免疫分析2.pptx

1酶联免疫吸附分析法介绍酶联免疫吸附分析法介绍酶联免疫吸附法的基本原理酶联免疫吸附法的基本原理ELISAELISA的的基基础础是是抗抗原原或或抗抗体体的的固固相相化化及及抗抗原原或或抗抗体体的的酶酶标标记记。结结合合在在固固相相载载体体表表面面的的抗抗原原或或抗抗体体仍仍保保持持其其免免疫疫学学活活性性，酶酶标标记记的的抗抗原原或或抗抗体体既既保保留留其其免免疫疫学学活活性性，又又保保留留酶酶的的活活性性。加加入入酶酶反反应应的的底底物物后后，底底物物被被酶酶催催化化成成为为有有色色产产物物，产产物物的的量量与与标标本本中中受受检检物物质质的的量量直直接接相相关关，故故可可根根据据呈呈色色的的深深浅浅进进行行定定性性或或定定量量分分析析。由由于于酶酶的的催催化化效效率率很很高高，间间接接地地放放大大了了免免疫疫反反应应的的结结果果，使使测测定方法达到很高的敏感度。定方法达到很高的敏感度。21 1 ELISAELISA的类型的类型ELISA可可用用于于测测定定抗抗原原，也也可可用用于于测测定定抗抗体体。在在这这种种测测定方法中有三个必要的试剂：定方法中有三个必要的试剂：（1）固固相相的的抗抗菌菌素素原原或或抗抗体体，即即“免免疫疫吸吸附附剂剂”(immunosorbent)；（2）酶酶 标标 记记 的的 抗抗 原原 或或 抗抗 体体，称称 为为“结结 合合 物物”(conjugate)；（3）酶酶反反应应的的底底物物。根根据据试试剂剂的的来来源源和和标标本本的的情情况况以以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。31.11.1双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原此此法法适适用用于于检检验验各各种种蛋蛋白白质质等等大大分分子子抗抗原原，例例如如HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg、AFPAFP、hCGhCG等等。只只要要获获得得针针对对受受检检抗抗原原的的特特异异性性抗抗体体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。酶标抗体酶标抗体样品或参照样品或参照底物底物终止液终止液酶标仪测定酶标仪测定OD值值4双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：1 1）将将特特异异性性抗抗体体与与固固相相载载体体联联结结，形形成成固固相相抗抗体体。洗洗涤涤除除去未结合的抗体及杂质。去未结合的抗体及杂质。2 2）加加受受检检标标本本，保保温温反反应应。标标本本中中的的抗抗原原与与固固相相抗抗体体结结合合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。3 3）加加酶酶标标抗抗体体，保保温温反反应应。固固相相免免疫疫复复合合物物上上的的抗抗原原与与酶酶标标抗抗体体结结合合。彻彻底底洗洗涤涤未未结结合合的的酶酶标标抗抗体体。此此时时固固相相载载体体上上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。4 4）加加底底物物显显色色。固固相相上上的的酶酶催催化化底底物物成成为为有有色色产产物物。通通过过比色，测知标本中抗原的量。比色，测知标本中抗原的量。双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。点夹心。51.2 1.2 双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体反反应应模模式式与与双双抗抗体体夹夹心心法法类类似似。用用特特异异性性抗抗原原进进行行包包被被和和制制备备酶酶结结合合物物，以以检检测测相相应应的的抗抗体体。与与间间接接法法测测抗抗体体的的不不同同之之处处为为以以酶酶标标抗抗原原代代替替酶酶标标抗抗抗抗体体.此此法法中中受受检检标标本本不不需需稀稀释释，可可直直接接用用于于测测定定，因因此此其其敏敏感感度度高高于于间间接接法法。乙乙肝肝标标志志物物中中抗抗HBsHBs的的检检测测常常采采用用本本法法。