液相色谱-四极杆_静电场轨...粉和小麦粉中35种真菌毒素_张淑霞.pdf

20中 国 食 物 与 营 养第29 卷中国食物与营养2023，29(2):20-25Food and Nutrition in China基金项目:河南省重点研发与推广专项(科技攻关)项目(项目编号:212102110197);海关总署科研项目(项目编号:2020HK227);郑州海关科研项目(项目编号:2021ZZHGKY02)。作者简介:张淑霞(1983)，女，硕士研究生，高级工程师，研究方向:食品理化检测。通信作者:邢荣花(1982)，女，硕士研究生，高级工程师，研究方向:食品理化检测。液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱非靶向筛查玉米粉和小麦粉中 35 种真菌毒素张淑霞，刘胜男，祝伟霞，封琳，田亚，宋丽亚，邢荣花(郑州海关技术中心，郑州450000)摘要:目的:建立了液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱技术同时测定玉米粉和小麦粉中 35 种真菌毒素的方法。方法:样品经乙腈-水-甲酸(84:15:1)直接提取，以 0.1%(体积分数)甲酸-1 mmol/L 乙酸铵水-甲醇为流动相，采用 HSS C18SB 色谱柱(2.1 mm 100 mm，1.8 m)分离，在一级母离子全扫描加数据依赖的二级子离子扫描模式 Full MS/ddMS2(TopN)下进行采集，TraceFinder 对数据进行分析，建立了真菌毒素标准数据库，并构建了玉米粉和小麦粉中真菌毒素的非定向筛查方法。结果:35 种化合物在各自浓度范围内线性良好(20.99)，检出限为 0.5 20 g/kg，在 2 个不同浓度水平进行加标试验，回收率为 60%120%，相对标准偏差为1.2%18.6%。采用建立的方法对市场上不同品牌的玉米粉和小麦粉进行检测，部分产品检出了不同种类和含量的真菌毒素。结论:该方法快速简便，可实现玉米粉和小麦粉中真菌毒素的准确定性和定量。关键词:液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱(UPLC-Q-Exactive Orbitrap);粮食;真菌毒素;筛查随着检测技术的发展，真菌毒素的检测方法和手段越来越多。目前有关粮食及其制品中真菌毒素的检测主要有光谱法、酶联免疫法(ELISA)、胶体金快速检测法、高效液相色谱法(HPLC)1-5 等。本研究采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道离子阱质谱法建立小麦粉和玉米粉中 35 种典型真菌毒素的筛查方法，采集了标准物质化合物色谱信息，通过高分辨质谱正负离子切换 FullMS/ddMS2扫描方式分析，获得多种真菌毒素的保留时间、一级母离子和二级碎片离子精确质量数，建立了35 种真菌毒素标准数据库，并完成裂解途径解析与特征碎裂片段筛选;采用数据非依赖扫描，获取可追溯的样品质谱信息，建立非定向筛查方法。该方法具有前处理简单、检测时间短、灵敏度和准确度高的优势，适用于大批量粮食及其制品中多种真菌毒素的快速筛查。1材料与方法1.1主要仪器与设备Milli-Q 超纯水净化系统，美国 Millipore 公司;Het-tich otofix 32A 离心机，德国 Hettich 公司;S10H 型超声波清洗器，德国 Elma 公司;Heidolph multi reax 多功能振荡器，德国 Heidolph 公司;液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱(HPLC-Q-Exactive 配 Ultimate 3000 液相色谱)，美国 Thermo Fisher 公司。1.2试剂与材料甲醇、乙腈(色谱纯，德国 Merck 公司);甲酸(色谱纯，美国 ACS 恩科化学公司);乙酸铵(色谱纯，美国 ThermoFisher Scientific 公司);35 种真菌毒素混合标准储备液(浓度均为 10 mg/L，天津阿尔塔科技有限公司)(表 1)。玉米、小麦粉，购于当地农贸市场或超市。1.3方法称取2.0 g 样品于 50 mL 离心管中，加入 10 mL 乙腈-水-甲酸(84:15:1)混合提取溶液，超声提取 10min，加入3 g 无水硫酸镁、1 g 氯化钠涡旋振荡 1 min，4 000 r/min 离心5 min，移取4 mL 上层溶液至试管，在40水浴下氮气吹干，最后加入1 mL 甲醇-水-甲酸(30+70+0.1)超声溶解 1 min，涡旋振荡 1 min，过 0.22m 有机系微孔滤膜，供 HPLC-Q/Exactive 测定。1.4基质匹配溶液的配制按照样品的前处理方法处理 2 种不同基质的空白样品，得空白基质溶液，取混合标准储备液，用空白基质溶液将其逐级稀释，得到混合标准曲线溶液。