下调miR-10a对脓毒症...型大鼠ERK信号通路的影响_李莹.pdf

下调 mi-10a 对脓毒症并发急性肾损伤模型大鼠 EK 信号通路的影响李莹林建东林晓肖文彪郭清清林炳文廖秀玉(福建医科大学附属第一医院重症医学科，福建福州350005)摘要 目的分析下调微小 NA-10a(mi-10a)对脓毒症并发急性肾损伤模型大鼠细胞外信号调节激酶(EK)信号通路的影响。方法选取 60 只 SPF 级雄性大鼠，其中 15 只为空白组，其余 45 只采用经典的盲肠结扎穿孔法制备脓毒症急性肾损伤大鼠模型，最终 45 只大鼠均建模成功，随机分为模型组、上调组、下调组各 15 只。在建模后上调组尾部注射含 10 lmi-10a 过表达慢病毒悬液，下调组尾部注射10 l mi-10a 沉默慢病毒悬液。空白组、模型组不进行任何处理，24 h 后观察大鼠变化。鉴定 mi-10a 转染效率，对比各组肾功能、肾损伤、局部炎症反应相关指标、病理组织学变化、肾脏氧化应激指标及肾组织 EK 信号通路蛋白表达情况。结果与空白组相比，模型组、上调组、下调组 mi-10a 表达量明显升高(P0.05);与模型组相比，上调组 mi-10a 表达量明显升高，下调组 mi-10a 表达量明显降低(P0.05)。与空白组相比，模型组、上调组、下调组肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、肾损伤分子(KIM-1)、肿瘤坏死因子(TNF)-、白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-10、丙二醛(MDA)水平明显升高，超氧化物歧化酶(SOD)活性明显降低(均 P0.05)。与上调组相比，下调组 Cr、BUN、NGAL、KIM-1、TNF-、IL-1、IL-6、IL-10、MDA 水平明显降低，SOD 活性明显升高(均 P0.05)。与空白组相比，模型组、上调组、下调组细胞外信号调节激酶(EK)、p-EK、丝裂原活化蛋白(MEK)、p-MEK 蛋白表达量明显升高(P0.05);与上调组相比，下调组 EK、p-EK、MEK、p-MEK 蛋白表达量明显降低(P0.05)。结论下调 mi-10a 可明显抑制脓毒症并发急性肾损伤肾脏氧化应激程度，抑制局部炎症，修复肾损伤，其作用机制可能与促使 EK 信号通路失活相关。关键词 微小 NA-10a;脓毒症;急性肾损伤;细胞外信号调节激酶信号通路中图分类号 692.05 文献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0615-04;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.03.029基金项目:福建省自然科学基金项目(No 2016J01539)通信作者:廖秀玉(1970-)，女，硕士，副主任医师，主要从事急性肺损伤、脓毒症研究。第一作者:李莹(1985-)，女，博士，主治医师，主要从事老年重症医学、脓毒症研究。脓毒症属于一种可累及多个器官、系统的因感染所致的全身性炎症反应综合征，急性肾损伤是脓毒症进展过程中最为严重的一种并发症，急性肾损伤的发生在一定程度上威胁着患者的生命安全，并发此并发症的患者预后生存期均较短1，2。目前临床研究认为脓毒症并发急性肾损伤的发生与多种因素相关，微小 NA(miNA)在该病发生过程中具有重要的作用，mi-10a 属于 miNA 家族成员之一，其被证实与脓毒症并发急性肾损伤相关3。本文分析下调微小 NA-10a(mi-10a)对脓毒症并发急性肾损伤模型大鼠细胞外信号调节激酶(EK)信号通路的影响。1材料与方法1.1材料研究动物:选取60 只 SFP 级雄性大鼠，购自慕恩(广州)生物科技有限公司，动物许可证号:SYXK(粤)2020-0225，6 8 周龄，平均体重(252.1625.26)g，在相对湿度为 30%35%、温度为(23.81.5)下饲养 1 w，每日光照 24 h，明暗周期为12 h。本试验操作均严格参照动物实验伦理要求相关规定进行，且获得医院伦理委员会审批同意。主要试剂:mi-10a 慢病毒载体构建由上海吉玛公司设计并完成，酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒及相关试剂均由美国 D 公司提供，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒及相关试剂均由美国 Cayman 公司提供，小鼠抗大鼠 EK 抗体由深圳市豪地华拓生物科技有限公司提供，兔抗人 p-EK抗体由上海冠导生物工程有限公司提供，兔抗大鼠MEK 抗体由北京义翘神州科技股份有限公司(SinoBiological Inc)提供，小鼠抗大鼠 p-MEK 抗体由上海梵态生物科技有限公司提供。