牙周炎实验动物的口腔解剖生理结构与模型建立_郝思维.pdf

Chinese Journal of Practical Stomatology Jan.2023 Vol.16 No.1牙周炎是一类发生于牙周支持组织的炎症性疾病，是导致成年人牙列缺损的重要原因之一。牙周炎的研究离不开动物模型的建立。因尚无统一的牙周炎动物建模共识，目前相关实验通常根据研究目的、研究方法、实验条件等选择不同的动物种类及建模方法。除了与人类口腔解剖生理结构最相近的非人灵长类动物外，其他常用实验动物的口腔结构均有各自的特点。因此，正确选择实验动物并建立与人牙周炎相似程度更高的实验模型，是研究牙周炎病因学、病理学、病程变化及临床防治等的重要前提，是推进牙周炎骨缺损治疗技术发展的基础。本文根据不同种类实验动物口腔解剖的生理特征，就牙周炎实验动物的选择与模型建立做一综述。1口腔生理结构与建模方法1.1啮齿类常用的实验动物中，啮齿类动物包括小鼠、大鼠和地鼠。其中以小鼠和大鼠为主。两种鼠类均属于单牙列、异形牙的哺乳动物，全牙列共有16颗牙齿，单侧上颌或下颌恒牙：切牙1颗、磨牙3颗，切牙与磨牙之间有一段无牙区域。鼠类的上、下切牙为圆弧状，牙齿基部不闭合，不能形成根尖孔，因此可以终生生长，这与人牙差异较大，故一般不用作牙周炎造模牙位。而鼠类的磨牙与人牙相似，上下颌自第一磨牙至第三磨牙基金项目：国家自然科学基金（81470754）作者单位：1.中国人民解放军总医院第一医学中心口腔科，北京 100853；2.解放军医学院，北京 100853；3.中国人民解放军总医院第三医学中心口腔科，北京 100039通信作者：郭斌，电子信箱：综述DOI：10.19538/j.kq.2023.01.018牙周炎实验动物的口腔解剖生理结构与模型建立郝思维1，丁柏辰2，刘梦蝶3，胡巍2，郭斌1摘要：正确选择实验动物，构建以研究目的为导向的牙周炎动物模型，对牙周炎分子生物学机制的研究及临床防治均有重要意义，是药物研发和新技术先行先试的必要过程。目前，对于牙周炎研究的最佳实验动物的选择及模型构建尚无普遍共识。文章对常用牙周炎实验动物模型从解剖结构、建模方法、疾病模型特点等方面进行分析，并以研究目的为基准对牙周炎实验动物模型的选择做一综述。关键词：牙周炎；实验动物模型；组织工程中图分类号：R78文献标志码：AOral anatomy and physiological structure and model establishment of periodontitis experimental animalsHAO Si-wei*，DING Bai-chen，LIU Meng-die，HU Wei，GUO Bin.*Department of Stomatology，the First Medical Center，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，ChinaCorresponding author：GUO Bin，E-mail：Abstract：Choosing experimental animals correctly and building a correct animal model of periodontitis is the key to thestudy of molecular biological mechanism of periodontitis as well as clinical prevention and treatment.It is a necessaryprocess for drug development and new medical technology evaluation.At present，there is no universal consensus on thebest experimental animals selection