DOI:10.19870/ki.11-3716/ts.2023.02.002第2 期张淑霞等:液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱非靶向筛查玉米粉和小麦粉中 35 种真菌毒素21表135 种真菌毒素标准数据库信息中文名称英文名称CAS 号分子式离子化模式母离子精确质荷比保留时间碎片1碎片2碎片3黄曲霉毒素 B1Aflatoxin B11162-65-8C17H12O6M+H313.070 6613.41285.075 38269.044 01257.080 84黄曲霉毒素 B2Aflatoxin B27220-81-7C17H14O6M+H315.086 3113.24287.091 06259.059 78297.075 38黄曲霉毒素 G1Aflatoxin G11165-39-5C17H12O7M+H329.065 5812.75243.065 03311.054 75283.060 18黄曲霉毒素 G2Aflatoxin G27241-98-7C17H14O7M+H331.081 2312.61313.070 40285.075 47245.080 81杂色曲霉素Sterigmatocystin10048-13-2C18H12O6M+H325.070 6616.48310.046 75281.044 01297.075 23赭曲霉毒素 AOchratoxin A303-47-9C20H18ClNO6M+H404.089 5416.04239.010 19358.083 60341.056 50赭曲霉毒素 BOchratoxin B4825-86-9C20H19NO6M+H370.128 5114.93205.049 51324.122 74223.060 13T-2 毒素T-2 toxin21259-20-1C24H34O9M+NH4484.254 1114.41305.138 12245.117 02233.116 85T-2 三醇T-2 toxin triol97373-21-2C20H30O7M+Na405.188 3712.34303.120 27125.057 60340.259 34HT-2 毒素HT-2 toxin26934-87-2C22H32O8M+NH4442.243 5413.26263.127 59245.117 17233.117 51麦角醇Lysergol602-85-7C16H18N2OM+H255.149 198.07240.125 67197.107 60224.106 58麦角柯宁碱Ergocornine564-36-3C31H39N5O5M+H562.302 4013.13544.292 20268.144 17223.122 91玉米赤霉烯酮Zearalenone17924-92-4C18H22O5M-H317.138 3516.10273.149 20175.038 85131.048 81-玉米赤霉烯醇-Zearalenol36455-72-8C18H24O5M-H319.154 0016.16301.145 05275.165 13160.015 30-玉米赤霉烯醇-Zearalenol71030-11-0C18H24O5M-H319.154 0016.00275.164 92301.144 93257.154 02玉米赤霉酮Zearalanone5975-78-0C18H24O5M-H319.154 0015.07275.165 07301.144 17205.086 17-玉米赤霉醇-Zearalanol26538-44-3C18H26O5M-H321.169 6515.91303.160 61277.180 57259.169 31-玉米赤霉醇-Zearalanol42422-68-4C18H26O5M-H321.169 6514.43277.180 54303.160 16259.169 62脱氧雪腐镰刀菌烯醇Deoxynivalenol51481-10-8C15H20O6M+H297.133 265.55249.111 83203.106 61261.112 0615-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇15-AcetylDeoxynivalenol88337-96-6C17H22O7M+NH4356.170 3810.33321.133 06261.111 76339.143 803-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇3-AcetylDeoxynivalenol50722-38-8C17H22O7M+H339.143 8310.35321.133 03261.111 97297.133 24伏马毒素 B1Fumonisin B1116355-83-0C34H59NO15M+H722.395 7514.37704.386 20159.028 88546.364 00伏马毒素 B2Fumonisin B2116355-84-1C34H59NO14M+H706.400 