1.2分组及建模随机选取 60 只 SPF 级雄性大鼠，其中 15 只为空白组，其余 45 只采用经典的盲肠结扎穿孔法制备脓毒症急性肾损伤大鼠模型，对大鼠行常规20 mg/kg的 2%戊巴比妥腹腔麻醉后，以腹部正中为操作切口，制备大约 1 cm 的切口，将腹膜逐层打开，找到盲肠后对其远端行游离处理，将盲肠中的粪便挤向远端，盲肠中段使用 3 号丝线结扎，盲肠远端使用 12 号针头做穿孔处理，将少量粪便挤压至盲肠表面，之后回纳盲肠、缝合腹膜、关闭腹腔，术后大鼠进行单笼饲养。建模后大鼠表现为直肠温516李莹等下调 mi-10a 对脓毒症并发急性肾损伤模型大鼠 EK 信号通路的影响第 3 期度较建模前升高1、呼吸频率、心率为建模前的 2倍，精神萎靡、竖毛、口鼻分泌物增多及少动等表现为建模成功标准，最终 45 只大鼠均建模成功，随机分为模型组、上调组、下调组各 15 只。1.3mi-10a 慢病毒载体构建及滴定使用 Gen-Bank 查找序列获得 mi-10a 序列，构建 mi-10a 过表达转染质粒(上调)、mi-10a 沉默转染质粒(下调)，由上海吉玛公司设计并合成，并做慢病毒滴度测定(病毒滴度为 1109TU/ml)。在建模后上调组尾部注射含 10 l mi-10a 过表达慢病毒悬液，下调组尾部注射 10 l mi-10a 沉默慢病毒悬液。空白组、模型组不进行任何处理，24 h 后观察大鼠变化。1.4mi-10a 转染效率鉴定在 mi-10a 转染完成 24h 后，采用实时荧光定量聚合酶链反应(T-PC)检测 mi-10a 转染效率，随机选取每组 5 只大鼠，使用 5%苯巴比妥做常规腹腔注射麻醉后处死，迅速取肾组织，提取肾组织 NA，逆转录获得 cD-NA。以 U6 为内参照，mi-10a 上游序列 5-ACAT-CATACCCTGTAGAACCGAA-3，下游:5-GATTGGATGTTCTCCACAGTCTC-3;U6 上游序列 5-CTCGCT-TCGGCAGCACA-3，下 游:5-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3。1.5样本采集采集各组剩余 10 只大鼠尾部静脉血 1.5 ml，分离血清备用。静脉血采集完成后做实验动物常规麻醉后迅速取肾组织，分为 3 等份，其中1 份做组织切片，另外 2 份在液氮中保存用于后续指标检测。1.6肾功能、肾损伤、局部炎症反应相关指标测定采用 ELISA 测定肾功能指标肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、肾损伤分子(KIM)-1、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、局部炎症反应相关指标肿瘤坏死因子(TNF)-、白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-10 水平，取所制备的血清，将 ELISA 检测试剂盒放置于室温下做平衡 20 min 处理，之后将不同浓度的 50 l 标准品加入至标准孔中，将 50 l 待测样品加入至样本孔中，每孔中加入 100 l 的辣根过氧化物酶标记的检测抗体，密封反应孔，在温度为 37的环境下孵育 1 h，将上清液弃除后加入350 l的洗涤液，在室温环境下孵育1 min，弃除上清液，重复上述步骤 5 次，之后将 50 l 的底物 A、底物 B 加入至每孔中，37 孵育 15 min，之后终止反应，获得 Cr、BUN、NGAL、KIM-1、TNF-、IL-1、IL-6、IL-10 水平。1.7病理组织学观察取肾组织切片，脱蜡、脱水后行苏木素-伊红(HE)染色，在光学显微镜下观察肾组织病理变化。1.8肾脏氧化应激指标检测取 1 份液氮中所保存的肾组织，制备为组织匀浆，采用黄嘌呤氧化酶法测定氧化应激指标 SOD 活性，采用改良硫代巴比妥酸法测定氧化应激指标 MDA 水平。1.9肾组织 EK 信号通路蛋白检测采用 West-ern 印迹测定肾组织 EK 信号通路蛋白表达量，取1 份液氮中保存的肾组织，提取组织总蛋白，取20 g蛋白质样本，电泳 1.5 h 后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，在室温下做封闭处理，之后分别加入1 1 000 TBST 给予稀释的 EK 信号通路蛋白 EK、p-EK、丝裂原活化蛋白(MEK)、p-MEK 一抗，使用1 2 500 的辣根过氧化氢酶标记的二抗在室温下孵育处理，电化学发光(ECL)显色，使用 Labwork 凝胶图像扫描所获得胶片，以 GAPDH 为内参，计算EK、p-EK、MEK、p-MEK 蛋白表达量。1.10统计学处理采用 SPSS25.0 软件，计量资料经 Levene 法检测具备方差齐性，Shapiro-wilk 检验符合正态分布，多组间比较采用方差齐性检验，两组间比较采用独立样本 t 检验。