7-下一代测序技术-冯涛合肥.pdf

2016/12/6 1 新一代测序技术原理 及其在PGS/PGD中的应用 冯 涛 18513820105 测序 新一代测序技术介绍 生物信息 基于测序技术的生物信息基本概念 应用 基于新一代测序的诊断和筛查应用 PGD 基于新一代测序的胚胎植入前诊断 目录 PGS 基于新一代测序的胚胎植入前筛查 Step4 数据分析 Step1 模板制备 Step2 文库构建 Step3 上机测序 步骤 新一代测序技术步骤 Illumina/Solexa测序技术-Sequencing By Synthesis(SBS)5 3 5 C A G T C A T C A C C T A G C G T A G T C A G T C A G T C A G T 待插入视频1 2016/12/6 2 Easy,automatic fluid connections.Match the size of the Ion chip to your application.Low cost,convenient,single use device.Ion torrent测序技术 待插入视频2 Step4 数据分析 Step1 模板制备 Step2 文库构建 Step3 上机测序 步骤 新一代测序技术总结 DNA提取 DNA片段两端连接Adapter 扩增&平行测序 数据基本处理、序列比对等 碱基互补配对原则 平行测序 测序 新一代测序技术介绍 生物信息 基于测序技术的生物信息基本概念 应用 基于新一代测序的诊断和筛查应用 PGD 基于新一代测序的胚胎植入前诊断 目录 PGS 基于新一代测序的胚胎植入前筛查 为什么需要生物信息分析 测序文件大 信息抽象 Step4 变异解读 （致病突变 or 多态性）Step1 数据基本处理 （过滤接头、低质量序列等）Step2 序列比对（序列定位到参考基因组）Step3 变异查找（SNP/Indel、CNV、结构变异等）测序数据分析基本步骤 2016/12/6 3 Coverage of Genome Lander-Waterman statistics 020406080100012345678910Coverage(%)Depth 序列比对 测序深度 数据分析基本概念 区域覆盖 变异查找 数据分析基本概念 数据分析基本概念总结 序列相似性比对无处不在，贯穿整个分析过程：不仅是参考序列定位，过滤接头和污染序列、序列拼接、基因功能注释等都离不开序列比对；变异查找依赖于目标区域的测序覆盖状况：微小变异（SNP、小片段Indel 等）检测需要完整的覆盖度（Coverage）和较高的测序深度(Depth）；反之，低覆盖和低深度测序可应用于大片段、乃至染色体级别的CNV分析；数据库（人参考基因组、dbSNP、1000Genom es、OMIM等）在数据分析过程中扮演着极为重要的角色。测序 新一代测序技术介绍 生物信息 基于测序技术的生物信息基本概念 应用 基于新一代测序的诊断和筛查应用 PGD 基于新一代测序的胚胎植入前诊断 目录 PGS 基于新一代测序的胚胎植入前筛查 新一代测序的应用：Panel&WES&WGS Panel：多个目标基因或区域合并在一个包内同时检测 WES：全外显子组测序（Whole Exome Sequencing）WGS：全基因组测序（Whole Genome Sequencing）WGS WES Panel 1 Panel 2 99%2%0.02%新一代测序的应用：Panel&WES&WGS 类别 Panel WES WGS 目标区域 数个数百个基因（100Kb5Mb）全基因的外显子区域（60Mb）全基因组（3Gb）测序数据量需求 低（500X）中（100X）低（30X）相对优势 成本低，周期短，解读更容易 覆盖所有基因的编码区域，性价比高 覆盖全基因组序列，可检测结构变异 相对劣势 检测范围窄 忽略了非编码区域的检测，无法检测结构变异 成本高，周期长 2016/12/6 4 基因检测Panel 疾病名称 筛查基因 杜氏肌营养不良/贝氏肌营养不良（临床症状较 轻）DMD 遗传性非综合征耳聋 GJB2 常染色体隐性遗传的 非综合征型耳 聋 SLC26A4 苯丙酮尿症 PAH 四氢生物蝶呤缺乏症 PTS、GCH1、QDPR 软骨发育不全(ACH)FGFR3 甲基丙二酸血症 MMAA、MMAB、MUT、MMA CH C 肝豆状核变性(Wilsons disease,WD)ATP7B 先天性肾上腺皮质增生症(CAH)CYP21A2-地中海贫血 HBB-地中海贫血 HBA1、HBA2 线粒体遗传病 mtDNA 眼皮肤白化病型(OCA2)OCA2 眼皮肤白化病型(OCA1)TYR 眼皮肤白化病型(OCA4)MATP,SLC45A2,AIM1 眼皮肤白化病型(OCA3)TYRP1 成人型多囊肾 PKD1、PKD2 婴儿型多囊肾 PKDH1 结节化硬化症 TSC1、TSC2 神经纤维瘤 NF1、NF2 视网膜母细胞瘤 RB1 视网膜色素变性 RHO、RPGR、CRB1 