8316.16336.325 60688.389 80354.336 40伏马毒素 B3Fumonisin B3136379-59-4C34H59NO14M+H706.400 8315.91336.325 70688.389 00159.028 70镰刀菌烯酮-XFusarenon X23255-69-8C17H22O8M+H355.138 747.38137.059 71247.096 16277.106 38蛇形菌素Diacetoxyscirpenol2270-40-8C19H26O7M+NH4384.201 6812.39349.164 52307.153 87247.132 69新茄病镰刀菌烯醇Neosolaniol36519-25-2C19H26O8M+NH4400.196 599.35305.138 24245.117 13121.064 83腾毒素Tentoxin28540-82-1C22H30N4O4M+H415.233 9814.13358.212 20330.180 85302.150 24疣孢青霉原Verruculogen12771-72-1C27H33N3O7M+Na534.221 0716.46512.237 98205.059 88169.122 80青梅震颤素 APenitrem A12627-35-9C37H44ClNO6M+H634.292 9916.54616.281 07279.158 66221.116 44青霉酸Penicillic Acid90-65-3C8H10O4M+H171.065 197.14125.059 80153.054 60112.052 22霉酚酸Mycophenolic Acid 24280-93-1C17H20O6M+H321.133 2614.51207.065 12177.054 55275.127 47娄地青霉素 Coquefortine C58735-64-1C22H23N5O2M+H390.192 4513.43322.129 36193.071 91198.127 62黄绿青霉素Citreoviridin25425-12-1C23H30O6M+H403.211 5216.39297.148 32315.158 87285.148 221.5分析条件1.5.1色谱条件35 种真菌毒素依据其化学性质在正、负离子模式下同时进行数据采集，色谱条件如下:色谱柱:ACQUITY UPLC HSS C18 SB 色谱柱(2.1 mm100 mm，1.8 m);柱温:35;流动相 A 为 0.1%(体积分数)甲酸-1 mmol/L 乙酸铵水溶液;流动相 B为甲醇。色谱梯度为:0 2 min，10%B 相;2 4 min，10%B 20%B 相;4 5 min，20%B 26%B 相;5 7 min，26%B 相;7 10.5 min，26%B 60%B 相;10.5 13.5 min，60%B 相;13.5 14.5 min，60%B 95%B 相;14.5 17 min，95%B 相;17 18 min，95%B 10%B 相;18 21 min，10%B 相。流速:0.3mL/min;进样体积:5 L。1.5.2质谱条件喷雾电压:3 500 V;毛细管温度:320;离子源加热温度:300;鞘气流量:30 Arb，辅助气流量 10 Arb;质谱扫描模式:Full MS/ddMS222中 国 食 物 与 营 养第29 卷(TopN);全扫描分辨率:70 000 FWHM;AGC target:3e6;一级 Maximum IT:100 ms，扫描范围:70 800 m/z;二 级 分 辨 率:17 500 FWHM;AGC target:1e5;TopN:5;进样时间50 ms;当待碎裂的离子响应强度达到强度阈值2e4时，即送往高能碰撞解离碰撞池(HCD)进行碰撞，碰撞池能量分别为17.5、35.0、52.5 eV。1.5.3数据分析对质谱采集到的原始.AW 图谱文件，采用 XCaliber 2.0、TraceFinder 3.1 数据处理系统和Msaa Frontier 7.0 软件进行数据分析。2结果与讨论2.1前处理方法的优化甲醇和乙腈是目前常用的提取溶剂，由于甲醇溶解性强，易将样品中的酸、蛋白、脂肪等物质提取出来，而乙腈对不同极性的真菌毒素均有较好的溶解性，且其可沉淀蛋白，共提物较少，因此选用乙腈作为提取剂。由于35 种真菌毒素大部分为中性和酸性物质，提取溶液的 pH 值会影响真菌毒素的解离状态，进而影响其回收率，加入1%甲酸能抑制待测酸性物质离子化使其更多地溶于有机相，同时考虑真菌毒素的极性问题，选择乙腈:水:甲酸(84:15:1)作为提取溶剂。2.2质谱条件的优化配制35 种真菌毒素混合标准工作液，采用高分辨质谱正负离子切换 FullMS/ddMS2扫描方式分析，根据目标物分子式在正负模式和不同加合方式下分别计算精确质量数，提取离子色谱图，比较待测物在正负离子模式下的响应强度和不同加合方式下的响应强度。