2结果2.1转染效率鉴定与空白组(1.140.35)相比，模型组、上调组、下调组 mi-10a 表达量(2.46 0.84、3.251.02、1.990.32)明显升高(P0.05);与模型组相比，上调组 mi-10a 表达量升高，下调组mi-10a 表达量降低，有统计学差异(P0.05)，说明 mi-10a 转染成功。2.2各组肾功能、肾损伤相关指标对比与空白组相比，模型组、上调组、下调组各指标水平明显升高(P0.05);与模型组相比，上调组各指标水平明显升高，下调组各指标水平明显降低(P0.05);与上调组相比，下调组各指标水平明显降低(P0.05)。见表 1。2.3各组局部炎症反应指标对比与空白组相比，模型组、上调组、下调组各指标水平明显升高(P0.05);与模型组相比，上调组各指标水平明显升高，下调组各指标水平明显降低(P0.05);与上调组相比，下调组各指标水平明显降低(P0.05)。见表 1。2.4各组肾脏组织学观察空白组肾组织结构正常，无病变;模型组肾组织可见有细胞水肿、炎性浸润、肾小管闭塞、肾小球皱缩表现;上调组肾组织可见有较模型组更为严重的细胞水肿、大量的炎性浸润、肾小管闭塞、肾小球皱缩表现;下调组肾组织可见细胞水肿、炎性浸润现象改善，肾小管、肾小球病616中国老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷变缓解。见图 1。2.5各组肾脏氧化应激程度对比与空白组相比，模型组、上调组、下调组 SOD 活性明显降低，MDA水平明显升高(P0.05);与模型组相比，上调组SOD 活性明显降低，MDA 水平明显升高，下调组SOD 活性明显升高，MDA 水平明显降低(P0.05);与上调组相比，下调组 SOD 活性明显升高，MDA 水平明显降低(P0.05)。见表 2。2.6各组肾组织 EK 信号通路蛋白表达对比与空白组相比，模型组、上调组、下调组各蛋白表达明显升高(P0.05);与模型组相比，上调组各蛋白表达明显升高，下调组各蛋白表达明显降低(P 0.05);与上调组相比，下调组各蛋白表达量明显降低(P0.05)。见表 2、图 2。表 1各组肾功能、肾损伤及局部炎症反应指标对比(xs，n=10)组别肾功能指标Cr(mol/L)BUN(mmol/L)肾损伤指标NGAL(ng/ml)KIM-1(ng/L)局部炎症反应指标(pg/ml)TNF-(pg/ml)IL-1(pg/ml)IL-6(pg/ml)IL-10(pg/ml)空白组22.263.127.561.083.850.4922.342.13200.2420.1395.239.24227.4925.16125.2613.34模型组54.255.551)20.232.981)7.262.231)75.267.121)589.6264.251)265.4929.561)846.3585.631)215.3422.131)上调组65.496.491)2)25.965.131)2)9.342.981)2)88.979.681)2)675.2568.591)2)332.2338.461)2)1 024.25125.131)2)268.9527.161)2)下调组35.264.161)2)3)12.343.151)2)3)5.001.251)2)3)34.464.161)2)3)324.1539.561)2)3)127.4815.621)2)3)398.2642.521)2)3)159.6915.461)2)3)F/P 值11.859/0.0016.809/0.0014.063/0.00112.301/0.00113.242/0.0018.429/0.00116.395/0.0017.998/0.001与空白组比较:1)P0.05;与模型组比较:2)P0.05;与上调组比较:3)P0.05;下表同图 1各组肾脏组织学观察(HE 染色，200)表 2各组肾脏氧化应激程度及肾组织 EK 信号通路蛋白表达对比(xs，n=10)组别氧化应激相关指标SOD(U/mg)MDA(nmol/L)EKp-EKMEKp-MEK空白组50.335.499.231.241.050.251.490.461.010.451.190.52模型组25.263.251)25.132.191)2.320.281)2.460.221)2.680.791)2.660.541)上调组18.642.131)2)29.683.321)2)3.490.651)2)3.150.691)2)3.330.691)2)3.790.391)2)下调组38.793.791)2)3)15.332.141)2)3)2.150.651)2)3)2.000.341)2)3)1.990.421)2)3)2.010.241)2)3)F/P 值8.205/0.00111.699/0.0017.492/0.0014.229/0.0017.552/0.0016.792/0.001图 2各组肾组织 EK 信号通路蛋白表达3讨论在脓毒症发生发展过程中机体存在不同程度的炎症反应，随着疾病的不断进展，可导致多个器官出现急性功能性损伤，急性肾损伤在脓毒症中较为常见，其可导致机体内环境紊乱，加重或者诱发其他器官损伤，严重威胁着患者的生命安全4 6。