本本法法关关键键在在于于酶酶标标抗抗原原的的制制备备，应应根根据据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。61.3 1.3 间接法测抗体间接法测抗体 本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。立检测相应抗体的方法。样品稀释液样品稀释液样品或参比样品或参比酶标抗体酶标抗体终止液终止液底物底物7操作步骤如下：操作步骤如下：1 1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。结合的抗原及杂质。2 2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。3 3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人）加酶标抗抗体。可用酶标抗人IgIg以检测总抗体，但一般多用以检测总抗体，但一般多用酶标抗人酶标抗人IgGIgG检测检测IgGIgG抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。量与标本中受检抗体的量正相关。4 4）加底物显色）加底物显色81.4 1.4 竞争法测抗体竞争法测抗体 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。抗原时，可用此法检测特异性抗体。样品或参比样品或参比酶标抗体酶标抗体终止液终止液底物底物9 其其原原理理为为标标本本中中的的抗抗体体和和一一定定量量的的酶酶标标抗抗体体竞竞争争与与固固相相抗抗原原结结合合。标标本本中中抗抗体体量量越越多多，结结合合在在固固相相上上的的酶酶标标抗抗体体愈愈少少，因因此此阳阳性性反反应应呈呈色色浅浅于于阴阴性性反反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。竞竞争争法法测测抗抗体体有有多多种种模模式式，如如可可将将标标本本和和酶酶标标抗抗体体与与固固相相抗抗原原竞竞争争结结合合，抗抗HBc的的ELISA一一般般采采用用此此法法。另另一一种种模模式式为为将将标标本本与与抗抗原原一一起起加加入入到到固固相相抗抗体体中中进进行行竞竞争争结结合合，洗洗涤涤后后再再加加入入酶酶标标抗抗体体，与与结结合合在在固固相相上上的的抗抗原原反反应应。抗抗HBe的的检检测测一一般般采采用用此法此法.101.5 1.5 竞争法测抗原竞争法测抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISAELISA测定多用测定多用此法。此法。111.6 1.6 捕获包被法测抗体捕获包被法测抗体 临临床床检检验验中中IgMIgM抗抗体体的的检检测测常常用用于于传传染染病病的的早早期期诊诊断断，测测定定抗抗体体IgMIgM时时多多采采用用捕捕获获包包被被法法。用用抗抗人人IgMIgM抗抗体体包包被被固固相相，以以捕捕获获血血清清标标本本中中的的IgMIgM（其其中中包包括括针针对对抗抗原原的的特特异异性性IgMIgM抗抗体体和和非非特特异异性性的的IgMIgM）。此此法法常常用用于于病病毒毒性性感感染的早期诊断。染的早期诊断。样品或参比样品或参比特异性抗原特异性抗原酶标抗体酶标抗体终止液终止液底物底物121.7 ABS-ELISA1.7 ABS-ELISA法法 ABSABS为为 亲亲 和和 素素(avidin)(avidin)生生 物物 素素(biotin)(biotin)系系 统统(system)(system)的略语。的略语。亲亲和和素素是是一一种种糖糖蛋蛋白白，分分子子量量6000060000，每每个个分分子子由由4 4个个能能和和生生物物素素结结合合的的亚亚基基组组成成。生生物物素素为为小小分分子子化合物，分子量化合物，分子量244244。生生物物素素与与亲亲和和素素的的结结合合具具有有很很强强的的特特异异性性，其其亲亲和和力力较较抗抗原原抗抗体体反反应应大大得得多多，两两者者一一经经结结合合就就极极为为稳稳定定。由由于于一一个个亲亲和和素素可可与与4 4个个生生物物素素分分子子结结合合，因因此此如如把把ABSABS与与ELISAELISA法法可可分分为为酶酶标标记记亲亲和和素素-生生物物素素法法和和桥联亲和素桥联亲和素-生物素法两种类型。