研究发现，玉米赤霉烯酮、-玉米赤霉烯醇、-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、-玉米赤霉醇和-玉米赤霉醇在负离子模式下响应高，母离子均为 M-H-;T-2 毒素、HT-2 毒素、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、蛇形菌素和新茄病镰刀菌烯醇在正离子模式下响应高，母离子为 M+NH4+;疣孢青霉原和 T-2 三醇的母离子为 M+Na+;其余目标物则均为 M+H+模式信号更强。选择质谱信号响应最佳的加合离子作为定量离子进行分析，通过综合考虑母离子精确质量数、保留时间和二级碎片离子等相关信息进行筛查确证，母离子峰面积定量，确保定性定量结果的准确性，35 种真菌毒素相应的提取离子色谱图见图1。图135 种真菌毒素提取离子色谱图2.3二级碎片离子的选择将从 ChemSpider 化学数据库官网上下载的35 种真菌毒素的结构式导入 Mass Frontier 7.0 软件进行模拟碎裂，研究其碎裂机理，并将结构与采集的目标物的二级碎片进行匹配，选择质荷比较大且响应较高的碎片离子为 35种真菌毒素的特征碎片离子。以黄曲霉毒素 G2为例，该化合物的裂解过程主要为电荷中心诱导的键断裂(i 断裂)、电子迁移反应和远端重排反应(rH)，脱去 1 个O 后形成 m/z313.070 66 的碎裂片段(图 2)。图 3 为采集的黄曲霉毒素 G2的二级质谱图，红色代表由 MassFrontier 预测的碎片匹配，因此选取 m/z313.070 41、m/z285.075 47和 m/z245.080 81 为其特征碎片离子。图2黄曲霉毒素 G2的部分碎裂途径及其产生的碎裂片段第2 期张淑霞等:液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱非靶向筛查玉米粉和小麦粉中 35 种真菌毒素23图3黄曲霉毒素 G2的二级碎片离子与预测生成的碎片离子匹配图2.4数据库的建立及筛查确证方法参数设定配制质量浓度为500 g/L 的 35 种真菌毒素混合标准工作液，采用 Full MS/dd-MS2扫描模式采集真菌毒素标准品的质谱图，通过一级全扫描模式确定待测物母离子的精确质量数和保留时间，同时通过自动触发，设定3 种不同碰撞能对强度大于2e4的母离子进行碰撞，获得丰富的二级碎片离子的质荷比信息，构建了目标物的筛查谱库，在本实验仪器条件下 35 种真菌毒素标准数据库信息见表1。2.5定性分析与筛查结果判断采用 1.3 的实验方法进行样品测定，在 5 ppm 质量窗口范围内进行化合物提取，当满足母离子精确质量数的质量偏差5 10-6、碎片离子精确质量数的质量偏差10 10-6、保留时间偏差30 s、目标物信号响应 S/N3、目标物同位素丰度比偏差30%，且二级谱图和高分辨质谱数据库相比，可以匹配上一级母离子和至少一个二级碎片离子等条件，且无空白基质干扰，则可判断样品中可能检出目标物。以脱氧雪腐镰刀菌烯醇筛查为例，其提取离子流色谱图见图 4A，由该图可知脱氧雪腐镰刀菌烯醇的精确质量数偏差 5 ppm，保留时间偏差为 3.6 s。母离子同位素分布见图 4B，同位素比值与脱氧雪腐镰刀菌烯醇理论同位素分布匹配度为 100%。脱氧雪腐镰刀菌烯醇的 3 个二级碎片离子精确质量误差小于0.000 01Da，结果见图 4C。由此判断样品中含有脱氧雪腐镰刀菌烯醇。图4脱氧雪腐镰刀菌烯醇筛查分析图24中 国 食 物 与 营 养第29 卷2.6定量分析方法的验证方法以母离子作为定量离子，空白基质标准曲线外标法定量。用基质空白溶液逐级稀释标准溶液至仪器能够检出的最低浓度为方法的检出限，如表 2 所示，35 种真菌毒素在各自线性浓度范围内线性良好，相关系数 2均大于0.99，其检出限满足我国真菌毒素限量规定指标。选择玉米粉和小麦粉的空白样品，分别添加 20 g/kg 浓度水平的标准溶液，按照样品处理方法进行 3 次重复性试验，回收率在 60.1%115.6%之间，变异系数在1.6%18.2%之间，真菌毒素的回收率和变异系数均符合 GB/T 274042008 实验室质量控制规范 食品理化检测的要求。表235 种真菌毒素的线性范围、检出限、相关系数、平均回收率及相对标准偏差(n=3)序号化合物线性浓度范围(g/L)相关系数(2)检出限(g/kg)玉米粉添加水平(20 g/kg)回收率(%)SD(%)小麦粉添加水平(20 g/kg)回收率(%)SD(%)1黄曲霉毒素 B10.5 1000.999 10.590.66.786.27.12黄曲霉毒素 B20.5 1000.998 00.5102.43.299.12.03黄曲霉毒素 G10.5 1000.999 50.599.23.764.15.14黄曲霉毒素 G20.5 1000.999 10.588.72.173.81.45杂色曲霉素1 1000.998 6160.911.6111.015.46赭曲霉毒素 A2 1000.997 0288.516.760.612.17赭曲霉毒素 B2 1000.996 