H+阴离子交换反应：阴离子交换反应：R-BR-B+OH OH-+X+X-R-BR-B+X X-+OH+OH-R R代表离子交换剂的高分子聚合物基质，代表离子交换剂的高分子聚合物基质，A A-和和B B+分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团，物共价结合的电荷基团，H H+和和OHOH-分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子，分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子，Y Y+和和X X-分别代表溶液中的离子基团。分别代表溶液中的离子基团。2024/9/25 周三612024/9/25 周三62p两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂的结两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的理化性质和在特定合力，主要取决于它们的理化性质和在特定pH条件下呈现条件下呈现的离子状态。的离子状态。p大多数蛋白在生理大多数蛋白在生理pH（pH68）下带负电荷，需用阴离子）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化交换柱纯化，极端的，极端的pH下蛋白会变性失活，应尽量避免。下蛋白会变性失活，应尽量避免。p洗脱可采用改变溶液的洗脱可采用改变溶液的pH或离子强度，也可同时改变或离子强度，也可同时改变pH与与离子强度的方法。改变离子强度的方法。改变pH可能对蛋白的稳定性有较大的影可能对蛋白的稳定性有较大的影响，响，一般采用改变离子强度的梯度洗脱一般采用改变离子强度的梯度洗脱。p用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。2024/9/25 周三63 在阴离子交换柱上血浆蛋白组分的分段洗脱在阴离子交换柱上血浆蛋白组分的分段洗脱NaCl(mol/L)NaCl(mol/L)0.01mol/L PB0.01mol/L PB的的pHpH洗脱的蛋白质洗脱的蛋白质0.0250.0258.08.0IgGIgG0.0300.0307.07.0IgGIgG0.0350.0357.07.0IgGIgG、转铁蛋白、纤维蛋白原、转铁蛋白、纤维蛋白原0.0400.0407.07.0转铁蛋白、纤维蛋白原转铁蛋白、纤维蛋白原0.0450.0457.07.02 2蛋白、白蛋白蛋白、白蛋白0.0500.0507.07.0IgAIgA、2 2蛋白、白蛋白蛋白、白蛋白0.0600.0606.56.5IgAIgA、白蛋白、白蛋白0.0700.0706.56.5白蛋白白蛋白0.0800.0806.56.52 2蛋白、蛋白、-脂蛋白、白蛋白脂蛋白、白蛋白0.0900.0906.56.52 2蛋白、珠蛋白、白蛋白蛋白、珠蛋白、白蛋白0.100.106.56.52 2蛋白、蛋白、-脂蛋白、珠蛋白、白蛋白脂蛋白、珠蛋白、白蛋白0.150.156.56.5IgMIgM、-脂蛋白、脂蛋白、球蛋白球蛋白0.200.206.56.5铜蓝蛋白、铜蓝蛋白、蛋白蛋白2024/9/25 周三64三、技术要点三、技术要点（一）离子交换剂的选择和处理（一）离子交换剂的选择和处理p两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的理化性质和在特定理化性质和在特定pH条件下呈现的离子状态。条件下呈现的离子状态。p大多数蛋白在生理大多数蛋白在生理pH（pH68）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下下蛋白会变性失活，应尽量避免。蛋白会变性失活，应尽量避免。p处理的目的：使交换剂充分溶胀，使其颗粒的孔隙增大，让具有交换活性的电荷基团处理的目的：使交换剂充分溶胀，使其颗粒的孔隙增大，让具有交换活性的电荷基团充分暴露出来，再用酸碱浸泡，除去杂质并使其带上需要的反离子。充分暴露出来，再用酸碱浸泡，除去杂质并使其带上需要的反离子。（二）装柱和加样（二）装柱和加样p选择平衡缓冲液的离子强度和选择平衡缓冲液的离子强度和pH时，首先要保证待分离物质的稳定；其次是使离子交时，首先要保证待分离物质的稳定；其次是使离子交换剂与待分离物质有适当的结合，而不与样品中杂质结合，以达到分离的目的。换剂与待分离物质有适当的结合，而不与样品中杂质结合，以达到分离的目的。p溶液的离子强度常用不影响蛋白质吸附到交换剂上的最高离子强度液，常用的离子强溶液的离子强度常用不影响蛋白质吸附到交换剂上的最高离子强度液，常用的离子强度为度为20 mmol/L 50 mmol/L NaCl。（三）洗脱和收集（三）洗脱和收集p洗脱可采用改变溶液的洗脱可采用改变溶液的pH或离子强度，也可同时改变或离子强度，也可同时改变pH与离子强度的方法。与离子强度的方法。改变改变pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，一般采用改变离子强度的梯度洗可能对蛋白的稳定性有较大的影响，一般采用改变离子强度的梯度洗脱。脱。