生物素法两种类型。13：NCNC膜；膜；：过敏原；：过敏原；：特异性：特异性IgE(sIgE)IgE(sIgE)；：生物素化大鼠抗小鼠：生物素化大鼠抗小鼠IgEIgE（BiotinBiotin）；）；：辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶HRP-HRP-酶标链亲和素（酶标链亲和素（AvidinAvidin）；）；：DAB(DAB(diaminobenzidine)显色液；显色液；：显色；：显色；142.ELISA2.ELISA的试剂的试剂ELISAELISA中有三个必要的试剂：中有三个必要的试剂：免疫吸附剂免疫吸附剂、结合物结合物和和酶的酶的底物底物。完整的完整的ELISAELISA试剂盒包含以下各组分：试剂盒包含以下各组分：（1 1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2 2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3 3）酶的底物；）酶的底物；（4 4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标 准品和控制血清（定量测定中）；准品和控制血清（定量测定中）；（5 5）结合物及标本的稀释液；）结合物及标本的稀释液；（6 6）洗涤液；）洗涤液；（7 7）酶反应终止液）酶反应终止液152.12.1免疫吸附剂免疫吸附剂 已包被抗原或抗体的固相载体在低温（已包被抗原或抗体的固相载体在低温（2-82-8）干燥的条）干燥的条件下一般可保存件下一般可保存6 6个月。有些不完整的试盒，仅供应包被用个月。有些不完整的试盒，仅供应包被用抗原或抗体，检测人员需自行包被。以下简述固相载体和包抗原或抗体，检测人员需自行包被。以下简述固相载体和包被过程。被过程。2.1.12.1.1固相载体固相载体 固相载体在固相载体在ELISAELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作学反应。可作ELISAELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格低廉，吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格低廉，所以被普遍采用。所以被普遍采用。162.1.2 2.1.2 包被的方式包被的方式 将抗原或抗体固定在过程称为包被将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)(coating)。换言之，。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。基团，故更易吸附到固相载体表面。因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。172.1.3 2.1.3 包被用抗原包被用抗原 用用于于包包被被固固相相载载体体的的抗抗原原按按其其来来源源不不同同可可分分为为天天然然抗抗原原、重组抗原重组抗原和和合成多肽抗原合成多肽抗原三大类。三大类。天天然然抗抗原原可可取取自自动动物物组组织织、微微生生物物培培养养物物等等，须须经经提提取取纯纯化化才才能能作作包包被被用用。如如HBsAgHBsAg可可以以从从携携带带者者的的血血清清中中提提取取，一一般般的的细细菌菌和和病病毒毒抗抗原原可可以以从从其其培培养养物物中中提提取取，蛋蛋白白成成份份抗抗原原可可从从富富含含此此抗抗原原的的材材料料中中提提取取等等（例例如如AFPAFP从从脐脐带带血血或或胎胎肝肝中提取）。中提取）。重重组组抗抗原原是是抗抗原原基基因因在在质质粒粒体体中中表表达达的的蛋蛋白白质质抗抗原原，多多以以大大肠肠杆杆菌菌或或酵酵母母菌菌为为质质粒粒体体。重重组组抗抗原原的的优优点点是是除除工工程程菌菌成成份份外外，其其他他杂杂质质少少，而而且且无无传传染染性性，但但纯纯化化技技术术难难度度较较大大。另另一一特特点点是是能能用用基基因因工工程程制制备备某某些些无无法法从从天天然然材材料料中中分分离离的的抗原物质。