7280.011.160.215.58T-2 毒素2 1000.998 2298.86.5106.718.69T-2 三醇10 5000.993 81062.212.799.314.410HT-2 毒素20 5000.995 72065.89.6106.04.311麦角醇0.2 1000.998 90.274.412.560.63.512麦角柯宁碱5 1000.999 9560.113.660.112.113玉米赤霉烯酮1 1000.998 6162.115.560.18.614-玉米赤霉烯醇0.5 1000.991 30.568.510.360.35.615-玉米赤霉烯醇0.5 1000.996 80.569.911.262.13.716玉米赤霉酮1 1000.998 6175.35.860.73.917-玉米赤霉醇0.5 1000.996 50.577.112.071.31.618-玉米赤霉醇0.5 1000.996 10.580.113.973.22.319脱氧雪腐镰刀菌烯醇0.5 1000.990 50.589.64.293.27.12015-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇2 1000.998 2284.23.3100.26.0213-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇2 1000.996 8281.36.888.73.622伏马毒素 B110 5000.997 61076.45.681.15.923伏马毒素 B220 5000.999 52080.36.888.310.324伏马毒素 B320 5000.999 72080.77.387.611.125镰刀菌烯酮-X2 1000.999 72108.78.592.34.026蛇形菌素2 1000.997 7287.06.8100.56.227新茄病镰刀菌烯醇0.5 1000.991 30.570.418.286.32.528腾毒素5 1000.999 85103.214.5108.317.629疣孢青霉原10 5000.998 01093.410.2107.214.730青梅震颤素 A20 5000.990 52070.215.084.411.331青霉酸0.5 1000.995 30.575.88.786.210.132霉酚酸2 1000.998 7273.917.160.310.733娄地青霉素 C1 1000.999 7160.37.860.612.434黄绿青霉素10 5000.996 81076.216.781.011.235渥曼青霉素20 5000.996 320106.511.7115.613.72.7实际样品测定采用所建立的方法筛查 10 个不同品种的玉米粉和小麦粉中的真菌毒素，其中 4 个样品检出了伏马毒素B1，含量为 17 417 g/kg，其中 3 个样品还同时检出了伏马毒素 B2和伏马毒素 B3，含量均约为 33 g/kg;10 个样品均检出了脱氧雪腐镰刀菌烯醇，含量为 17 220 g/kg，4 个样品同时检出了15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇和 3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇，含量为 3第2 期张淑霞等:液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱非靶向筛查玉米粉和小麦粉中 35 种真菌毒素2528 g/kg，1 个样品检出了玉米赤霉烯酮，含量约为6.8 g/kg，其余真菌毒素均为未检出。检测结果提示，市售的玉米粉和小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇检出率较高，但小于 GB 27612017 食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量规定的限量值，但仍应给予持续关注。3结论本研究构建了玉米粉和小麦粉中 35 种真菌毒素的筛查数据库，建立了基于液相色谱-四极杆/轨道阱质谱技术同时测定玉米粉和小麦粉中 35 种真菌毒素的筛查确证和定量分析方法。与传统的液质联用方法相比，本文建立的方法可实现正负离子模式同时扫描，具有分析速度快、灵敏度高、质量精度高的特点，且方法线性范围、检出限、回收率及精密度满足标准要求，可用于多种真菌毒素的筛查确证和定量检测，为真菌毒素污染风险监测和评估提供有效的技术支撑。参考文献 1 江涛，马良，张宇昊，等.