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实用高效液相色谱法的建立纠错版 第6章 中性样品：反相与正相hplc（常用版）
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第6章 中性样品：反相与正相HPLC
6-1引言
如1-4节中所论述，HPLC方法建立的最佳途径由样品的性质决定。本书中所推荐的HPLC方法建立策略按一般样品或特殊样品进行分类，见图1-3。一般样品又分为中性样品和离子样品，离子样品包括含有一种或多种离子的或可电离的化合物（如酸、碱、有机盐）。本章讨论仅含有不可电离化合物的中性样品。而离子化合物的HPLC方法建立将在第7章中讨论；不过这里所讨论的许多中性化合物的分离方法也同样适用于离子样品。对于同时含有中性和离子样品的HPLC方法建立在第9章中讨论。
第一部分 反相色谱
反相色谱（RPC）是分离大多数常规样品的首选分离模式，该模式的普适性一般比其它液相色谱模式更好，更方便，获得令人满意的最佳分离效果的可能性更大。RPC色谱柱柱效高、稳定、重现性好（见5-3节）。所采用溶剂的性质决定了这种模式往往更易于检测（尤其是UV检测器），因此大多数色谱工作者采用RPC分离模式多于其它HPLC模式。
尽管许多有机化合物在（水溶液）流动相中溶解度有限，但由于RPC的进样量很少（纳克或微克）（见2-4节），实际上并不会影响其应用。当样品在RPC流动相中溶解度太小时，正相色谱（NPC）则是较好的选择。同样，那些在水溶液中不稳定的样品也可用非水溶剂以NPC 模式进行分离。
有些样品用RPC分离较困难，必须采用其它模式进行分离。含下述化合物之一的样品为特殊样品（见图1-3）：强亲水或强疏水化合物、非手性异构体、手性异构体（即对映体，见第12章）、生物大分子（见第11章）。无机离子或合成聚合物也很“特殊”，但本书中不作讨论。强疏水样品由于在RPC中被强保留，可能需采用非水条件（非水反相色谱或NARP，见6-5节），正相色谱（NPC）也可进行这类分离（见本章第二部分）。强疏水的生物大分子则可采用疏水作用色谱（HIC）分离，将在第11章中讨论。强亲水样品在RPC中往往保留不足，亲水离子样品的分离祥见第7章的讨论。由于中性亲水化合物在NPC柱上保留很强，用NPC分离很好（见6-6与6-7节）。某些亲水化合物也可以采用亲水作用色谱（HILIC）进行分离（详见6-6-5节与第11章的讨论）。
非手性异构体（包括立体异构体、非对应异构体、位置异构体等）可以采用某些RPC条件分离。但异构体混合物通常采用NPC（见6-7节）或以环糊精键合固定相的RPC（见6-3-3节）进行分离，手性对映体的分离须用特殊条件，详见第12章的讨论。
6-2反相色谱的保留
RPC的保留机理如图6-1所示。RPC分离类似于从水中萃取不同化合物至有机溶剂（如辛醇），疏水（非极性）化合物更易于萃取至非极性的辛醇相中。色谱柱（一般用C8 或C18键合相修饰的硅胶担体）的极性弱于（水-有机）流动相。样品分子在极性流动相和非极性固定相间进行分配，疏水强的（非极性）化合物保留较强。因此，对于一定组成的流动相，样品依其疏水性，保留值不同，所得色谱图如图6-1所示。亲水（极性）组分保留较弱，先从柱上流出；疏水（非极性）组分后流出；中等极性组分居中流出。
化合物的RPC保留值由其极性和实验条件（包括流动相、色谱柱和柱温）决定。如表6-1所示，有数种方式可改变RPC中大多数组分的保留值。虽然仍不清楚反相保留的详细机理，但保留值可以通过分配过程近似估算出。不考虑保留机理，人们对改变实验条件（流动相、色谱柱、柱温）产生的影响已作了深入的研究，因此可以系统地研究RPC的方法建立（如本章和第9章所述）。

