液相色谱测定饲料中呕吐毒素的不确定度分析_杨丽军.pdf

农产品加工2023 年第 1 期文章编号：1671-9646（2023）01b-0046-04第 1 期（总第 568 期）农产品加工No.12023 年 1 月Farm Products ProcessingJan.摘要：为了测定某品牌猪饲料中呕吐毒素的不确定度，采用免疫亲和柱-高效液相色谱法测定饲料中的呕吐毒素。分析不确定度来源，并对不确定度进行分析，最终可得试验的扩展不确定度。通过分析，可知试验过程不确定度的主要因素为标准物质配制、饲料均匀性，而样品称量引起的不确定度可忽略。研究可为同行业检测人员进行不确定度分析提供有效理论依据。关键词：液相色谱；呕吐毒素；不确定度中图分类号：TS224.6文献标志码：Adoi：10.16693/ki.1671-9646（X）.2023.01.044Uncertainty Evaluation for the Determination Result of Vomitoxinin Feed Grains by HPLCYANG Lijun1，XIA Nan1，FANG Shenchao2，XU Di1，ZHANG Dongdong1（1.Wuhu Institute of Technology，Wuhu，Anhui 241000，China；2.Wuhu Agricultural Products and Food Testing Center，Wuhu，Anhui 241000，China）Abstract：In order to determine the uncertainty of DON in a certain brand of pig feed，this paper adopted immune affinity col-umn-high performance liquid chromatography to determine DON in feed.The source of uncertainty was analyzed，and the un-certainty was analyzed，and finally the expanded uncertainty of the experiment could be obtained.Through analysis，it couldbe seen that the main factors of uncertainty in this experiment were the preparation of standard substances and the uniformity offeed，and the uncertainty caused by sample weighing could be ignored.This research could provide an effective theoretical ba-sis for the uncertainty analysis of the testing personnel in the same industry.Key words：HPLC；DON；Uncertainty液相色谱测定饲料中呕吐毒素的不确定度分析杨丽军1，夏楠1，方申超2，徐迪1，张冬冬1（1.芜湖职业技术学院，安徽 芜湖241000；2.芜湖市农产品食品检测中心，安徽 芜湖241000）收稿日期：2022-03-14基金项目：“DNAzyme 介导的显色法对铅离子检测方法的建立”项目（WZYZR202232）；2021 年芜湖职业技术学院特色产业学院建设项目“检验检疫学院”（2021 年 10 月 20 日）；安徽省高等学校省级自然科学研究重点项目（KJ2016A765）；安徽省质量工程校企合作实践教育基地项目（2020SJJD139）。作者简介：杨丽军（1996），女，硕士，助教，研究方向为食品质量与安全。呕吐毒素，又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxyni-valenol，DON），可由漆班菌属、镰刀霉菌属等真菌产生1-2。呕吐毒素具备高的细胞毒性和免疫抑制性，会使猪的造血系统遭受损害并造成死亡3-4，故已严格控制使用。在 GB/T 309562014 标准中指出，猪饲料呕吐毒素的含量不能超过 1.0 mg/kg5。所以，在日常生活中任何可能含有呕吐毒素的物品都应该被准确测定。不确定度是对结果的合理表征6，观察被测量值的分散性与测量结果的可用性，是表示检测值是否准确的重要参数7-10，所以实验室进行权威认可前均需进行不确定度评定。