or the effective construction method in periodontitis animal models.In this review，we analyse the periodontitis animal models from oral anatomy，modeling method and model characteristics，and reviewthe selection of experimental animal model periodontitis based on the research purpose.Keywords：periodontitis；experimental animal model；tissue engineering104中国实用口腔科杂志 2023年 1月 第 16卷 第 1期逐渐减小且形态特征愈发简化。其中，第一磨牙牙冠周径及根分叉最大且位置较高，牙根粗壮，在咀嚼运动中承担主要功能。此外，第一磨牙是除切牙外最靠近近中的牙齿，在排除舌体的干扰后，通常选择双侧上下颌第一磨牙为理想的牙周炎建模牙位。与人类牙齿不同，鼠类牙齿排列紧密，几乎不可见两牙之间的接触区与空隙。此外，由于第一磨牙与第二磨牙面形态近乎一致，往往给研究者造成视觉上难以确定牙间隙位置的情况。有研究通过显微CT观测小鼠与大鼠的牙齿解剖形态，发现上颌第一磨牙共有8个牙尖，从近中向远中排成3列，主尖数目依次为3、3、2个1-2。在开口状态下，上颌第一磨牙自舌面观可见2个牙尖，此方法可辅助定位上颌第一、第二磨牙间隙位置，此位置是牙周炎建模的理想区域。小鼠与大鼠的牙齿自洁能力均优于人类，在成年及老年鼠中自然发生牙周炎罕见，故常使用结扎法、饲喂法、接种细菌法等建立牙周炎模型。结扎法：即用细丝线、橡皮圈或正畸结扎丝，在实验动物的牙颈部靠近龈沟内进行结扎。其主要目的是通过结扎造成软垢和菌斑堆积，刺激炎症产生。研究发现，采用单纯结扎法一般可在4周内使目标牙出现菌斑堆积、牙龈红肿出血、牙周袋形成，甚至牙槽骨吸收、根分叉区暴露等现象。但由于个体差异，建模成功率仅约40%60%，且牙周炎的严重程度也具有较大差异3。饲喂法：通常使用高糖高黏度饲料喂养实验动物。高黏度软食可在牙齿周围黏附及嵌塞，增强菌斑的附着与聚集。高糖饮食使实验动物血糖升高，降低了牙周组织抗感染能力，为致病菌提供了更好的营养及生存环境，有利于炎症的加重4。但此方法引入了高糖因素，可能对实验结果造成干扰。接种细菌法：其原理是通过改变小鼠牙周正常菌群，增加致病性细菌数量来促进牙周炎的发生发展。牙周炎的致病菌包括伴放线放线杆菌、牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体等。接种方法包括涂抹、注射和与饲料混合喂食。研究表明，单一使用一种细菌可诱导小鼠发生牙周炎，而使用两种及两种以上细菌混合感染可比单一细菌感染造成的牙槽骨吸收更为严重5。定位注射细菌脂多糖法：相比于接种细菌，是一种更快速、直接、可控的建立牙周炎模型的方法，革兰阴性菌细胞壁中的脂多糖是公认的引发内源性免疫反应的炎性刺激物6。但此方法是实验动物对单一细菌内毒素的急性炎症反应，不能比拟细菌复杂的致病过程，因此该方法多用于评价各种药物制剂对炎症的治疗效果。但是，单独使用以上某种方法建立牙周炎模型的成功率偏低，为了缩短建模时间，增强建模效果和成功率，越来越多的学者根据实验目的采用多种方法联合建模7-8。1.2兔类兔属于双牙列、异形牙的哺乳动物，拥有乳牙、恒牙两套牙列，一般于出生后23 d时乳牙开始脱落，27 d时恒牙萌出。当选用兔作为牙周炎动物实验模型时，应当选择恒牙已完全萌出的成年兔。兔的牙列一般为：单侧上颌恒牙，切牙2颗、前磨牙3颗、磨牙3颗；单侧下颌恒牙，切牙1颗、前磨牙2颗、磨牙3颗。与啮齿类动物不同，兔全口恒牙均为终生生长，牙根尖呈开放状，需要通过咀嚼高纤维饲料主动磨耗以维持正常牙齿长度。