图6-1非离子样品的反相分离过程示意图
黑点表示在极性流动相和非极性固定相间分配的样品分子
6-2-1流动相的影响
通过改变流动相组成或溶剂强度调整保留值（k值）较好。在RPC中，采用弱极性的强流动相相对溶质保留值较小。溶剂的极性可由极性指数P‘表示（见附录Ⅱ中表Ⅱ-2）。溶剂强度取决于所选用的有机溶剂和其在流动相中的浓度：%B，一般A代表水，B代表有机溶剂，%为体积百分比。方法建立的初始目的是使所有样品化合物有适宜的保留值。如第2章所述，用等度条件分离样品时，容许的保留值范围为0.5<k<20，不过1<k<10一般更好。
表6-1 RPC中改变保留值的方法
减小保留
增大保留
提高柱极性（氰基、C4）
降低柱极性（C8、C18）
降低流动相极性
（提高%B-增加有机溶剂）
（减少极性有机溶剂）
提高流动相极性
（降低%B-增加水）
（增加极性有机溶剂）
提高温度
降低温度
6-2-1-1 %B的选择 方法建立的有效步骤是先以极强的流动相开始试验（如图6-2中的100%A CN）。使用强流动相有可能使首次的运行时间很短，强保留化合物可全部流出。（注意：若采用100%A CN，在30~40 min后仍不出峰，应考虑采用其它办法；见第9章）。用100%A CN时，全部组分接近于t0流出（k<0.2），所以需减弱流动相。当A CN浓度以20%的步长递减到80%和60%时，分离效果如图6-2，但两次运行首峰（t0=1.0 min，k<0.5）的保留结果都不能令人满意。50%和40%A CN（都可达到0.5<k<20）均有足够的保留。若流动相非常弱（<30%A CN），则化合物D的保留值会太长（k>20，如图6-3中D线所示）。注意用50%与40% A CN时，4种化合物均已达到分离，40% A CN的分离度略好一些（化合物B与C的Rs=2.0），其代价是运行时间更长。很多样品可以采用溶剂强度调整保留值的办法充分分离。
图6-3用图6-2的保留数据，以log k对%B作图得到。K=0.5和k=20的横虚线规定了保留值可接受时的最小和最大%B值：30%~56%B（竖虚线）。RPC保留值与%B依赖关系的研究已很详尽。log k与%B之间基本呈线性关系（见图6-3）：
log k= log kW-Sφ （6-1）
其中kW是仅以水为流动相（0%B）的理论k值，S对特定组分为常数，φ是有机溶剂在流动相中的体积分数[φ=（%B/100）]。大多数小分子量（<500Da）化合物的S≈4。
式6-1和S≈4的结果说明每减少10%的B相，k值约增大2~3倍，如图6-2所示。例如当流动相由40%B减少到30%B，化合物D的k值则由9增至23（见图6-3）。3倍规则（每降低10%B，k值增加大约3倍）对于快速估算所有样品组分的保留值均可接受时的最佳%B值非常有用。

图6-2改变有机溶剂浓度对样品RPC分离的影响
条件：15×0.46 cm C18柱，流速：1.5ml/min（t0=1.0 min）。
通过系统地降低%B值（如图6-2）来研究样品保留值，对选择特定样品的最佳流动相组成是一种非常简便的办法。用梯度洗脱则是另一种更快捷的方案（见8-2-2节）。
6-2-1-2流动相强度 RPC中的流动相强度由%B和有机溶剂种类共同决定。这些影响见图6-4中三种常用RPC溶剂：乙腈（A CN），甲醇（MeOH）与四氢呋喃（THF）的溶剂强度计算图。图中的竖线对应位置为具相同流动相强度（k值）的%B值。例如：40% A CN的k值和运行时间应与50% MeOH和30% THF相似。标度略不同的流动相强度图也有报道。这些不同的标度图非常相似，只能在样品分离时作为粗略参考（准确度±5%B）。图6-4在RPC方法建立中的应用将在6-3-2和6-4-2-2节中作深入讨论。

图6-3 图6-2中样品化合物保留值（log k）与流动相强度（%B）的关系图
图6-4及其它文献数据认为RPC中溶剂强度顺序为：水（最弱）<甲醇<乙腈<乙醇<四氢呋喃（THF）<丙醇<二氯甲烷（最强）。可见溶剂强度随着溶剂极性的降低而增加。附录Ⅱ中收录了一些常用溶剂的极性指数P‘。