抗原物质。18 合合成成多多肽肽抗抗原原是是根根据据蛋蛋白白质质抗抗原原分分子子的的某某一一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多多肽肽抗抗原原一一般般只只含含有有一一个个抗抗原原决决定定簇簇，纯纯度度高高，特特异异性性也也高高，但但由由于于分分子子量量太太小小，往往往往难难于于直直接接吸吸附附于于固固相相上上。多多肽肽抗抗原原的的包包被被一一般般需需先先使使其其与与无无关关蛋蛋白白质质如如牛牛血血清清白白蛋蛋白白质质(BSA)(BSA)等等偶偶联联，借借助助于于偶偶联联物物与与固固相相载载体体的的吸吸附附，间间接接地地结结合合到到固相载体表面。固相载体表面。192.1.4 2.1.4 包被用抗体包被用抗体 包包被被固固相相载载体体的的抗抗体体应应具具有有高高亲亲和和力力和和高高特特异异性性，可可取取材材于于抗抗血血清清或或含含单单克克隆隆抗抗体体的的腹腹水水或或培培养养液液.如如免免疫疫用用抗抗原原中中含含有有杂杂质质(即即便便是是极极微微量量的的)，在在抗抗血血清清中中将将出出现现杂杂抗抗体体，必必须须除除去去(可可用用吸吸收收法法)后后才才能能用于用于ELISAELISA，以保证试验的特异性。，以保证试验的特异性。202.1.5 2.1.5 封闭封闭 封闭封闭(blocking)(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，质充填这些空隙，从而排斥在从而排斥在ELISAELISA其后的步骤中干扰物其后的步骤中干扰物质的再吸附。质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。封闭的手续与包被相类似。最常用的封闭剂最常用的封闭剂是是0.05%-0.05%-0.5%0.5%的的牛血清白蛋白牛血清白蛋白，也有用，也有用10%10%的小牛血清或的小牛血清或1%1%明胶作明胶作为封闭剂的。为封闭剂的。脱脂奶粉脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的也是一种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，可以高浓度使用（特点是价廉，可以高浓度使用（5%5%）。）。封闭是否必要，取决于封闭是否必要，取决于ELISAELISA的模式的模式及及具体的实验条件具体的实验条件并非所有的并非所有的ELISAELISA固相均需封闭，封闭不当反而会使阴性固相均需封闭，封闭不当反而会使阴性本底增高。本底增高。212.2 2.2 结合物结合物 结结合合物物即即酶酶标标记记的的抗抗体体（或或抗抗原原），是是ELISA中中最最关关键键的的试试剂剂。良良好好的的结结合合物物应应该该是是既既保保有有酶酶的的催催化化活活性性，也也保保持持了了抗抗体体（或或抗抗原原）的的免免疫疫活活性性。结结合合物物中中酶酶与与抗抗体体(或或抗抗原原)之之间间有有恰恰当当的的分分子子比比例例，在在结结合合试试剂剂中中应应尽尽量量不不含含有有或或少少含含有有游游离离的的（未未结结合合的的）酶酶或或游游离离的的抗抗体体（或或抗抗原原）。此外，结合物尚要有良好的此外，结合物尚要有良好的稳定性稳定性。2.2.1 2.2.1 抗原和抗体抗原和抗体 制制备备结结合合物物时时所所用用抗抗体体一一般般均均为为纯纯度度较较高高的的IgGIgG，以以免免在在与与酶酶联联结结时时其其他他杂杂蛋蛋白白的的干干扰扰。最最好好用用亲亲和和层层析析纯纯的的抗抗体体，这这样样全全部部酶酶结结合合物物均均具具有有特特异异的的免免疫疫活活性性，可可以以在在高高稀稀释释度度进进行行反反应应，实实验验结结果果本本底底浅浅淡淡。在在ELISAELISA中中用用酶酶标标抗抗原的模式不多，总的要求是原的模式不多，总的要求是抗原抗原必须是高纯度的。必须是高纯度的。222.2.22.2.2酶酶 用用于于ELISA的的酶酶应应符符合合以以下下要要求求：纯纯度度高高，催催化化反反应应的的转转化化率率高高，专专一一性性强强，性性质质稳稳定定，来来源源丰丰富富，价价格格不不贵贵，制制备备成成酶酶结结合合物物后后仍仍继继续续保保留留它它的的活活性性部部分分和和催催化化能能力力。