蚕豆病 G6PD 染色体 基因 基因亚 区 参考序 列 突变名 称 杂合性 突变意 义 疾病 12 PAH Exon5 NM_000277.1 c.482TC(p.F161S)Het 已知致 病突 变 苯丙酮 尿症 检测结果：Capture Statistics Sample Target region(bp)306497 Total Reads#1921300(100%)Reads#mapped to genome 1878054(97.7%)Reads#mapped to target region 1588550(82.7%)Mean depth of target region(X)722.4 Coverage of target region(%)100 Fraction of target covered=4X(%)100 Fraction of target covered=10X(%)99.9 Fraction of target covered=20X(%)99.8 Capture specificity(%)78.8 全外显子组测序（Whole Exome Sequencing）Capture Statistics Sample Target region(bp)64190747 Total Reads#139027102(100%)Reads#mapped to genome 137156158(98.7%)Reads#mapped to target region 108606633(78.2%)Mean depth of target region(X)132.9 Coverage of target region(%)99.3 Fraction of target covered=4X(%)98.4 Fraction of target covered=10X(%)97.4 Fraction of target covered=20X(%)96.1 Capture specificity(%)64.1 全外测序数据统计：染色体 基因 基因亚 区 参考序 列 突变名 称 杂合性 突变意 义 疾病 4 AGA Exon3 NM_000027.3 c.302CT(p.A101V)Het 已知致 病突 变 天冬氨 酰葡 萄糖 胺尿 症 17 GUCY2D Exon8 NM_000180.3 c.1694TC(p.F565S)Het 已知致 病突 变 先天性 黑朦 症 检测结果：全基因组测序（Whole Genome Sequencing）Chr1 Position Chr2 Position PE-Reads Split-Reads chr16 53086212 chr1 10883070 19 10 chr16 53086206 chr1 10883065 7 7 WG S检 测断 点：测序 新一代测序技术介绍 生物信息 基于测序技术的生物信息基本概念 应用 基于新一代测序的诊断和筛查应用 PGD 基于新一代测序的胚胎植入前诊断 目录 PGS 基于新一代测序的胚胎植入前筛查 PGS定义及适用人群 PGS是指在进行IVF助孕时，在胚胎植入着床之前，对早期胚胎进行染色体数目和结构异常的检测，从而挑选正常的胚胎植入子宫，以期获得正常的妊娠。PGS定义 降低早期流产风险 提高临床妊娠率及活产率 减少遗传缺陷患儿的出生 提高单胎妊娠率 意义 高龄 反复流产 反复种植失败 不明原因引起的不孕症 适用人群 序列比对 基于新一代测序的PGS检测原理 0Kb 10Kb 20Kb 30Kb 40Kb 50Kb 0 10Kb 20Kb 30Kb 40Kb 50Kb 窗口计数 1 2 3 4 5 6 7 2016/12/6 5 GC校正 均一化 隐马尔可夫模型 基于新一代测序的PGS检测原理 基于新一代测序的PGS检测 案例分享：患者28岁，曾自然流 产两次，后 夫妇 双方 进行 染色 体核 型分 析：男方 46,XY,t(1,13)(p 31,q 31)，女方 46,XX正常。此次选择进行IVF，共获取了 7个胚 胎进行 易安 顺检 测，其中 2、5号 胚胎 正常，可 用于 移植。下 图为 部分 胚胎检 测结 果：结果报告：-1(p36.33-p3 1.1)(79.08Mb)+13(q31.1-q34)(2 6.47Mb)1 结果报告：正常 2 结果报告：-1(p36.33-p3 1.1)(79.08Mb)-13(q11-q31.1)(64.06Mb)-22(q11.1-q13.33)(33.1 3Mb)4 结果报告：-13(q11-q34)(91.32Mb)7 10000 embryo database 2016/12/6 6 PGS显著降低流产率显著降低流产率 Age(y)IVF(-PGS)c IVF(+PGS)d 流产率2 35 14.4%3.3%35 27.1%8.6%PGS显著提高临床妊娠率显著提高临床妊娠率 IVF(-PGS)a IVF(+PGS)b 临床妊娠率1 45.8%70.9%a.