图6-4反相HPLC的溶剂强度计算图
除了二氯甲烷与水不混溶外，上述溶剂都可在RPC与水共用。由于二氯甲烷很强，可用于清洗被强保留样品组分污染的RPC柱（见5-4-3-2节）。乙腈（A CN）是流动相中有机溶剂的最佳首选，A CN-水流动相可用于低波长（185~210nm）UV检测，这对于许多样品是非常必要的（见3-2-2节）。另外，A CN-水流动相的黏度非常低，塔板数较高而柱压较低（二者均为理想性质）。有机溶剂的第二首选是甲醇（MeOH），再者则是四氢呋喃（THF）。这3种溶剂广泛用于RPC中，控制选择性与分离（见6-3-2节）。THF的缺点是：UV吸收高，遇氧会发生反应，更换流动相后色谱柱平衡较慢等。但据报道THF有独特的选择性。
用100% A CN无法将样品洗脱出色谱柱的情况时有发生，这些强疏水样品需用更强的流动相（如高浓度THF-水或THF-A CN）。流动相不含水的HPLC模式称为非水反相液相色谱（NARP），详见6-5节中的讨论。
6-2-2色谱柱和柱温的影响
RPC分离通常使用硅胶基质的键合相柱（见5-2-3节）。样品的保留值由色谱柱的三个特性决定：柱类型、键合相浓度、柱表面积。保留值随键合相的性质而有所不同，通常随链长的增加或键合相基团疏水性的增强而增大。例如，C18柱的保留值通常略大于C8柱（包括键合相密度等其它条件相同）。非极性、非离子化合物的RPC保留值通常遵循以下规则：
（弱）未键合硅胶≤氰基<C1（TMS）<C3<C4<苯基<C8≈C18（强） （6-2）
图6-5所示为非极性（蒽）与极性（二乙基邻苯二甲酸盐）在不同商品柱上的保留值关系图。当其它条件等同时，聚苯乙烯与多孔石墨碳柱（见5-2-3-2节）比C18柱的保留更强。柱强度可由键合相判定，如氰基柱较弱，而C18柱较强。
另外，k值与柱表面积成正比。普通柱填料（8nm孔隙）的表面积大约250m2/g，而30 nm孔隙颗粒的表面积大约60m2/g。当其它条件相同时，30 nm孔隙（低表面积）色谱柱的k值大约为8nm孔隙色谱柱的k值的1/4（60：250）。因此，大孔隙（表面积低）的氰基柱很弱，其保留值大大低于小孔隙（表面积大）的C18柱。
改变色谱柱强度可以控制样品的保留值（k范围），而大多数情况下，改变溶剂强度（%B）更为有效和方便。但有两种例外应注意：疏水性强的组分保留也强，有时即使采用NARP条件（见6-5节）也不可能从强色谱柱（如小孔隙C18柱）上洗脱出来。这种情况下用较弱的色谱柱（如大孔隙的氰基柱）可能会使样品较快洗脱出来。同样，用小孔隙、强保留的C18柱或（尤其是）石墨碳柱，则利于强亲水样品的洗脱。
对于非离子样品，通常柱温增加10C，k会减少1~2%，因此可通过改变温度来控制样品保留值（k范围），这与改变%B类似。但这种方法在RPC中并不常用，因为改变溶剂强度更加有效。对于疏水性极强的样品，在较高温度下采用极强流动相（NARP见6-5节）和极弱色谱柱效果更好。
6-3反相色谱的选择性
调整样品保留值k的范围仅是获得充分分离的第一步。当整体保留值令人满意时（即0.5<k<20），可能有必要改善不同谱峰的峰间距或选择性（α）。RPC中用来改变中性样品选择性的主要参数有三个：流动相组成、柱类型和柱温，其中改变流动相的组成通常最为有效且方便，故应首先考虑。改变温度虽然非常方便，但对α值的改变通常较小，不过α的很小改变有时可足以分离许多样品。
6-3-1溶剂强度的选择性
降低%B的主要影响是导致各样品组分的k值增加。如图6-2所示，%B的改变使化合物A~D的k值发生了类似的改变。当%B从30%增加到56%时（0.5<k<20范围内），相邻峰对（如化合物B/C）的选择性（α）变化不大，虽然%B的降低使分离度不断增加。但其它情况下，相邻峰间距会随%B显著变化。这种溶剂强度选择性的说明见图6-6的示例。采用60%与50% A CN分离时，A/B是关键峰对（即采用>50% A CN的流动相时，化合物A与B的分离度较差）。由于降低% A CN能改善A与B的分离，所以当溶剂强度进一步降低至40% A CN时，这两个峰的分离将更好，如图6-6所示。当溶剂强度再降低时，峰对C/D的分离效果变差，所以当采用40% A CN时，化合物C与D又成为关键峰对。
当%B的改变使某峰对的分离度增加而另一峰对的分离度降低时（如图6-6），关键峰对的归属也将发生变化。最佳样品分离度的理想%B值是两峰对的分离度相同（此时两者都为关键峰对）。在的示例中，采用中间溶剂强度（45% A CN），可获得最佳分离。
图6-5蒽与二乙基邻苯二甲酸盐在不同商品柱上的保留
一般来说，%B值有一个合适的范围，使样品中各组分均获得可接受的k值。在此范围中，特定的流动相组分（%B）能使整体样品分离度最佳（如图6-6的45% A CN）。最佳溶剂强度（%B）的选择可通过试-凑试验获得。40%和50% A CN的运行结果表明，中间浓度的% A CN可使2个峰对（A/B和C/D）都较好地分离。如10-2节中所述，也可用计算机程序通过最少的运行次数、更精确的获得最佳%B值。
很多研究表明，通过改变溶剂强度来改变选择性在RPC中往往是非常重要的，这种方法在调整峰间距方面的一大优点是可以通过不同%B值找出样品的最佳保留值范围（0.5<k<20）。这样在为获得充分分离而调整选择性时，需要进行的试验次数一般不多。例如图6-7中所示为硝基取代苯衍生混合物分离的溶剂强度选择性实验。以60%MeOH作为流动相（见图6-7a），峰7/8（箭头所指）为关键峰对；而采用50%MeOH（图6-7c）峰2/3（箭头所指）为关键峰对。本例中的最佳分离是二者中间的流动相组成：55%MeOH（图6-7b）。
溶剂强度选择性的应用主要受样品保留值范围的限制[色谱图中首峰（a）与末峰（z）的保留值之比k z / k a]，若保持0.5<k<20，该比值最大可达40，如该比值较大（如>20），可允许的%B变化范围将很小，以改变%B而使选择性发生变化的可能性也很小。当采用梯度洗脱时，这种限制将不太重要（见8-4-2节）。
6-3-2溶剂类型选择性
改变有机溶剂类型来改变峰间距与改善分离度是一种常用的方法。按照溶质会影响选择性的那些特征（包括酸性、碱性、偶极性等）选用不同的RPC溶剂。不同的有机溶剂可根据这些特性进行分类（如图2-6和6-8所示）。这种选择性表示法（溶剂选择性三角形）在2-3-2节中已有详述。溶剂分类对实际方法建立的意义在于一般只需选用3种溶剂，即可能将选择性达到要求的结果。图6-8中的3种水溶性溶剂A CN、MeOH、THF的选择性（阴影部分）有很大差别，其紫外吸收和黏度也较合适，因此推荐这3种溶剂在RPC中作溶剂类型选择性试验。通过适当地混合这3种溶剂可获得理想的选择性（如果特定样品需要的话）。