最最好好在在受受检检标标本本中中不不存存在在相相同同的的酶酶。另另外外，它它的的相相应应底底物物易易于于制制备备和和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。保存，价格低廉，有色产物易于测定等。在在ELISA中中，常常用用的的酶酶为为辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶(horseradish peroxidase,HRP)和和碱碱性性磷磷酸酸酶酶(alkaline phosohatase,AP)。在在少少数数商商品品ELISA试试剂剂中中，应应用用的的酶酶尚尚有有葡葡萄萄糖糖氧氧化化酶酶、-D-半乳糖苷酶和脲酶等。半乳糖苷酶和脲酶等。HRP是是一一种种糖糖蛋蛋白白，含含糖糖量量约约为为18%，分分子子量量为为44000，是是一一种种复复合合酶酶，由由主主酶酶（酶酶蛋蛋白白）和和辅辅基基（亚亚铁铁血血红红素素）结结合合而成，是一种卟啉蛋白质。而成，是一种卟啉蛋白质。232.2.3 2.2.3 结合物的制备结合物的制备酶标记抗体的制备方法主要有两种，即酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法戊二醛交联法和和过碘酸过碘酸盐氧化法盐氧化法。（1）戊戊二二醛醛交交联联法法：戊戊二二醛醛是是一一种种双双功功能能团团试试剂剂，它它可可以以使使酶酶与与蛋蛋白白质质的的氨氨基基通通过过它它而而联联结结。碱碱性性磷磷酸酸一一般般用用此此法法进进行行标标记记。交交联联方方法法一一步步法法、两两步步法法两两种种。它它具具有有操操作作简简便便、有有效效（结结合合率率达达60%-70%）和和重重复复性性好好等等优优点点。缺缺点点是是交交联联反反应应是是随随机机的的，酶酶与与抗抗体体交交联联时时分分子子间间的的比比例例不不严严格格，结结合合物物的的大大小小也也不不均均一一，酶酶与与酶酶，抗抗体体与与抗抗体体之之间间也也有有可可能能交交联联，影影响响效效果。果。（2）过过碘碘酸酸盐盐氧氧化化法法：本本法法只只适适用用于于含含糖糖量量较较高高的的酶酶。辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶的的标标记记常常用用此此法法。反反应应时时，过过碘碘酸酸钠钠将将HRP分分子子表表面面的的多多糖糖氧氧化化为为醛醛基基，可可与与蛋蛋白白质质上上的的氨氨基基形形成成Shiff碱碱而而结合。此法简便有效结合。此法简便有效.24 按按以以上上方方法法制制备备的的酶酶结结合合物物一一般般都都混混有有未未结结合合物物的的酶酶和和抗抗体体。理理论论上上，结结合合物物中中混混有有的的游游离离酶酶一一般般不不影影响响ELISAELISA中中最最后后的的酶酶活活性性测测定定。但但游游离离的的抗抗体体则则不不同同，它它会会与与酶酶标标抗抗体体竞竞争争相相应应的的固固相相抗抗原原，从从而而减减少少了了结结合合到到固固相相上上的的酶酶标标抗抗体体的的量量。因因此此制制备备的的酶酶结结合合物物应应予予纯纯化化，去去除除游游离离的的酶酶和和抗抗体体后后用用于于检检测测，效效果果更更好好。纯纯化化的的方方法法很很多多，分分离离大大分分子子化化合合物物的的方方法法均均可可应应用。用。结结合合物物制制得得后后，在在用用作作ELISAELISA试试剂剂前前尚尚需需确确定定其其适适当当的的工工作作浓浓度度。最最适适的的工工作作浓浓度度就就是是指指结结合合物物稀稀释释至至这这一一浓浓度度时时，能能维维护护一一个个低低的的本本底底，并并获获得得测测定定的的最最佳佳灵灵敏敏度度，达达到到最最合合适适的的测测定定条条件件和和测测定定费费用用的的节节省省。在在用用于于具具体体的的ELISAELISA检检测测中中，酶酶标标抗抗体体的的最最适适工工作作浓浓度度受受到到固固相相载载体体的的性性质质、包包被被抗抗原原或或抗抗体体的的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响，纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响，252.2.42.2.4结合物的保存结合物的保存 酶酶标标抗抗体体中中的的酶酶和和抗抗体体均均为为生生物物活活性性物物质质，保保存存不不当当，极极易易失失活活。