兔上颌前磨牙及磨牙解剖牙冠由近中至远中先增大再减小，所有牙齿向颊侧倾斜；而下颌前磨牙及磨牙解剖牙冠由近中至远中逐渐减小，所有牙齿方向较为垂直。因此，根据解剖学形态认为下颌第一前磨牙是理想的牙周炎建模牙位。兔通常不能自然发生牙周炎，需采用结扎法、接种细菌法、定位注射细菌脂多糖法等诱发牙周炎，但炎症对牙周组织破坏的个体差异较大。通过对兔口腔微生物菌群的鉴定，发现其中包括具核梭杆菌、中间普氏菌、微消化链球菌、伴放线放线杆菌等，这些微生物与人类牙周病的细菌学特征一致9。对牙周组织进行组织切片观察，发现其生理及病理状态下促炎和抗炎机制与人类相似。此外，兔常被用于心血管疾病的研究，兔主动脉可探究脂质沉积和血管变化。虽然不能发生自发性动脉粥样硬化，但通过高胆固醇饲养可在较短的时间内发生病变10。以兔作为牙周炎动物模型为炎症相关动脉粥样硬化的研究提供了一种新的研究途径。由于兔牙自身解剖结构特殊，牙根部也有牙釉质覆盖，且牙齿处于终生生长及磨耗状态，牙周在牙齿生长过程中会不断改建与更新，使得牙周炎有自愈的可能。Oortgiesen等11观察到兔口腔中牙周膜在损伤后，牙周膜干细胞增殖分化105Chinese Journal of Practical Stomatology Jan.2023 Vol.16 No.1并重新形成附着，因此提出以兔作为牙周炎动物模型并不理想。1.3犬类人们对犬类口腔疾病的观察由来已久。犬属于双牙列、异形牙的哺乳动物，单侧上颌恒牙：切牙3颗、尖牙1颗、前磨牙4颗、磨牙2颗；单侧下颌恒牙：切牙3颗、尖牙1颗、前磨牙4颗、磨牙3颗。然而，对比人类的牙列与咬合，犬类缺乏侧方运动，前磨牙无咬合接触，相邻牙齿之间存在无接触区，龈沟浅且龈沟液较少。微生物检测发现，龈上菌斑主要由革兰阳性球菌组成；龈下菌斑主要为厌氧革兰阴性球菌和杆菌，包括牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌等12，与人类相似。牙周炎的患病风险及严重程度与犬类的遗传易感性和年龄相关，通常随着年龄的增长而增加，最终导致牙齿脱落。牙龈炎在犬类中普遍存在，可伴有探诊出血、牙龈肿胀，如未有效控制龈上和龈下菌斑，经发展可出现牙结石、牙龈退缩甚至牙槽骨缺损。对自然患病的犬进行牙周探诊，可见全口牙周病变程度不均，根分叉区的骨量丧失比单纯牙根周围更加严重，因此第一、二前磨牙通常最先缺失13，这使得后续实验受到限制。为避免这一不利因素，有研究指出可在自然发病前对犬牙颈部进行丝线结扎，诱导出现实验性牙周炎14。此外，还有通过手术方法来模仿人牙槽骨缺损的模型，方法为对犬进行龈沟内切口，翻黏骨膜瓣并去骨，制造实验所需的骨缺损大小及范围15。然而，在术后饲养过程中可能因牙周炎症改变手术制造的缺损形态。1965年至今，除了非人灵长类动物以外，犬一直被认为是评价牙周病学中组织再生技术及研究再生基础机制的理想模型。虽然犬易于管理和获得且体型合适，但随着人们对动物伦理问题的愈发重视，犬的日常饲养要求相比小型实验动物更高，使得犬在牙周病和组织再生研究中作为实验模型的比重减少。1.4小型猪类小型猪在临床常被用于模拟人类疾病的研究。小型猪的口腔颌面部与人类相似，它属于双牙列、异形牙的哺乳动物。单侧上颌或下颌恒牙：切牙3颗、尖牙1颗、前磨牙4颗、磨牙3颗。小型猪在出生时第三乳切牙和乳尖牙就已萌出，其余乳牙则在出生后的6 8个月内完全萌出；恒牙在出生后4 24个月逐渐替换乳牙16。在牙周组织方面，小型猪龈沟深度为2 3 mm，龈沟底部存在较长的结合上皮。小型猪在约6个月时随着发育会出现自发性牙龈炎，通常有菌斑和牙石堆积；视诊可见牙龈肿胀，龈缘有1 2 mm线性充血，探诊易出血；组织病理学检查可见炎细胞浸润，血管扩充，与人类牙龈炎相似；约16个月时，可出现重度牙周炎，症状包括4 5 mm深牙周袋、牙槽骨丧失、牙槽嵴顶低平等。同其他实验动物一样，自发性牙周炎的病变程度具有牙位差异和个体差异，通常需要采取人为干预建立牙周炎模型。