图6-6 溶剂强度选择性：改变有机溶剂百分比对样品RPC分离的影响
条件：15×0.46 cm C18柱，流速：1.5ml/min
图6-9所示为一溶剂类型选择性的典型示例。50% MeOH改为25%THF使4种化合物的流出顺序完全逆转，但应注意即使流出顺序未发生逆转，选择性的这种变化仍是非常有用的。对于关键峰对，通过改变一些实验条件，即使选择性（或α值）有微小增加（2~5%），对获得较好的分离也可能是非常必要的。
图6-10所示为一个更复杂的溶剂类型选择示例，采用50% MeOH（如图6-10a）分离取代苯的混合物，重叠峰1/2为关键峰对。用THF 代替MeOH，改变%B保持相同的溶剂强度（见图6-4）。采用32% THF（如6-10b）时1/2的分离很好，但此时2/3又成为关键峰对。因此，这两种流动相的某种混合应能更好地分离该样品，以50% MeOH和32% THF按1：4比例混合可得到如图6-10c的结果。还应注意，本例中当由50% MeOH改为32% THF时，谱峰4~6的相对保留发生了逆转。
优化选择性时，除A CN、MeOH和THF外，有时也使用二氧六环、丙醇、二甲亚砜、2-甲氧乙醇等。对于某些样品，用这些替代溶剂可能提供有益的选择性差别，但也必须考虑到它们的一些弊端：UV吸收高、柱压高、以及纯度与稳定性问题。在RPC中，改变溶剂类型通常是改变选择性、分离多组分中性样品最有效的措施。因此，在建立复杂样品的反相分离方法时，调节流动相中有机溶剂种类和浓度应作为一种主要手段。
6-3-3柱类型对选择性的影响
改变柱类型可改变选择性。在图6-11三种不同柱类型的色谱图中，峰间距确有较大变化。例如峰6和7在苯基和C18柱上的分离效果好于氰基柱。相反，峰6和7在氰基柱上的分离效果好于C8柱。该样品在这种特定的流动相中，苯基柱的分离最好。改变%B或溶剂类型有可能进一步改变各柱的选择性，所以对图6-11的样品来说，苯基柱可能并非唯一的（或最好的）色谱柱。
如6-2-2节中所述，改变柱类型也会改变整体样品组分的保留值。几种除莠剂在键合官能团不同的3种色谱柱上，采用35% A CN-水进行的分离见图6-11。溶质在“较强的” C8柱与苯基柱上保留值较大（且运行时间较长），在“较弱的” 氰基柱上则较小改变色谱柱通常不如改变流动相类型效果明显，因此，只有在调整溶剂强度或溶剂类型改变选择性不成功时，才尝试改变柱类型来改善选择性与分离。如果改变色谱柱，必须针对新柱重新优化流动相。也有研究表明，氰基、苯基与C8或C18柱的选择性差异很大。通常应先试验C8或C18柱，然后再试氰基柱、苯基柱。
如果只可以采用一种有机溶剂时，通过改变柱型来改变选择性则较有利。例如，样品需要在UV短波长检测（<210nm）时只有A CN和水可用。如某些样品组分或全部样品不稳定或可能与流动相发生反应时，可能需用特殊的有机溶剂。类型相同、来源不同的色谱柱，也可能会影响RPC峰间距。如X牌号的C18柱被替换成Y牌号的C18柱，尽管柱长和直径相同，选择性可能发生改变（尤其是离子样品），但我们不推荐这种方法。这种选择性差别由很多原因引起，包括：所采用硅胶的类型、键合化学的技术和类型，是否经过封尾处理及其它因素（见第5章中详述）。不同批次的柱填料之间的差别通常难以控制，导致使用一段时间后，柱重现性不好，RPC方法的普适性变差。该问题的讨论详见7-3-3节。
上述建议的一个重要例外是不要用来源不同的色谱柱作为改变选择性的手段。用多官能团（聚合物）硅烷制备的大孔隙RPC C18柱对形状不同的（由于分子内的聚集）多环芳烃（PAH）似乎有独特的选择性。因此，这种由多官能团硅烷制得的大孔隙柱，适用于PAH样品混合物的分离。采用PAH测试混合物有可能说明C18键合情况与相应柱的选择性差异，见附录Ⅴ。选择性相似的RPC柱在一些HPLC法中可以相互替换，可由附录Ⅴ中表Ⅴ-2色谱柱的分类中推断（亦见图5-9）。
环糊精（CD）键合的柱填料也可用于RPC，尤其是用于分离对映异构体（见12-5节）。这些CD柱在分离其它（非手性）异构体中也很有效。在这方面，CD键合柱分离异构体可与正相HPLC相比美。见6-6-1节与图6-12中的示例。
6-3-4温度对选择性的影响
采用RPC分离中性化合物时，k值通常随着柱温升高而降低（见6-2-2节）。然而，非离子溶质的选择性随温度变化很大的情况不多。因此，大多数情况下，改变柱温对改变非离子化合物的选择性，进而改变分离的效果不大。但在图6-13中的情况也可能发生，化合物2与4是两种卷曲分子（邻-三联苯和间-三联苯），而其余4种化合物是平面稠环多环芳烃。当柱温升高时，平面化合物相对保留值的降低比非平面化合物快。于是关键峰2~4在温度变化时峰间距发生了变化；峰3在360C时重叠入峰4中，当温度升高时向峰2迁移，480C时与峰2重叠。而在420C时达到该流动相/固定相系统的最佳峰间距。