仅依赖形态学分析 b.通过PGS和形态学分析 c.SART(Society for Assisted Reproductive Technology)数据统 计 d.Hodes-Wertz.Idiopathic recurrent miscarriage is caused mostly by aneuploid embryos.Fertil Steril.2012,98:67580.PGS临床意义 参考文献：Zhihong Yang,Jiaen Liu,et al.Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients:results from a randomized pilot study.Mol Cytogenet.2012,5:24.技术延伸：技术延伸：MT Ratio 参考文献：1）Fragouli E,Spath K,Alfarawati S,et al.Altered levels of mitochondrial DNA are associated with female age,aneuploidy,and provide an independent measure of embryonic implantation potential.J.Plos Genetics,2015,11(6).2）Wells D,Kaur K,Grifo J,et al.Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantationJ.Journal of Medical Genetics,2014,51(8):553-62.测序 新一代测序技术介绍 生物信息 基于测序技术的生物信息基本概念 应用 基于新一代测序的诊断和筛查应用 PGD 基于新一代测序的胚胎植入前诊断 目录 PGS 基于新一代测序的胚胎植入前筛查 PGD定义及适用范围 PGD是在已知父母患有或携带遗传病的情况下对其胚胎进行检测，筛选不带有该已知遗传病的胚胎进行移植的方法，PGD是遗传阻断的最有效的手段。PGD定义 挑选不带疾病的胚胎移植，阻断遗传病的遗传 避免因盲目地移植胚胎而出现在孕期终止妊娠的情况，解决因基因异常引起的不孕或流产问题 减少遗传缺陷患儿的出生 意义 有家族遗传病史的夫妇 患有遗传病的夫妇 生育过或流产过遗传病患儿 适用人群 A a A a A A A a a a a a a A WGA Sequencing Sequencing A（50%）a（50%）A（100%）a（100%）A（25%）a（75%）全基因组扩增的问题 5 目前常用单基因病PGD方法 基于SNP连锁分析的Karyomapping 特点：通常是Bi-allele；密度高，平均0.3kb/个，分布均匀 基于STR连锁分析的多重PCR 特点：多态性高（125个重复单元）密度低，平均0.2Mb/个，且分布不均匀 困难：设计时间长,需要预实验,3-6个月 可选位点有限：3-25个 优势：速度快，无需预实验 多种疾病一个panel 缺点：未检测致病突变，必须父母和先证者 设计位点固定，部分病例无法诊断 2016/12/6 7 Daughter Mother Father 基因组DNA WGA 高通量测序 SNP分析 染色体拷贝数分析 单体型构建 胚胎细胞 检测报告 单基因 平衡易位 罗氏易位 基于新一代测序的PGD技术S-PGDTM 单体型（haplotype）CAH(chr6:32,006,093-32,009,447)Father Mother Child C T C T C C A G A A A G Father Mother Child C T C T C C G A A A G A Genotype Haplotype PGD单基因病技术原理-单体型 合作单位：中信湘雅生殖与遗传专科医院 实例一：杜氏肌营养不良(DMD)先证者，男孩，杜氏肌营养不良患者，基因诊断为DMD DelEX3-7 Hemi。先证者母亲（女方）为DMD DelEX3-7 Het，父亲（男方）正常，女方母亲正常，女方父亲已故。该家系促排卵周期后产生4枚囊胚。传统STS连锁方法判定胚胎发生重组，但无法找到断点，因此是否携带致病链无法判断。通过S-PGDTM检测方法，判断该家系先证者实际在基因内部致病位点上游发生重组；4枚胚胎经单体型分析两枚携带致病基因，两枚为正常胚胎；结合PGS筛查结果，3号胚胎可进行移植。