高高浓浓度度的的结结合合物物较较为为稳稳定定，冰冰冻冻干干燥燥后后可可在在普普通通冰冰箱箱中中保保存存一一年年左左右右，但但冻冻干干过过程程中中引引起起活活力力的的减减低低，而而且且使使用用时时需需经经复复溶溶，颇颇为为不不便便。结结合合物物溶溶液液中中加加入入等等体体积积的的甘甘油油可可在在低低温温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存。冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存。早早期期的的ELISAELISA试试剂剂盒盒中中的的结结合合物物一一般般均均按按以以上上两两种种形形式式供供应应，配配以以稀稀释释液液临临用用时时按按标标明明的的稀稀释释度度稀稀释释成成工工作作液液。现现在在较较先先进进的的ELISAELISA试试剂剂盒盒均均已已用用合合适适的的缓缓冲冲液液配配成成工工作作液液，使使用用时时不不需需再再行稀释，在行稀释，在4-84-8保存期可达保存期可达6 6个月。个月。由由于于蛋蛋白白质质浓浓度度较较低低，结结合合物物易易失失活活，需需加加入入蛋蛋白白保保护护剂剂。另另外外再再加加入入抗抗生生素素（例例如如庆庆大大霉霉素素）和和防防腐腐剂剂（HRPHRP结结合合物物加加硫硫柳汞，柳汞，APAP结合物可加叠氮钠），以防止细菌生长。结合物可加叠氮钠），以防止细菌生长。262.2.5 2.2.5 结合物的稀释液结合物的稀释液 用用于于稀稀释释高高浓浓度度的的结结合合物物以以配配成成工工作作液液。为为避避免免结结合合物物在在反反应应中中直直接接吸吸附附在在固固相相载载体体上上，在在稀稀释释缓缓冲冲液液中中常常加加入入高高浓浓度度的的无无关关蛋蛋白白质质（例例如如1%1%牛牛血血清清白白蛋蛋白白），通通过过竞竞争争以以抑抑制制结结合合物物的的吸吸附附。一一般般还还加加入入具具有有抑抑制制蛋蛋白白质质吸吸附附于于塑塑料料表表面面的的非非离离子子型型表表面面活活性性剂剂，如如0.05%0.05%的的吐吐温温2020。在在间间接接测测定定抗抗体体时时，血清标本需稀释后进行测定，也可应用这种稀释液。血清标本需稀释后进行测定，也可应用这种稀释液。272.3 2.3 酶的底物酶的底物2.3.1 2.3.1 HRPHRP的底物的底物HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下：，其反应式如下：DH2+H2O2 D+2H2O上上式式中中，DH2为为供供氢氢体体，H2O2为为受受氢氢体体。在在ELISA中中，DH2一一般般为为无无色色化化合合物物，经经酶酶作作用用后后成成为为有有色色的的产产物物，以以便便作作比比色色测测定定。常常用用的的供供氢氢体体有有邻邻苯苯二二胺胺(O-phenylenediamine,OPD)、四四甲甲基基联联 苯苯 胺胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB)和和 ABTS 2,2-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)。OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用结合物最常用的底物。的底物。28TMB经经HRP作作用用后后共共产产物物显显蓝蓝色色，目目视视对对比比鲜鲜明明。TMB性性质质较较稳稳定定，可可配配成成溶溶液液试试剂剂，只只需需与与H2O2溶溶液液混混和和即即成成应应用用液液，可可直直接接作作底底物物使使用用。另另外外，TMB又又有有无无致致癌癌性性等等优优点点，因因此此在在ELISA中中应应用用日日趋趋广广泛泛。酶酶反反应应用用HCl或或H2SO4终终止止后后，TMB产产物物由由蓝蓝色色呈呈黄黄色色，可可在在比比色色计计中中定定量量，最最适适吸吸收收波波长长为为405 nm。ABTS虽虽不不如如OPD和和TMB敏敏感感，但但空空白白值值极极低低，也也为为一一些些试试剂剂盒所采用。盒所采用。