免疫荧光技术.pptx

免疫荧光技术免疫荧光技术间接免疫荧光法测ANA兰州大学基础医学院免疫研究所 梁亚玲实验原理实验原理n以小鼠肝细胞或某些培养细胞（如人喉癌上皮细胞HEP-2）作为抗原片，将病人血清加到抗原片上。n如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。n加入荧光素标记的抗人IgG抗体，又可与ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。试剂与器材试剂与器材n抗原片（自行制备）、异硫氰酸荧光素标记的抗人IgG抗体（购买）、0.01MPBS、待测血清、阳性与阴性对照血清。n器材：荧光显微镜、孵箱、有盖湿盒（内铺浸湿海绵或纱布）、吸管、试管等。实验步骤实验步骤n1.制备小鼠肝印片（方法见实验指导），每张玻片轻印两处，分别用记号笔标记。n2.待测血清和对照血清用PBS作1：10稀释，滴加于抗原片上，放湿盒内，37温浴30min。n3.取出抗原片，用流水冲去未结合的血清，置PBS（1、2、3缸）中浸洗，每缸5min，吹干。n4.滴加稀释的FITC-抗人IgG抗体，置湿盒内，37 孵育30min。幻灯片 7n5.同步骤3浸洗，吹干。n6.滴加缓冲甘油封片，荧光显微镜检查。结果观察n细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞（本实验中为ANA阳性），不发荧光为阴性。n注意细胞核着染荧光的图像类型：均质型、周边型、斑点型、核仁型及混合型。实验讨论n注意事项：抗原片应用前需吹干；待检血清应保证新鲜。n方法评价：间接免疫荧光技术是检测ANA最常用的方法。n由于鼠肝印片细胞分布布均匀，多有重叠，冲洗时易丢失。目前临床检测采用核大、有丝分裂旺盛、核内细胞器较明显的HEP-2细胞作为基质片。