女方母亲 女方 男方 先证者 胚胎1 胚胎2 胚胎3 胚胎4 M2 M1 M2 F1 M1 M1 F1 M1 F1 M2 F1 M2 F1 G A G A A A A A A G A G A G T G T T T T T T G T G T C T C T T T T T T C T C T A G A G G G G G G A G A G G T G T T T T T T G T G T T C T C C C C C C T C T C G A G A A A A A A G A G A T G T G G G G G G T G T G A G A G G A A G A G G G G G T T A T A A A A A A T A T A T C T C T T T T T T C T C T T T G T T G G T G T T T T T T A T A A T T A T A A A A A A T A T T A A T A T T T T T T C T C C T T C T C C C C C G T G T G G G G G G T G T G A A?A A?A?A A A A A C C?C A?A?A C A C A G A?A G?G?G A G A G C A?A C?C?C A C A C A A C A A C C A C A A A A A A A T A T T T T T T A T A T C T C T T C C T C T T T T T G A G A A A G A G A A A A A C C A C A C A A A A C A C A G G A G A G A A A A G A G A C T C T C T T T T C T C T A C A A A C A A A A A A A C A C A C A A C A C A C A G A G A G A A G A G A G A A G A G A G G A G A G A G C T C T C T T C T C T C T C T C T C T T C T C T C T C G C G C G G C G C G C G G T G T G T T G T G T G T C T C T C T T C T C T C T A C A C A C C A C A C A C A C A C A C C A C A C A C T C T C T C C T C T C T C 实例一：杜氏肌营养不良(DMD)实例一：杜氏肌营养不良(DMD)S-PGD Sanger验证 PGS 胚胎1 携带？XX,+16 胚胎2 携带？XX,+22 胚胎3 正常？正常 胚胎4 正常？XX,-1q嵌合 实例二：成人型多囊肾(PKD1)合作单位：江苏省人民医院生殖中心 女方两年前体检B超提示双侧多囊肾多囊肿，无家族史。其基因诊断结果显示PKD1基因发生 EX29:c.9874delC,p.Leu3292Trpfs3315 Het，移码突变，该突变会造成PKD1基因编码氨基酸提前终止，产生截断蛋白。该家系促排卵周期后产生7枚囊胚。Sanger验证胚胎活检扩增产物致病位点，确定受累胚胎；进而S-PGDTM单体型分析，4枚胚胎携带致病基因，3枚胚胎为正常胚胎；结合染色体拷贝数筛查结果，3枚胚胎可选择移植。2016/12/6 8 女方 男方 LL-1 LL-2 LL-3 LL-4 LL-5 LL-7 LL-11 M1 M2 F1 F2 M1 F1 M2 F2 M1 F2 M2 F1 M1 F2 M2 F2 M1 F1 C C C T C C C T C T C C C T C T C C T C C C T C C C T C C C T C C C T C T T T C T T?T C T T T C T C T T T C C C T C C C T C C C T C C C T C T C T T T T C T T T C T T T C T T T T T C T T C T T T T T C T T T T T C C C C T C C C T C T C C C T C T C C C T C C C C T C C C T C C C T C C C G A G G G G A G G G A G G G A G G G C C C G C C C G C G C C C G C G C C C C C G C C C G C G C C C G C G C C A G A A A A G A A A G A A A G A A A C G C C C C?C C G C C C G C C C A G A A A A G A A A G A A A G A A A G G G A G G G A G A G G G A G A G G T T T C T T T C T C T T T C T C T T T T T C T T T C T C T T T C T C T T C C C G C C C G C G C C C G C G C C G A G G G G A G G G A G G G A G G G G A G G G G A G G G A G G G A G G G A A A G A A A G A G A A A G A G A A A G G G A G G G A G G G A G G G A G C T T T C T T T C T T