李万鹏等人11、陈曦等人12曾对饲料、参类等食品中赭曲霉毒素和人参皂苷等不同参数的测定进行不确定度评定，发现产生不确定度的主要来源有分析仪器、回收率等。目前，我国测定呕吐毒素的方法包括高效液相色谱法（HPLC）、胶体金快速试纸条法、衰减全反射-傅立叶红外光谱法（ATR-FTIR）、酶联免疫吸附法（ELISA）等13-16。但因高效液相色谱法测定结果准确且仪器操作简单并可重复使用，所以试验利用高效液相色谱法测定饲料中的呕吐毒素。GB/T 309562014 中介绍了免疫亲和柱-高效液相色谱法测定饲料中呕吐毒素含量的方法，以此方法为基础并根据 Robertson M，Kuang Y C 等人17-18对不确定度的研究，进行不确定度评定，以此为同行业研究者提供理论支持。1试剂与仪器1.1试验试剂呕吐毒素标准物质（质量浓度 50 g/mL），青岛普瑞邦生物工程有限公司提供；蒸馏水；聚乙二醇，海安石油化工厂提供；盐酸，伊犁新天煤化工有限责任公司提供；氢氧化钠，天津市福晨化学试剂厂提供；甲醇（色谱纯），绿环化工厂提供。2023 年第 1 期1.2试验仪器电子天平（感量 0.01 mg），上海韬易实业有限公司产品；LC/20A 型高效液相色谱仪、C18型色谱柱（150 mm4.6 mm，5 m），岛津公司产品；呕吐毒素免疫亲和柱，北京华安麦科生物技术有限技术产品；离心机，日本 HITACHI 公司产品；振荡器，TAITEC实验设备公司产品。2试验方法参照 GB/T 309562014 对饲料中呕吐毒素的含量测定方法进行19-21。因为蒸馏水的安全性大且无特殊气味，所以试验用水均为蒸馏水。再利用免疫亲和柱对液体进行净化，最后洗脱、检测。2.1样品处理从饲料袋中取出饲料粉碎，用间距 1 mm分样筛筛出较细饲料，称取 10.0 g 饲料放置在 50 mL 离心管中，加入 PEG 2.0 g，蒸馏水 50 mL，置于 200300 r/min 的振荡器中剧烈振荡 20 min，再在离心机中以转速 8 000 r/min 处理 5 min，从而提取饲料中的呕吐毒素。取上清液，用 0.01 mol/L HCl 或 0.01 mol/LNaOH 调节上清液 pH 值为 68，用以进行下一步净化。2.2样品净化呕吐毒素免疫亲和柱可特异性吸附液体中的呕吐毒素：将呕吐毒素免疫亲和柱插在气控操作架的注射器上，将 10.0 mL 的医用注射器连接在亲和柱上，调节开关使亲和柱保护液以约 1 d/s 的流速全部通过免疫亲和柱。吸取 2.5 mL 上述上清液注入医用注射器中，直至上清液全部通过，用 20.0 mL蒸馏水洗涤免疫亲和柱，流速约为 1 d/s 或 2 d/s，直到蒸馏水全部通过。将亲和柱从操作架取下、吹干。2.3样品洗脱液体排干后，将 1.0 mL 的甲醇注入亲和柱中，精确地把呕吐毒素从亲和柱上洗脱下来，流速约为1 d/s，所有的洗脱液收集在干净的玻璃管中，并在5060 加热条件下用氮气吹至干燥，残留物用1mL 流动相复溶，并用 0.22 m 的有机滤膜过滤至样品瓶中，上液相色谱进行分析。2.4呕吐毒素标准溶液配制试验使用质量浓度为 50 g/mL 呕吐毒素标准溶液，加入流动相稀释为 0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0 g/mL，用作试验的 6 个标准工作液。2.5液相色谱条件C18色谱柱（150 mm4.6 mm，5 m）；液相色谱检测器：荧光检测器；流动相：甲醇-水（2080）；柱温：25；流动相流速：1.0 mL/min；进样量：20 L；定量利用的是曲线的峰面积，定性利用的是保留时间22。2.6样品测定饲料测定液和 6 支标准工作液进液相色谱进行分析，可得呕吐毒素质量浓度，在此基础上求得猪饲料中呕吐毒素的最终含量。2.7呕吐毒素含量的计算公式X=pVV11 000mV21 000.式中：X饲料中呕吐毒素含量，mg/kg；p饲料测定液中呕吐毒素质量浓度，g/mL；V饲料测定液最终定容体积，mL；m饲料称样量，g；V1提取液体积，mL；V2用于净化的溶液体积，mL。3结果与分析3.1不确定度来源分析根据检测过程及呕吐毒素含量计算公式分析，认定呕吐毒素含量的不确定度来源主要是标准品工作液及配置、称量饲料、饲料均匀性、处理过程的饲料回收率、测量重复性、体积量取、定容和分析仪器引入的不确定度。3.2相对标准不确定度分量的分析3.2.1 标准品工作液及配置引入的相对标准不确定度（1）标准品浓度引入的不确定度。不同厂家生产的标准物质浓度或纯度会有一些差异，因此由此所带来的不确定度也不同。该方法使用的是呕吐毒素标准品，标准证书上会标明呕吐毒素的浓度及误差。查找标准证书可知其纯度为 0.996，最大允许误差为0.004，按均匀分布（K=3）计算，则浓度带来的标准不确定度 U(c)和相对标准不确定度 Urel(c)分别为：U(c)=0.0043=0.002 3，Urel(c)=0.002 30.996=0.002 3.