目前临床上随着对脓毒症并发急性肾损伤的不断深入研究发现，该病的发生受多种因素的共同影响，微小 NA(miNA)属于一类长度大约为 22 个核苷酸的内源性非编码单链 NA，其参与多种生理病理过程7 9。mi-10a 属于 miNA 家族成员之716李莹等下调 mi-10a 对脓毒症并发急性肾损伤模型大鼠 EK 信号通路的影响第 3 期一，其定位于 7 号染色体上，研究发现，mi-10a 参与多种恶性疾病的发生，mi-10a 参与脓毒症的免疫应答和局部炎症反应，当炎症诱发肾脏损伤后可经基因调控作用和介导促进炎症细胞因子表达参与炎症损伤，表现为其表达异常升高10 12。陈隆望等13研究认为，经调控 mi-10a 的表达可改善脓毒症小鼠脾脏 CD4+CD25+Treg 免疫功能。本研究结果显示，经下调 mi-10a 后，脓毒症并发急性肾损伤大鼠的肾脏损伤明显被修复，表现为肾脏局部炎症、氧化应激被抑制，分析其原因可能与 mi-10a 被抑制后其所诱发的局部炎症反应和氧化应激被抑制而发挥抑制肾脏进一步损伤，促进肾功能恢复相关。EK 属于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的一个亚组，其在临床上被证实可受多种细胞因子和生长因子的激活14，15。EK 信号通路可介导局部炎症反应，可被氧化应激、细胞因子等所激活，促使炎性细胞因子过量表达，诱发组织损伤16，17。研究显示，EK 信号通路参与肾脏损伤过程，如在糖尿病肾病中其被激活，可介导肾小球系膜细胞增生肥大，进一步加剧肾脏损伤18，19。另外有报道称，在肾脏调控和损伤过程中，肾脏可经调控某些 mi-NA 的表达对一些关键的信号通路发挥作用，参与细胞增殖、凋亡，最终介导肾脏损伤20，21。本研究进一步分析下调 mi-10a 修复脓毒症并发急性肾损伤大鼠的肾脏损伤的作用机制，提示下调 mi-10a 可能经促进 EK 信号通路失活发挥肾脏损伤修复作用。但目前临床研究并未有报道称 mi-10a、EK 信号通路与脓毒症并发急性肾损伤的关系，因此本文上述研究结果还需后续研究进一步分析证实。综上，下调 mi-10a 可明显抑制脓毒症并发急性肾损伤肾脏氧化应激程度，抑制局部炎症，修复肾损伤，其作用机制可能与促使 EK 信号通路失活相关。4参考文献1Peerapornratana S，Manrique-Caballero CL，Gmez H，et al Acutekidney injury from sepsis:current concepts，epidemiology，pathophysi-ology，prevention and treatmentJ Kidney Int，2019;96(5):1083-99.2Kellum JA，Wen X，de Caestecker MP，et al Sepsis-associated acutekidney injury:a problem deserving of new solutionsJ Nephron，2019;143(3):174-8.3刘岩，任思思，马秋晟，等.血清 mi-10a、IL-35 水平对脓毒症并发急性肾损伤的诊断效能 J 山东医药，2020;60(9):44-7.4Fani F，egolisti G，Delsante M，et al ecent advances in the patho-genetic mechanisms of sepsis-associated acute kidney injuryJ JNephrol，2018;31(3):351-9.5Cleto-Yamane TL，Gomes CL，Suassuna JH，et al Acute kidney in-jury epidemiology in pediatricsJ J Bras Nefrol，2019;41(2):275-83.6Wanchoo，Stotter B，Bayer L，et al Acute kidney injury in hema-topoietic stem cell transplantation J Curr Opin Crit Care，2019;25(6):531-8.7霍锐，戴敏，樊艺，等.miNA-29a 和 miNA-10a-5p 对脓毒症所致急性肾损伤患者 28d 死亡率的预测价值 J 南方医科大学学报，2017;37(5):646-51.8李大勇，戴瑶，刘冠兰，等.mi-20a-5p 对脓毒症患者急性肾损伤的早期诊断价值 J 中国急救医学，2018;38(10):863-8，后插19佀思聪，杨伟，罗鸿宇，等.