T C T T T C T A A T A A T A A A A A T A A A A A T G G A G G A G G G G G A G G G G G A T T C T T C T T T T T C?A A A G A A A G A G A A A G A G A A C C C T C C C T C T C C C T C T C C A G G G A G G G A G G G A G G G A G T T C T T C T T T T T C T T T T T C 实例二：成人型多囊肾(PKD1)LL-5 LL-7 样本编号 S-PGD Sanger验证 PGS LL-1 致病 杂合delC LL-2 正常 正常 正常 LL-3 致病 杂合delC LL-4 正常 正常 正常 LL-5 致病 杂合delC LL-7 正常 正常 正常 LL-11 致病?44 合作单位：中山大学附属第一医院 女方 男方 LY-R1 LY-R2 LY-R3 LY-R4 LY-R5 LY2 LY7 M1 M2 F1 F2 M2 F1 M2 F1 M1 F2 M2 F2 M1 M2 F1 M2 F1 A G A A G A G A A A G A A G A G A T A T T A T A T T T A T T A T A T C C C C C C C C C C C C C C C C C T C T T C T C T T T C T T C T C T G A G G A G A G G G A G G A G A G C T C C T C T C C C T C C T C T C C A C C A C A C C C A C C A C A C G C C C C C C C G C C C G C C C C A G A A G A G A A A G A A G A G A A A G G A G A G A G A G A A G A G A G A A G A G A A A G A A G A G A G G A A G A G A G A G A?G A G A C T C C T C T C C C T C C T C T C T T C T T C T C T T T T T T C T C G A?G A?A?G G A G G A?A?T?C T?T?C T C?T?T?C?T C?C?T C T?C?C?C G?C G?G?C C G C C?G?T C C T C C C C T T C T T?C C G A G G A G A G G G A G G A G A G C G C C G C G C C C G C C G C G C A G A A G A G A A A G A A?C A C C A C A C C C A C C A C A C C A C C A C A C C C A C C A C A C A G A A G A G A A A G A A G A G A G G G A G G G G G A G A G G G G G T C C T C C C C T T C T T C C C C A G G A G G G G A A G A A G G G G A A G A A G A G A A A A A A G A G T T C T T C T C T T T T T T C T C C G C G G C G C C G G G C G C?实例三：-地中海贫血病(HBA)夫妇双 方，女方/-4.2，46,XX,inv(9)(p11;q13)；男方-SEA/，核型46,XY,t(1;4)(q42;p15)。该家系促排卵周期产生7枚囊胚。第一次活检2枚囊胚，一代验证、S-PGDTM单体型分析结合PGS结果显示均不可移植；第二次活检5枚囊胚，一代验证、S-PGDTM单体型分析结合PGS结果提示胚胎R1可选择移植。chr16单 体,与SNP检 测结 果一致 样本编号 S-PGD Sanger验证(-4.2)PGS LY-R1-SEA/?正常 LY-R2-SEA/?+1q41-q44,-4p16.3-p1 5.1 LY-R3-4.2/-4.2 -1q41-q44),+4p16.3-p1 5.1,-6q1 2-q27,-17 p1 3.3-p11.2 LY-R4/?-1q41-qter,+4pter-p15.1 LY-R5-4.2 -4.2 -4pter-p15.1,-16 LY2-SEA/?-1 q41-q44,+4 p16.3-p15.1 LY7-SEA/?+1 p36.33-q41,-1 q 41-q44,+4 p 16.3-p15.1,-4 p15.1-q35.2-4.2/-SEA/-SEA/-SEA/-4.2/-4.2/-SEA/-SEA/实例三：地中海贫血病(HBA)46 Resolution(分辨率)NGS 低Coverage 低Depth PGS 高覆盖度 高深度 PGD 需求决定要求 Thanks