图6-7硝基取代苯分离效果与溶剂强度（甲醇百分含量）的关系
箭头所指为关键峰对
6-4反相色谱中非离子样品的分离条件的优化
第9章中总结的RPC方法建立的初始运行方案适用于各种常规样品（离子的或中性的）。用此方法可以使大多数中性样品达到理想的分离。也可以通过其它方式更有效地进行方法建立，尤其那些需另外方法建立实验、改变选择性的样品。本节中对这样一些技术加以阐述，它们包括：

图6-8 改良的溶剂选择性三角形
阴影区域为MeOH、AcN、THF的选择性
图6-9 RPC中溶剂类型的选择性
（a）50% MeOH-水；（b）25%THF-水；
色谱峰：1对-硝基苯酚；2对-二硝基苯；3硝基苯；4苯甲酸甲酯
溶剂类型和%B的使用（见6-4-2-2节）
1有机溶剂混合使用（见6-4-2-3节）
2柱类型及%B的改变（见6-4-2-4节）
3不同溶剂和不同柱型的结合使用（见6-4-2-5节）
6-4-1开始
为非离子化合物建立RPC方法的初始推荐条件见表1-3的总结。选取这些参数必须兼顾分离度、运行时间和柱压。15或25 cm 、5μm C8或C18柱为首选，以未经缓冲p H的A CN-水为流动相。流速1~2ml/min。为了避免由于室温变化可能引起的保留值和选择性变化，柱温应控制在35~450C之间，但温度控制对于分离非离子样品不很重要。如果开始不知道UV检测的最佳波长，在210nm检测可能是最佳首选（见3-2-2节）。