（2）标准工作液配置引入的不确定度。在配置标准工作液过程中，使用的移液枪和容器等均存在误差。根据 化学分析中的不确定度的评估指南（CNAS-GL06）23可分析不确定度来源，根据国家计量技术规范 测量不确定度评定与表示 24可知误差是怎样表示的，从而根据标准证书上的误差计算出工作液配置过程中所用容器引入的不确定度。在配置中间标准溶液时，使用到的移液枪量程分别为 200 L，1 mL，容量瓶体积为 10 mL。根据 常用玻璃量具检定规程 和 移液枪检定规程 25-26的要求，可知 1 mL 的移液枪，它的最大允许误差为0.01 mL。按均匀分布（K=3）计算，可得其产生的不确定度 U(V3)和相对标准不确定度 Urel(V3)：杨丽军，等：液相色谱测定饲料中呕吐毒素的不确定度分析47农产品加工2023 年第 1 期U(V3)=0.013=0.002 3，Urel(V3)=U(V3)V3=0.005 71=0.005 7.试验采用的 10 mL 容量瓶，由以上规程可知其最大允许误差为0.02 mL。按均匀分布（K=3）计算，可得其产生的不确定度 U(V4)和相对标准不确定度 Urel(V4)：U(V3)=0.023=0.011 5（mL），Urel(V3)=U(V4)V4=0.011 510=0.001 2.使用的 200 L 移液枪，由玻璃量具使用规程可知其最大允许误差为3 L，按均匀分布（K=3）计算，可得到其产生的不确定度 U(V5)和相对标准不确定度 Urel(V5)：U(V5)=33=1.732 0（L），Urel(V4)=U(V5)V5=1.732 0200=0.008 6.在整个试验操作过程中，室温变化会使液体体积发生变化，从而产生不确定度 U(Vt)。因此计算室温变化产生的不确定度，可通过估计室温波动范围和此室温下体积膨胀系数计算，因液体膨胀系数远大于玻璃，所以玻璃的膨胀系数可忽略不计。实验室温度一般在2 范围变动27-28，溶剂以水为代表，液体膨胀系数在 20 时为 a=2.110-4，则：Vt10=aV10t=2.110-4102=0.004 2（mL），U(Vt10)=Urel(V4)=U(V5)V5=0.004 23=0.002 4（mL），Urel(Vt10)=U(Vt10)V10=0.002 410=0.000 2.所以，标准工作液配置引入的不确定度 Urel(V配置)为：Urel(V配置)=2Urel2(V3)+5Urel2(V4)+3Urel2(V5)+5Urel2(Vt10)1/2=0.018 0.综上可知，标准品工作液及配置引入的不确定度 Urel标准品为：Urel 标准品=Urel2(c)+Urel2(V配置)1/2=0.018 1.3.2.2样品称量引入的相对标准不确定度在样品称量过程中需要使用电子天平，根据 JJG981990 非自动天平检定规程 ，使用最大允许误差为0.01 g，感量为 0.01 g 的天平，不确定度按均匀分布（K=3）计算，从而得到 U(m)和 Urel(m)分别为：U(V5)=0.013=0.005 8（g），Urel(V4)=U(m)m=0.005 810=0.000 6.3.2.3样品均匀性引入的相对标准不确定度从饲料样品袋中取上下左右中间 5 个方位的样品，测定其呕吐毒素含量。测得呕吐毒素的含量分别为 0.768，0.702，0.782，0.803，0.786 mg/kg，这5 个含量的平均值 A 为 0.768 mg/kg，标准偏差 SA 为3.90%。由计算可得样品均匀性引入的不确定度 U(A)和相对标准不确定度 Urel(A)分别为：U(V5)=SAn=0.90%5=0.017 4，Urel(V4)=U(A)A=0.017 41.068=0.016 2.3.2.4样品处理过程的回收率引入的相对标准不确定度取不含呕吐毒素的空白猪饲料作为样品，向样品中添加一定含量的呕吐毒素，通过测定呕吐毒素的含量来计算回收率，再根据数学模型计算出回收率产生的不确定度。取 5 份 10 g 的饲料样品，加入含量为 1.0 mg/kg 的呕吐毒素。处理后测得呕吐毒素含 量 分 别 为 0.916，0.842，0.896，0.839，0.901，0.890 mg/kg；回收率分别为 91.6%，84.2%，89.6%，83.9%，90.1%，89.0%。平均回收率 R 为 88.1%，标准偏差 SR 为 3.20%，回收率引入的不确定度 U(R)和相对标准不确定度 Urel(R)分别为：U(V5)=SRn=3.20%6=0.012 2，Urel(V4)=U(R)R=0.012 288.1%=0.013 8.3.2.5测量重复性引入的相对标准不确定度称取一份 10 g的空白饲料，加入含量为 1.0 mg/kg的呕吐毒素，重复测定 6 次呕吐毒素含量，分别为0.916，0.923，0.916，0.916，0.905，0.921 mg/kg。