p用一定盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液用一定盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。洗脱下来。（四）离子交换剂的再生与保存（四）离子交换剂的再生与保存p使其带上所需的平衡离子。使其带上所需的平衡离子。2024/9/25 周三65（四）亲和层析法亲和层析亲和层析是利用某些生物分子之间专一可逆结是利用某些生物分子之间专一可逆结合特性的一种高度专一的吸附层析类型。合特性的一种高度专一的吸附层析类型。配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和被亲和分子之间的桥梁。被亲和分子之间的桥梁。配体本身配体本身必须有两个基团必须有两个基团：一个能与载体共价结合，连接后的配体对互补一个能与载体共价结合，连接后的配体对互补分子的亲和力不会改变分子的亲和力不会改变 一个能与被亲和分子结合。一个能与被亲和分子结合。2024/9/25 周三66亲和层析法有点像在钓鱼，鱼是我们所要的分子亲和层析法有点像在钓鱼，鱼是我们所要的分子 (B)(B)杂夹在一堆蛋白质当中，杂夹在一堆蛋白质当中，鱼饵是与鱼饵是与 B B 具有专一性的分子具有专一性的分子 (A,(A,上图上图 1)1)；A A 与与 B B 的专一性很高，只会在的专一性很高，只会在样本中与样本中与 B B 结合，而排除其它杂质结合，而排除其它杂质 (上图上图 2)2)；若把结合在吸着剂上的；若把结合在吸着剂上的 B B 溶溶离下来，就可以得到均质的离下来，就可以得到均质的 B(B(上图上图 3)3)。2024/9/25 周三67 亲和层析中部分蛋白配体亲和层析中部分蛋白配体配基配基纯化的物质纯化的物质蛋白蛋白A/A/蛋白蛋白B B各种免疫球蛋白各种免疫球蛋白单克隆抗体单克隆抗体各种抗原、蛋白各种抗原、蛋白A A抗原抗原特异性单克隆抗体、特异性多克隆抗体特异性单克隆抗体、特异性多克隆抗体核苷酸核苷酸核苷酸结合蛋白、核苷酸酶核苷酸结合蛋白、核苷酸酶血凝素血凝素糖蛋白糖蛋白蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂蛋白酶蛋白酶脂肪酸脂肪酸脂肪酸结合蛋白、清蛋白脂肪酸结合蛋白、清蛋白糖糖血凝素、糖血凝素、糖苷苷甘酶甘酶生物素生物素亲和素、生物素结合蛋白亲和素、生物素结合蛋白肝素肝素凝血因子、酯酶、凝血因子、酯酶、DNADNA聚合酶、连接组织蛋白聚合酶、连接组织蛋白酶酶钙调蛋白钙调蛋白钙调蛋白结合酶钙调蛋白结合酶TriazineTriazine染料染料脱氢酶、激酶、多聚酶、干扰素、限止酶等脱氢酶、激酶、多聚酶、干扰素、限止酶等3、特异性抗体的筛选与效价测定、特异性抗体的筛选与效价测定抗体的效价抗体的效价又称滴度，指某一物质与一定容量的另一物质产生反应所需要的量。免疫分析中，免疫血清中抗体的效价指将血清稀释，测定与一定的抗原能发生反应的最大稀释度，此最大稀释度即为血清的效价。常用的效价测定方法有免疫扩散法、间接血凝法和ELISA法等。特异性抗体的筛选，特异性抗体的筛选，制备出含不同的抗原决定簇的特异性抗原，然后根据抗体和这些抗原相互作用的强弱进行分析。一、概述一、概述二、抗原二、抗原三、抗体与免疫反应三、抗体与免疫反应四、四、免疫分析方法及应用免疫分析方法及应用主要内容主要内容四、免疫分析方法及其应用四、免疫分析方法及其应用放射免疫分析法（放射免疫分析法（RIA）荧光免疫分析法（荧光免疫分析法（FIA）克隆酶给予体免疫分析法（克隆酶给予体免疫分析法（CEDIA）酶联免疫吸附分析法（酶联免疫吸附分析法（ELISA）核医学核医学治疗：治疗：肿瘤、甲亢等肿瘤、甲亢等诊断诊断 体内体内PET、SPECT、放射放射免疫成像等免疫成像等 体外体外放射免疫分析放射免疫分析（RIA）标记免疫分析技术标记免疫分析技术用标记示踪技术观察抗原抗体一级反应的分析用标记示踪技术观察抗原抗体一级反应的分析方法方法,是体外放射分析技是体外放射分析技术术中建立最早、中建立最早、应应用最用最广的一广的一类竞类竞争性体外放射分析技争性体外放射分析技术术.特点：特点：敏感性高，反应时间短，可用仪器检测结果敏感性高，反应时间短，可用仪器检测结果三大标记免疫分析技术：三大标记免疫分析技术：放射免疫放射免疫、荧光免疫、荧光免疫、酶免疫酶免疫 检测方法检测方法 检检测范围测范围生化、常规免疫生化、常规免疫 mgg（10-3 10-6 g）荧光免疫、酶免疫荧光免疫、酶免疫 gng（10-6 10-9 g）放射免疫放射免疫、发光免疫、发光免疫 ngpg（10-9 10-12 g）PCR pgfg（10-12 10-15 g）一、放射免疫分析技术（一、放射免疫分析技术（Radioimmunoassay，RIA）女科学家女科学家 R.Yalow（美（美,1921）1950末末发明（胰岛素），发明（胰岛素），1977年获诺贝尔医学奖年获诺贝尔医学奖1.基本原理基本原理（1）竞争结合分析：）竞争结合分析：Ag+Ab AgAb *Ag+Ab *AgAb（2）IRMA（免疫放射分析）：（免疫放射分析）：2.常用标记核素：常用标记核素：（1）125I：射线，半衰期射线，半衰期 60 天天（2）3H：射线，半衰期射线，半衰期 12.3 年年3.