图6-10 RPC中溶剂类型的选择性
（a）50% MeOH-水；（b）32%THF-水；（c）10% MeOH-25%THF-水。
色谱峰：1苯乙醇；2苯酚；33-苯丙醇；42，4-二甲基苯酚；5苯；6二乙基邻苯二甲酸酯。
中性样品等度分离的RPC方法建立的推荐方法归纳如表6-2。首次实验采用等度方法或梯度方法均可。此处假设采用等度；如首次应用梯度实验（这样更好）见8-2-2与9-2-1节的讨论。图6-2与6-6所示为采用初始等度分离（100% A CN）与下面进行的试-凑法实验，使样品保留值达到满意（0.5<k<20）。保留太强或太弱的样品需要特殊处理（见9-2-2节）。另外，若峰拖尾、柱塔板数（N）较低或峰形不理想，则应在继续进行方法建立实验前解决。这往往需要采用第7章中所讨论的解决方案。
6-4-2优化选择性
使样品保留值范围合适的% A CN确定之后，可能有必要调整选择性以改善分离（即：使运行时间更短或分离度更佳）。如本章前面所述，有许多方法可改变选择性：表6-3中以改变选择性的优先顺序列出了一些可能的方法。
6-4-2-1溶剂强度（%B）的影响 改变溶剂强度（%B）方法简便，是分离重叠峰的首选。如图6-6与6-7中所示，调整%B使保留值范围合适时（0.5<k<20），溶剂强度对选择性的影响通常很显著。最终选择%B时应综合考虑保留值范围（0.5<k<20）、分离度和运行时间。若% A CN值不能得到适宜的选择性（峰重叠），则必须进一步改变实验条件。当研究用另一方式改变选择性时，最好重新优化%B使0.5<k<20。
6-4-2-2溶剂类型与%B的影响 对于大多数中性样品来说，当有机溶剂由A CN替换为MeOH或THF时，那些以A CN作溶剂时重叠的峰对的峰间距和分离度有可能发生很大变化。见图6-14所示的甾体样品的分离。图6-14左侧3张色谱图的流动相分别为24%A CN、45%MeOH与19%THF为流动相，各图末峰的k=20（即溶剂强度相同）。其中24%A CN的峰1和3未分开，而用45%MeOH和19%THF时，该2峰可达基线分离。另外，MeOH和THF的峰4和峰6相对位置发生了变化。
图6-14也说明改变溶剂时，优化%B对选择性及保留值范围（0.5<k<20）的重要性。在以A CN作溶剂的情况下，24%A CN（末峰k=20）及42%A CN（首峰k=0.5）均未能将峰1和3分开。这种情况下，即使再进一步调节%B（修饰剂不变）以改变选择性，也不可能成功分离该混合物。用MeOH作溶剂，当浓度为45%时（末峰k=20），4/5为关键峰对，但浓度为65%时（首峰k=0.5），1/2则为关键峰对。改变%B关键峰对也改变时，%B有一中间值可使分离效果最好，48%MeOH可达到最佳分离（Rs=1.5）。以THF为溶剂时，浓度在19%<%B<37%范围内保留值可达到0.5<k<20。19%THF时峰1/2为关键峰对，而37% THF时峰4/6为关键峰对。中间浓度值24% THF分离最好（Rs=1.9）。

图6-11柱类型对选择性的影响
色谱柱：Zorbax SB-CN，SB-苯基，SB- C8，15×0.46cm；流动相：A CN-水（35：65）；1.0ml/min；220C；254nm UV检测
图6-14的分离列举了简捷的方法建立策略，该策略适于10种或10种以下组分的样品分离。第一组实验的目的为了解%A CN与分离（Rs及运行时间）的关系。通常经4或5次运行试验，即可找到最佳%A CN，如图6-2和6-6所示。如果分离结果可以接受，则不需进一步实验。但对于图6-14的甾体样品，仅改变%A CN不能成功地进行分离，因此应试验其它溶剂。采用溶剂强度计算图（图6-4）可以很快通过少数几次试验估算出最佳% MeOH。在图6-14中，48% MeOH在12 min内分离可以达到（Rs=1.5）。
如用A CN 或MeOH作溶剂，分离度或保留时间均不能满意，应再作几次附加实验，以找出THF浓度的最佳值。在本例中，24% THF可在9 min内达到Rs=1.9。尽管这是图6-14中所示的最佳分离效果，但事先并不能预测哪一种溶剂（A CN、MeOH、THF）最好。如果溶剂类型和%B的某种结合可以成功的话，图6-14的逐步试验步骤则可确保用最少的实验次数获得成功的分离。

图6-12 采用环糊精键合柱对异构体的分离
条件：25×0.46cm Cyclobond Ⅰ色谱柱
30% A CN-缓冲液（p H4.5）；2.0ml/min；350C
表6-3改善选择性的方法a
改变溶剂强度

优点：简单方便，在0.5< k <20范围内通过改变%B寻找合适的α；
缺点：控制<时不如改变溶剂有效，尤其对于等度洗脱时k（末峰）>>k（首峰）的样品；
改变溶剂类型（ACN，MeOH，THF）
优点：当仅改变%B不足时，改变α值的有效方法（α值的变化可能比仅改变%B要大）
缺点：由于需要更多的实验，故不如改变%B方便；
混合不同溶剂
优点：分离一对以上的关键峰对时，可提供中间选择性；扩展了改变溶剂类型的应用范围；
缺点：需要大量实验——不方便；
改变柱类型
优点：在改变选择性方面与改变%B的效果相当。当仅有一种溶剂类型（如ACN）可用时，改变柱类型则非常有用；
缺点：不方便，因为必须安装新柱，并需重新平衡。将不同类型色谱柱串联起来使用，以获得中间选择性的实用价值不大（而混合溶剂则较好）
改变柱温
优点：如柱温可以控制，则非常方便；
缺点：α随柱温的变化通常小于其它条件；
a大致以重要性优先顺序。可结合使用两种或两种以上方法（如改变柱类型时，同时也可改变溶剂强度和/或溶剂类型）。
表6-2反相方法建立的推荐步骤
1调整%B，使0.5<k<20，（1<k<10更好）
2检查峰拖尾或塔板数低的现象
3如果必要，调整选择性
a微调%B
b改变有机溶剂
c混合有机溶剂
d改变柱类型
e改变温度
4优化柱条件（柱长、颗粒尺寸、流速）