血清微小 NA-21 水平与糖尿病肾病患者氧化应激的相关性研究 J 现代生物医学进展，2019;19(9):1786-9.10杨挺，黄伟，俞慧.老年脓毒症诱导急性肾损伤患者血清 mi-NA-10a 与 IL-35 水平及临床意义 J 中国老年学杂志，2020;40(14):3037-9.11Zhou YX，Han WW，Song DD，et al Effect of mi-10a on sepsis-in-duced liver injury in rats through TGF-1/Smad signaling pathwayJ Eur ev Med Pharmacol Sci，2020;24(2):862-9.12Zheng G，Qiu G，Ge M，et al mi-10a in peripheral blood mononu-clear cells is a biomarker for sepsis and has anti-inflammatory func-tion J Mediators Inflamm，2020;2020(1):4370983.13陈隆望，邱俏檬，连洁，等.microNA-10a 对脓毒症小鼠脾脏CD4+CD25+Treg 免疫功能的影响J 中华急诊医学杂志，2018;27(2):152-8.14Sun Y，Liu WZ，Liu T，et al Signaling pathway of MAPK/EK incell proliferation，differentiation，migration，senescence and apoptosisJ J ecept Signal Transduct es，2015;35(6):600-4.15Liu F，Feng XX，Zhu SL，et al Sonic hedgehog signaling pathwaymediates proliferation and migration of fibroblast-like synoviocytes inrheumatoid arthritis via MAPK/EK signaling pathwayJ FrontImmunol，2018;9(1):2847.16Li D，Wei Y，Xu S，et al A systematic review and meta-analysis ofbidirectional effect of arsenic on EK signaling pathwayJ MolMed ep，2018;17(3):4422-32.17Zheng JM，Kong YY，Li YY，et al MagT1 regulated the odontogenicdifferentiation of BMMSCs induced byTGC-CM via EK signalingpathway J Stem Cell es Ther，2019;10(1):48.18许珊珊，赵建荣，孙德珍.EK 信号通路与肾脏疾病关系的研究进展 J 中华临床医师杂志(电子版)，2013;7(2):806-8.19Yin F，Yan J，Zhao Y，et al Bone marrow mesenchymal stem cells re-pair Cr()-injured kidney by regulating mitochondria-mediated ap-optosis and mitophagy mediated via the MAPK signaling pathwayJ Ecotoxicol Environ Saf，2019;176(1):234-41.20Wang JX，Tao YL，Wang Z，et al Mi-20a Promotes kidney injury insepsis rats through autophagyJ J Biol egul Homeost Agents，2020;34(4):1277-83.21Pan T，Jia P，Chen N，et al Delayed remote ischemic preconditioningconfers renoprotection against septic acute kidney injury via exosomalmi-21 J Theranostics，2019;9(2):405-423.2022-03-29 修回(编辑张艳利)816中国老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