平均值 X=0.916 mg/kg，标准偏差 SX为 0.6%，U(X)和 Urel(X)分别为：U(V5)=SXn=0.6%6=0.002 4，Urel(X)=U(X)X=0.002 40.916=0.002 6.3.2.6体积量取引入的相对标准不确定度根据 JJG 1962006，可知 50 mL 量筒的最大允许误差为0.25 mL，U(V6)和 Urel(V6)分别为：U(V5)=0.253=0.144 3 mL，Urel(V6)=U(V6)V6=0.144 310=0.014 4.根据 JJG 6462006，知 5 mL 移液枪的最大允许误差为0.025 mL，U(V7)和 Urel(V7)分别为：U(V7)=0.0253=0.014 4（mL），482023 年第 1 期Urel(V7)=U(V7)V7=0.014 45=0.002 8.由体积量取引入的合成相对不确定度为：Urel(V量取)=Urel2(V6)+Urel2(V7)1/2=0.014 6.3.2.7定容引入的相对标准不确定度样品洗脱阶段，洗脱液用氮气吹干，用量程 1 mL的移液枪往残留物中准确加入 1 mL 流动相溶解定容。由前述规程可知此移液枪的最大允许误差为0.01。所以，在定容阶段引入的不确定度 U(V定容)和Urel(V定容)分别为：U(V定容)=010.013=0.005 8（mL），Urel(V定容)=0.005 81=0.005 8.3.2.8分析仪器引入的相对标准不确定度试验所使用的分析仪器为 LC/20A 高效液相色谱仪，其扩展不确定度为 10%，k=2（由山东省计量测试技术研究院出具的校准证书），则由液相色谱仪引入的相对标准不确定度 Urel(E)为：Urel(E)=10%2=0.050 0.3.3相对标准不确定度的合成及扩展3.3.1各相对标准不确定度分量汇总相对标准不确定度分量表见表 1。依据表 1 数据，可计算其合成各相对标准不确定度为：Urel(x)=Urel2标准品+Urel2(m)+Urel2(V量取)+Urel2(A)+Urel2(R)+Urel2(X)+Urel2(E)+Urel2(V定容)1/2=0.059 4.合成不确定度为：U(X)=Urel(X)0.768=0.045 6.3.3.2扩展不确定度按 k=2 计算，其扩展不确定为：U=2U(X)=0.091 2.测得此品牌猪饲料中呕吐毒素的结果表示为：0.7680.0912（mg/kg）.4结论采用液相色谱法测定猪饲料中的呕吐毒素，当饲料取样量为 10.0 g，k=2（95%置信度）测得的呕吐毒素含量为 0.7680.0912 mg/kg。通过对各个不确定分量分析可以看出，标准品工作液及配置过程、体积量取过程和分析仪器是该方法不确定度的主要来源。通过评定试验过程的不确定度，可以有效地减少试验过程中的偏差，达到准确检测样品结果的目的。参考文献：杨万颖，曾国清，赖心田，等.大豆加工食品中呕吐毒素污染水平调查与分析 J.检验检疫科学，2008，18（4）：51-54.王静，马晓静.液相色谱-串联质谱内标法测定全麦粉中呕吐毒素含量的不确定度评定 J.食品安全导刊，2021（7）：60-64.古汶玉，钟国才，邓常继，等.高效液相色谱法测定小麦中呕吐毒素含量的不确定度评价探讨 J.粮食加工，2021，46（1）：87-89.甄阳光，柏凡，张克英，等.我国主要饲料原料及产品中呕吐毒素污染分布规律研究 J.中国畜牧杂志，2009，48（9）：51-54.中国国家标准化管理委员会，中华人民共和国国家监督检验检疫总局.GB/T 309562014 食品安全国家标准.饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和柱净化-高效液相色谱法 S.北京：中国标准出版社，2014.中国合格评定国家认可委员会.CNAS GL062006 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oxideN-PhenylacetamideNootkatoneOsthole1-Oxide-4-methyl-quinolineEicosane2,3-Dimethoxyquinoxaline斯巴醇氧化石竹烯N-乙酰苯胺圆柚酮蛇床子素1-氧化-4-甲基-喹啉二十烷2,3-二甲氧基喹喔啉189.16343.38114.05348.94292.01789.67113.62142.790.030.060.020.060.050.130.020.02（续表 1）12345678952