图6-13改变柱温对多环芳烃混合物选择性的影响
样品：1蒽；2邻-三联苯；3荧蒽；4间-三联苯5苯并[9，10]菲；6芘
条件：31.4×0.46cm C18柱，80%A CN-水 1.0ml/min；柱温如图示
6-4-2-3混合有机溶剂的使用 图6-15中列出了另一种优化溶剂类型选择性的有效方法。该方法在保持溶剂强度恒定的同时，按各种可能的比例混合A CN、MeOH和THF。图6-15中实验1先调节%A CN，使达到0.5<k<20的分离结果。若分离不充分，进一步实验（实验2，3……）直到分离结果满意。基于实验1的最佳%A CN，从溶剂强度计算图中（图6-4）选出实验2（MeOH）和3（THF）的流动相。实验4~7的流动相由实验1~3的流动相按不同比例混合配制。例如，运行4中流动相由等体积的实验1和2的流动相混合制得。
流动相
混合流动相的体积
实验1
实验2
实验3
实验4
1
1

实验5
1

1
实验5

1
1
实验6
1
1
1
经过图6-15中的7次实验，即可得到使样品获得最佳分离度的流动相组成。如前所述，该步骤可借助计算机，实现方法建立自动化（见10-3节）。不过，图6-16的示例说明逐步方法建立如不采用计算机时，可能不必用图6-15的全部7次实验。

图6-14 溶剂强度和溶剂类型的优化
样品：1强的松，2可的松，3氢化可的松，4地塞米松，5皮质酮，6 11-脱氧皮醇
条件：15×0.46cm Zorbax C18柱；2.0 ml/min；350C；

图6-15 基于乙腈、甲醇与四氢呋喃混合液的RPC选择性优化方案。
所有流动相强度相等（见图6-4）。
图6-16中的9组分样品为取代萘的混合物。开始用改变% A CN的方法进行实验，结果A CN可得到0.7<k<8（保留值可接受）：图6-16的实验1。该浓度52% A CN有2组峰对重叠（2/3，6/7），所以需改变选择性以改善分离。根据溶剂强度计算图（图6-4），下一次实验（运行2）需采用63% MeOH。峰对2/3和6/7在此实行仍重叠。由于峰对6/7在运行1和2中均未分开，所以MeOH和 A CN的混合液不可能成功分离该样品的所有组分。（这一结论由图6-16中实行4的色谱图证实，但实际工作中无需进行该次实验）
由于A CN和MeOH的混合液不能分离该样品，采用THF进行下一实验（实验3）。所需%B（39% THF）的估计值可从溶剂强度计算图（图6-4）中得到。注意对于某些样品，图6-4给出的近似值可能需经一次或二次附加运行，以获得与用A CN的实验1相似运行时间的% MeOH或% THF。在实验3中，峰对3/4和8/9发生重叠，但这些关键峰对与在实验1（2/3，6/7）或实验2（1/2，6/7）中不同。因此将运行3的流动相与运行1或2的流动相进行混合，分离效果将有所改善。