测量仪器测量仪器（1）计数仪计数仪（2）液闪仪液闪仪基本原理AbAb限量，限量，Ag*Ag*定量定量,Ag*Ag*和和AgAg的量大于的量大于AbAb结合位点，二者结合位点，二者通过竞争方式与通过竞争方式与AbAb结合；随着结合；随着AgAg增加，增加，Ag*Ag*与与AbAb结合形成结合形成Ag*AbAg*Ab复合物的放复合物的放射量降低射量降低,二者变化二者变化成函数关系。成函数关系。具体步骤具体步骤 抗原抗体反应结合的和游离的放射性物质的分离放射性活度的测定柱色谱法柱色谱法吸附法吸附法沉淀法沉淀法抗抗体发抗抗体发微孔滤膜法微孔滤膜法固相法固相法求出结合率，绘制标准曲线（剂量反应曲线）求出结合率，绘制标准曲线（剂量反应曲线）以未结合的以未结合的Ag*Ag*为为F F，Ag*AbAg*Ab复合物复合物为为B B，则，则B/FB/F或或B/(BB/(BF)F)与与AgAg的的量变存在着函数量变存在着函数关系剂量反应关系剂量反应曲线曲线 注：注：T即是即是B与与F的总和的总和基本原理基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将它采用抗原与抗体的特异反应将待测物待测物与酶连接与酶连接，然后通过，然后通过酶与底物产生颜色反应酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有在这种测定方法中有3种必要的试剂：种必要的试剂：固相的抗原或抗体（免疫吸附剂固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）酶标记的抗原或抗体（标记物酶标记的抗原或抗体（标记物）酶作用的底物（显色剂酶作用的底物（显色剂）二、酶联免疫吸附分析法（二、酶联免疫吸附分析法（ELISA）测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，（抗体）反应结合后，再加上酶的相再加上酶的相应底物，即起应底物，即起催化水解或氧催化水解或氧化还原反应而化还原反应而呈颜色。呈颜色。ELISA原理原理酶及其底物酶及其底物 酶结合物（过碘酸盐氧化法、戊二醛交联法）是酶与抗体酶结合物（过碘酸盐氧化法、戊二醛交联法）是酶与抗体或抗原在交联剂作用下联结的产物。是或抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物，将得到不同的，将得到不同的颜色反应。颜色反应。ELISA原理原理酶酶 底底 物物显色反显色反应应 测定波长测定波长 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 邻苯二胺邻苯二胺四甲替联苯胺四甲替联苯胺氨基水杨酸氨基水杨酸邻联苯甲胺邻联苯甲胺2,2-2,2-连胺基连胺基-2(3-2(3-乙基乙基-并噻并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 橘红色橘红色黄色黄色棕色棕色兰色兰色蓝绿色蓝绿色492492460460449449425425642642碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶 4-4-硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐(PNP)(PNP)萘酚萘酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸盐磷酸盐+重氮盐重氮盐 黄色黄色红色红色 400400500 500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪甲硫酚嗪+噻唑兰噻唑兰 黄色黄色深蓝色深蓝色 405405420 420-半乳糖苷半乳糖苷酶酶 甲基伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG)(ONPG)荧光荧光黄色黄色 360,450360,450420 420 ELISA的种类和变化的种类和变化 （一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法（二）间接法（二）间接法（三）竞争法（三）竞争法 （四）双位点一步法（四）双位点一步法（五）捕获法测（五）捕获法测IgMIgM抗体抗体（六）应用亲和素和生物素的（六）应用亲和素和生物素的ELISAELISA （一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原获得待分析物的未标定抗体获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合的洗涤除去未结合的抗体及杂质抗体及杂质 加入封闭蛋白溶液以封闭载体加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白洗涤并除去未结合的封闭蛋白加受检标本（抗原）形成加受检标本（抗原）形成固相抗体抗原复合物固相抗体抗原复合物 洗涤除去其他洗涤除去其他未结合的物质未结合的物质 加酶标抗体生成加酶标抗体生成抗体抗体待测抗原待测抗原酶标记抗体酶标记抗体的复合物的复合物 彻底洗涤彻底洗涤未结合的未结合的 酶标抗体酶标抗体 加底物进行加底物进行酶催化反应酶催化反应 根据颜色反应的根据颜色反应的程度进行该抗原程度进行该抗原的定性或定量测定的定性或定