光谱法研究黄曲霉毒素 B1 与人血清白蛋白的结合反应 J 分析化学，2016，44(1):54-60.2Var I，Kabak B，Gok F.Survey of aflatoxin B1 in helva，atraditional Turkish food，by TLC J Food Control，2007，18(1):59-62 3Lee D，Lee K.Analysis of aflatoxin M1 and M2 in commercialdairy products using high-performance liquid chromatographywith a fluorescence detector J Food Control，2015，50:467-471 4李蓉，黄莹偲，王勇，等.食品中真菌毒素检测技术的研究进展 J 中国卫生检验杂志，2015(18):3195-3198.5吴宇，王松雪，李小明，等.稳定同位素稀释-超高效液相色谱-串联质谱法快速测定植物油中 16 种真菌毒素 J 分析化学，2018，46(6):975-984.Screening of 35 Kinds of Mycotoxins in Grains and Their Products byLiquid Chromatography-Quadrupole-Exactive Orbitrap Mass SpectrometryZHANG Shu-xia，LIU Sheng-nan，ZHU Wei-xia，FENG Lin，TIAN Ya，SONG Li-ya，XING ong-hua(Zhengzhou Customs Technical Center，Zhengzhou 450000，China)Abstract:Objective To establish a rapid method based on ultra performance liquid chromatography-quadrupoleexactive orbi-trap massspectrometry(UPLC-Q-Exactive Orbitrap)was developed for the determination of 35 mycotoxins in corn flour and wheatmeal.Method Thesamples were extracted with acetone-water-formic acid(84:15:1)，separation was made using an HSS C18 SB column(2.1 mm 100mm，1.8 m)with 0.1%formic acid aqueous-1 mmol/L ammonium acetate as mobile phase，acquisition in primary master ion full scanplus data-dependent secondary sub-ion scan mode Full MS/ddMS2(TopN)，TraceFinder analyzed the data，established a standard da-tabase of mycotoxins，and constructed a non-targeted screening method for mycotoxins in corn and wheat flour.esult All the 35 kinds ofmycotoxins showed good linear relationships in their respective mass concentration ranges，and the correlation coefficients were greater than0.99.The limits of detection was 0.5 50 g/kg，The recoveries for the 35 compounds at two spiked levels mainly ranged from 70%to120%，with the relative standard deviations from 0.2%to 9.5%.The method was successfully applied to the determination of differentbrands mycotoxins in corn flour and wheatmeal on the market，and different kinds and contents of mycotoxins were detected in part of thesamples.Conclusion This method is rapid，simple and suitable for accurate qualitative and quantitative treatment of mycotoxins in cornflour and wheat flour.Keywords:liquid chromatography-quadrupole-exactive orbitrap mass spectrometry(LC-Q-Exactive Orbitrap);grain;mycotoxins;screening