图6-16 取代萘的溶剂选择性实验的7份色谱图
色谱柱：15×0.46cm Zorbax C8柱；流速：2.0 ml/min；温度：400C；
如将实验2和3的流动相混合（实验6，MeOH-THF），峰对3/4发生重叠，峰对1/2则勉强分离；再将实验6和3的流动相混合，峰对3/4仍未分离；而混合实验6与2的流动相可使峰对1/2勉强分离。因此，接下来应试验混合实验1和3的流动相。该试验（5）结果表明色谱图中所有9个峰均达到了基线分离。由于运行5的关键峰对（6/7）在实验3中分离更好，故可将少量实验3的流动相与大量实验2的流动相混合，或许能有进一步的改善。对于含1对以上关键峰对的分离，最佳流动相组成应是使2对关键峰对的分离度相等（本例中为6/7与3/4或8/9）。
多项研究表明有机溶剂（A CN、MeOH、THF）的最佳混合一般不会都用到所有3种溶剂，然而对于困难的分离，实验7可提供关键峰对相对移动的其它选择性信息。因此，为更有效地进行RPC方法建立，应首先考虑图6-15中三角形边缘上的条件（仅为实验1~6）。4种溶剂的实验7应最后、且只有需要时才进行实验。
图6-14中所示的方法建立过程可作为图6-15运行的开始。这样，用图6-14实验找出图6-15中运行1，2和3的最佳%B值。而对于需要复合条件（改变溶剂强度和类型，见图6-14与6-15）的困难样品，% A CN 、% MeOH与%THF的最佳值在最终运行中得到。这样，图6-14与6-15的2种分离方式高度互补，非常有效。更重要的是，那些不需要严格控制选择性的样品，仅通过几次实验即可分离，如图6-6（改变%B）或图6-14（利用不同溶剂类型）所示。
6-4-2-4柱类型与%B的影响 柱类型（C8、C18、苯基、氰基）也可用于改变选择性，与改变%B结合使用时尤其有效。不同类型的色谱柱有特定的选择性，调整%B可以进一步微调其选择性，改变保留时间范围，也可能缩短分离时间，如图6-17所示的取代苯甲酸样品的分离。尽管该样品并不适于我们对“中性”样品的定义，但在低p H值条件下分离，样品中的所有化合物实际上皆为中性。
6-17a所示为用3支不同色谱柱（C8、苯基、氰基）、C8柱使样品保留最大（末峰k=20）的% MeOH分离该样品的色谱图。此时苯基柱的分离效果最佳，在C8柱上峰4/6部分重叠，而氰基柱上1/2重叠。然而，由于该样品组成简单及保留范围有限，可以用更强的流动相，如图6-17b所示调节有机溶剂浓度可使首峰k=0.5，[如C8柱可用52% MeOH（b）替代26% MeOH]。
相同色谱柱用不同% MeOH（如图6-17a与b），峰间距（即溶剂强度选择性）有显著变化。在每支柱上的通过2次运行可以系统地调整% MeOH获得最佳分离度，见图6-17c。苯甲酸样品在氰基柱上选用最佳值32% MeOH时，可分离更好，相当于苯基柱的分离效果（Rs=2.0），但运行时间更短（5 min替代13min）。

6-4-2-5不同溶剂与柱类型的结合使用 溶剂种类和柱类型选择性的结合使用对于分离极困难的样品可能有效。图6-18概述了这种方法。用图6-15方法，首先在C8或C18柱上研究溶剂种类的选择性。若分离结果满意，无需再进一步改善选择性。若分离不充分，用氰基柱重复图6-15方法（注意：一支色谱柱的最佳流动相会与另一柱的不同）。若这些实验结果仍不满意，用苯基柱重复图6-15实验。
图6-18的步骤已用来分离20种PTH氨基酸混合物。图6-19所示为各柱型的最佳分离结果，及采用苄基柱（与苯基柱相似）时以5% A CN，15% MeOH与13% THF作流动相获得的最佳整体分离度（Rs=1.2）。注意：该分离效果只是比C8（Rs=0.9）或氰基柱（Rs=1.0）略好一些。
6-5非水反相HPLC

图6-17 苯甲酸的混合物在3种类型柱上的分离
非水反相色谱法（NARP）主要用于强疏水性样品的分离，这种样品通常在色谱柱上保留极强或即使采用100% A CN作为流动相时仍然无法洗脱出（如脂类或合成聚合物）。NARP分离的流动相通常为高极性（A）和低极性（B）有机溶剂的混合液。一般来说，A溶剂为A CN或MeOH，B溶剂为THF、氯仿、二氯甲烷、丙酮、甲基-叔-丁基醚（MTBE）或这些溶剂的不同混合液。改变%B与强溶剂B的种类可控制样品的保留值。改变温度也可用于优化分离。
图6-20所示为NARP分离标准品（b）与番茄提取液（c）混合液中各种胡萝卜素（a）的结果。番茄红素（峰1）是图6-20 c样品中含有的主要胡萝卜素。强疏水样品一般不溶于水溶剂，这也是采用NARP分离该类样品的另一个原因。
NARP的方法建立类似于使用通常的水-有机溶剂流动相的RPC法。一般首选采用A CN（A）和THF（B）的混合液作为初始流动相。若用100%THF，样品保留仍太强，可以用极性较弱（更强）的B溶剂（如二氯甲烷或氯仿）替换，但应用二氯甲烷或氯仿时分别要求UV检测波长不得小于236nm与250nm。
目前NARP的使用不多，这可能是因为通常采用二氯甲烷作为B-溶剂限制了低波长UV检测；很多经NARP分离的样品可采用正相色谱方便地分离。

图6-17取代苯甲酸的混合物在3种类型柱上的分离
条件：15×0.46cm 5μm 柱；流动相见图示。
缓冲液25mM枸橼酸（p H2.5）；2.0 ml/min；350C。
（a）% MeOH调整