孟焕新等17使用牙线结扎小型猪前磨牙及磨牙牙颈部共8颗，之后对实验组颊侧龈沟及结扎线上涂抹混合菌，包括牙龈卟啉单胞菌、变形链球菌和黏性放线菌。经4 8周诱导后，实验组均出现活动性牙周炎症状，牙龈出血明显，牙周袋加深，附着丧失。在去除结扎线并停止涂菌后，可观察到牙周有一定的自愈性，但不能恢复至结扎前水平。Li等18则通过手术方法在第三前磨牙和第一磨牙根分叉颊侧手术造成实验性牙槽骨缺损，模拟牙周炎骨缺损。自19世纪以来，小型猪已被广泛应用于医学研究，其优势在于身体结构及生理和病理机制等与人相似、可模拟多种人类疾病、利于新技术治疗方法的研发、动物伦理学上更易接受等。相比于使用非人灵长类动物涉及的许多道德伦理和传染病等问题，小型猪作为大型动物模型，未来可能在牙周疾病研究领域成为主流动物模型。1.5非人灵长类非人灵长类动物在口腔结构、功能及疾病的发生发展都与人类非常相似。在国内，一般选用恒河猴或食蟹猴。这两种动物牙列为单侧上颌或下颌恒牙：切牙2颗、尖牙1颗、前磨牙2颗、磨牙3颗，与人类牙列相同。两种猕猴恒牙的替换在出生后第18 80个月，恒牙的牙齿形态、咬合和牙周组织均与人相近，不同之处在于它们的尖牙明显较长，尖牙与侧切牙之间存在空隙，而切牙之间仅边缘有接触19。因此，对于牙周疾病的研究，使用前磨牙和磨牙区域最佳。组织学上，非人灵长类动物龈沟底由非角化结合上皮构成，牙龈结缔组织中的炎细胞较少且分布稀疏，牙周膜中的胶原纤维排列紧密。食蟹猴与恒河猴均106中国实用口腔科杂志 2023年 1月 第 16卷 第 1期可自然形成牙菌斑、牙结石。微生物学检测发现，菌斑以革兰阳性球菌和杆菌为主，而牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体等牙周炎致病菌含量相对较少。随年龄增长，两种猕猴牙周组织可出现增龄性变化，如牙骨质增厚、牙周膜宽度减小、牙周膜纤维钙化以及牙周血管退行性改变等20。因此，当以研究中老年慢性牙周炎为目的时，选择相近年龄的非人灵长类动物更能符合口腔生理状态。自发性牙周炎在年轻猕猴中较为罕见，建立牙周炎模型需要人为诱导干预，多采用结扎法及接种细菌法，同期饲喂软食来促进菌斑堆积。结扎法是将正畸橡皮圈或不可吸收的缝合线材料放置于磨牙釉牙骨质界处，每1 2周更换结扎材料，加速牙菌斑的积累，直到出现牙龈红肿出血、牙周袋形成等牙周炎典型表现。接种细菌法是通过口服或涂抹人类牙周炎病原体，干扰其正常口腔微生物菌群。而在评价新材料或新技术修复骨缺损的研究中，则常通过外科手术法建立相同骨缺损范围21。非人灵长类动物的解剖结构等与人类最为相似。但由于其可能携带对人类有致死性的传染性病毒和细菌，且相比于其他实验动物，以非人灵长类动物为实验对象必须经过严格伦理审查，不适于一般性实验研究，故建议优先选择使用其他实验动物建立牙周炎模型。2实验动物种类的选择2.1生物学机制研究目前，对于牙周炎的致病机制在学界已达成共识，即多种牙周致病菌构成的龈下菌斑生物膜刺激牙周组织发生免疫反应，在宿主的免疫应答过程中产生组织破坏。其中，多形核白细胞释放的活性氧可直接对牙龈组织、牙周韧带造成氧化损伤，并间接诱导破骨细胞性骨吸收；同时大量炎性因子释放，更加促进了炎细胞的趋化募集及活化增殖，使炎性反应加重，牙周破坏加剧22。目前针对牙周炎发展过程的研究，正在向炎症及再生相关的特定基因调节方面深入。小型实验动物模型的优势在于具有高成本效益，且小鼠的基因组测序比较完善。随着转基因或基因敲除小鼠的产生23，使通过体内实验阐述牙周炎进展机制及相关基因调控牙周修复再生过程成为了可能24。此外，小鼠蛋白质抗体已被广泛研发使用，相比于其他物种，在阐明牙周炎分子机制研究中更具优势。牙周炎与全身系统性疾病关系的研究，也是当前热点之一。在已有的经典系统性疾病动物模型上，附加牙周炎因素，可研究两种疾病间的关系。兔是研究心血管疾病常用的实验动物，高胆固醇饲料喂养可在短期出现主动脉脂质沉积和血管病变，手术造成动脉壁损伤可形成动脉粥样硬化病变10。