HRP对对氢氢受受体体的的专专一一性性很很高高，仅仅作作用用于于H2O2、小小分分子子醇醇的的过过氧化物和尿素过氧化物氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。292.3.2AP的底物的底物 AP为为磷磷酸酸酯酯酶酶，一一般般采采用用对对硝硝基基苯苯磷磷酸酸酯酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作作为为底底物物。产产物物为为黄黄色色的的对对硝硝基基酚酚，在在405 nm波波长长处处有有吸吸收收峰峰。用用NaOH终终止止酶反应后，黄色可稳定一时间。酶反应后，黄色可稳定一时间。AP也也有有发发荧荧光光底底物物（磷磷酸酸4-甲甲基基伞伞酮酮），可可用用于于ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。302.4 洗涤液洗涤液在在板板式式ELISA中中，常常用用的的稀稀释释液液为为含含0.05%吐吐温温20磷酸缓冲盐水。磷酸缓冲盐水。2.5 酶反应终止液酶反应终止液常常用用的的HRP反反应应终终止止液液为为硫硫酸酸，其其浓浓度度按按加加量量及及比比色色液液的的最最终终体体积积而而异异，在在板板式式ELISA中中一一般般采采用用2mol/L。312.62.6阳性对照品和阴性对照品阳性对照品和阴性对照品 阳阳性性对对照照品品(positive control)和和阴阴性性对对照照品品(negative control)是是检检验验试试验验有有效效性性的的控控制制品品，同同时时也也作作为为判判断断结结果果的的对对照照，因因此此对对照照品品，特特别别是是阳阳性性对对照照品品的的基基本本组组成成应应尽尽量量与与检检测测标标本本的的组组成成相相一一致致。以以人人血血清清为为标标本本的的测测定定，对对照照品品最最好好也也为为人人血血清清，因因为为正正常常人人血血清清在各种在各种ELISA模式中可产生不同程度的本底。模式中可产生不同程度的本底。32 阴阴性性对对照照品品须须先先行行检检测测，确确定定其其中中不不含含待待测测物物质质。例例如如HBsAgHBsAg检检测测的的阴阴性性对对照照品品中中不不可可含含HBsAgHBsAg，最最好好抗抗HBsHBs也也是是阴阴性性。阳阳性性对对照照品品多多以以含含蛋蛋白白保保护护剂剂的的缓缓冲冲液液为为基基质质，其其中中加加入入一一定定量量的的待待检检物物质质，此此量量最最好好在在试试剂剂说说明明书书中中标标明明。加加入入的的量量应应与与试试剂剂的的敏敏感感度度相相称称，在在测测定定中中得得到到的的吸吸光光值值与与受受检检标标本本吸吸光光值值比比较较，可可对对标标本本中中受受检检物物质质的的量量有有一一个个粗粗略略的的估计。估计。332.72.7参考标准品参考标准品 定定量量测测定定的的ELISAELISA试试剂剂盒盒(例例如如甲甲胎胎蛋蛋白白质质癌癌胚胚抗抗原原测测定定等等)应应含含有有制制作作标标准准曲曲线线用用的的参参考考标标准准品品，应应包包括括覆覆盖盖可可检检测测范范围围的的4-54-5个个浓浓度度，一一般般均均配配入入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中.343.ELISA3.ELISA的操作要点的操作要点优优质质的的试试剂剂，良良好好的的仪仪器器和和正正确确的的操操作作是是保保证证ELISAELISA检检测测结结果果准准确确可可靠靠的的必必要要条条件件。ELISAELISA的的操操作作因因固固相相载载体体的的形形成成不不同同而而有有所所差差异异，现现在在固固相相载体一般为载体一般为9696孔板。孔板。353.1 3.1 试剂的准备试剂的准备 按按要要求求准准备备实实验验中中需需用用的的试试剂剂。ELISAELISA中中用用的的蒸蒸馏馏水水或或去去离离子子水水，包包括括用用于于洗洗涤涤的的，应应为为新新鲜鲜的的和和高高质质量量的的。自自配配的的缓缓冲冲液液应应用用pHpH计计测测量量较较正正。从从冰冰箱箱中中取取出出的的试试验验用用试试剂剂应应待待温温度度与与室室温温平平衡衡后后使使用用。试试剂剂盒盒中中本本次次试试验验不不需需用用的的部部分分应应及时放回冰箱保存。及时放回冰箱保存。3.2 3.2 加样加样 在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在加底物。加样时应将所加物加在LEISALEISA板孔的底部，避免加板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。363.3 3.3 保温保温 在在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育保温过程称为温育(incubation)。ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么么ELISA反应总是需要一定时间的温育。反应总是需要一定时间的温育。37 保保温温的的方方式式除除有有的的ELISAELISA仪仪器器附附有有特特制制的的电电热热块块外，一般均采用水浴。外，一般均采用水浴。室室温温温温育育的的反反应应，操操作作时时的的室室温温应应严严格格限限制制在在规规定定的的范范围围内内，标标准准室室温温温温度度是是指指20-2520-25，但但具具体体操操作作时时可可根根据据说说明明书书的的要要求求控控制制温温育育。室室温温温温育育时时，ELISAELISA板板只只要要平平置置于于操操作作台台上上即即可可。应应注注意意温温育育的的温温度度和和时时间间应应按按规规定定力力求求准准确确。为为保保证证这这一一点点，一一个个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。383.4 3.4 洗涤洗涤 洗洗涤涤在在ELISAELISA过过程程中中虽虽不不是是一一个个反反应应步步骤骤，但但却却也也决定着实验的成败。决定着实验的成败。ELSIAELSIA就就是是靠靠洗洗涤涤来来达达到到分分离离游游离离的的和和结结合合的的酶酶标标记记物物的的目目的的。通通过过洗洗涤涤以以清清除除残残留留在在板板孔孔中中没没能能与与固固相相抗抗原原或或抗抗体体结结合合的的物物质质，以以及及在在反反应应过过程程中中非非特特异异性性地地吸吸附附于于固固相相载载体体的的干干扰扰物物质质。可可以以说说在在ELISAELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。操作中，洗涤是最主要的关键技术。39（1 1）流流水水冲冲洗洗式式 流流水水冲冲洗洗洗洗涤涤液液仅仅为为蒸蒸馏馏水水甚甚至至可可用用自自来来水水。洗洗涤涤时时附附接接一一特特殊殊装装置置，使使小小珠珠在在流流水水冲冲击击下下不不断断地地滚滚动动淋淋洗洗，持持续续冲冲洗洗2 2分分钟钟后后，吸吸干干液液体体，再再用用蒸蒸馏馏水水浸浸泡泡2 2分分钟钟，吸干即可。吸干即可。（2 2）浸浸泡泡式式 微微量量滴滴定定板板多多采采用用浸浸泡泡式式洗洗涤涤法法。洗洗涤涤液液多多为为含含非非离离子子型型洗洗涤涤剂剂的的中中性性缓缓冲冲液液。聚聚苯苯乙乙烯烯载载体体与与蛋蛋白白质质的的结结合合是是疏疏水水性性的的，非非离离子子型型洗洗涤涤剂剂既既含含疏疏水水基基团团，也也含含亲亲水水基基团团，其其疏疏水水基基团团与与蛋蛋白白质质的的疏疏水水基基团团借借疏疏水水键键结结合合，从从而而削削弱弱蛋蛋白白质质与与固固相相载载体体的的结结合合，并并借借助助于于亲亲水水基基团团和和水水分分子子的的结结合合作作用用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。403.5.1 3.5.1 显色显色 显显色色是是ELISAELISA中中的的最最后后一一步步温温育育反反应应，此此时时酶酶催催化化无无色色的的底底物物生生成成有有色色的的产产物物。反反应应的的温温度度和和时时间间仍仍是是影影响响显显色色的的因因素素。在在一一定定时时间间内内，阴阴性性孔孔可可保保持持无无色色，而而阳阳性性孔孔则则随随时时间间的的延延长长而而呈呈色色加加强强。适适当提高温度有助于加速显色进行。当提高温度有助于加速显色进行。413.6.2 3.6.2 比色比色 比比色色前前应应先先用用洁洁净净的的吸吸水水纸纸拭拭干干板板底底附附着着的的液液体体，然然后后将将板板正正确确放放入入酶酶标标比比色色仪仪的的比比色色架架中中。以以软软板板为为载载体体的的试试验验，需需先先将将板板置置于于标标准准9696孔孔的的座座架架中中，才可进行比色。才可进行比色。比比色色时时应应先