Li等25通过对大鼠注射链脲佐菌素诱导糖尿病后，结扎法诱导牙周炎模型，阐明了氧化应激和核因子-E2相关因子2与糖尿病性牙周炎中牙周的破坏密切相关。2.2牙周组织再生研究由于口腔的特殊环境，因牙周炎造成的骨缺损难以自我修复，依靠组织工程实现牙周再生是未来临床治疗的发展方向。牙周再生是指因创伤或牙周疾病造成的牙周组织破坏完全恢复其正常结构和功能的过程。组织工程涉及干细胞的应用、生物相容性材料的开发与新操作技术的实施。在临床应用前，需要通过动物实验进行体内研究评价。引导组织再生术是已在临床中成熟应用的治疗方法。在1980年便有使用犬进行牙周组织再生的实验26。犬是研究菌斑控制对牙周再生和新附着形成影响的良好动物模型，证明了当阻止上皮细胞结合于牙骨质时，牙周膜细胞可选择性再生于牙根部，牙周膜具有再生潜力。在犬口腔中可通过手术方法制造不同骨缺损类型及大小，有助于研究骨缺损的特征与牙周再生治疗效果之间的关系。干细胞介导的组织工程技术治疗牙周缺损是当前研究的热点。Zhao等27利用小型猪制造临界骨缺损，通过植入含有牙周膜干细胞的纳米羟基磷灰石/壳聚糖/明胶的三维多孔支架材料，研究其对牙槽骨再生的作用。通过在根尖乳头干细胞过载分泌型卷曲相关蛋白2基因并植入牙周骨缺损区，12周后小型猪牙周探诊深度减小，牙龈退缩和附着丧失得到改善28。关于红白美学的研究，Aragoneses等29在小型猪上下颌软组织缺损区植入脱细胞真皮基质，经90 d随访观察，可见组织愈合过程中上皮层、角化层厚度及新生血管数目较对照组107Chinese Journal of Practical Stomatology Jan.2023 Vol.16 No.1显著增加，且未出现炎细胞浸润及排异反应。3结语啮齿类及兔类动物适合进行疾病相关的生物学机制研究，而犬类、小型猪类及非人灵长类动物则更适合进行组织愈合等方面的研究。在炎症反应中，观察动物机体内分子间信号通路传导过程，再结合转基因和基因敲除技术的应用，可从多角度分析牙周炎相关的分子生物学机制。啮齿类及兔类的牙列形态虽然与人差异较大，但此类动物饲养简单、价格便宜、操作难度较小，适宜初级阶段的基础性研究。犬类、小型猪类及非人灵长类动物的牙齿解剖结构与人牙齿结构类似。使用此类动物可对结果数据进行更直观的解读，易于将研究成果进行临床转化。非人灵长类动物具有与人最为相似的口腔结构，并且也存在天然牙菌斑、牙结石及相似的口腔微生物菌群。从组织学上讲，它们的牙周膜结构也与人类近乎相同。但受制于伦理学要求，研究人员更倾向于使用犬和小型猪。因此，当实验目的旨在评价即将用于临床试验的新材料、新技术时，选择相对大型的实验动物更为适宜。参考文献1汤颖，顾永春，朱琦.C57BL/6小鼠牙齿解剖形态的显微CT观测 J.实用口腔医学杂志，2018，34（1）：47-52.2叶程心月，汤颖，刘超，等.SD大鼠牙列的显微CT观测 J.实用口腔医学杂志，2019，35（6）：794-799.3李凌俊，周靓，崔迪，等.人防御素3基因转染及金纳米颗粒处理后的牙周膜细胞对大鼠牙周炎形成影响研究 J.中国实用口腔科杂志，2018，11（4）：218-223.4 Messer JG，La S，Kipp DE，et al.Diet-induced generalized periodontitis in lewis ratsJ.Comp Med，2019，69（5）：384-400.5王译凡，刘娜，胡巍，等.慢性牙周炎和IgA肾病大鼠模型的建立及其相关性初步分析 J.中华老年口腔医学杂志，2019，17（1）：18-24.6 Mustafa H，Cheng CH，Radzi R，et al.Induction of periodontaldisease via retentive 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