黑曲霉和米曲霉发酵改善豆渣口感.pdf

第 28 卷第 7 期农 业 工 程 学 报Vol.28No.72482012 年4 月Transactions of the Chinese Society of Agricultural EngineeringApr.2012黑曲霉和米曲霉发酵改善豆渣口感李艳芳1，郝建雄2，程永强1，赵瑞平3，殷丽君1，李里特1（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.河北科技大学生物科学与工程学院，石家庄 050018；3.河北北方学院食品科学系，张家口 075131）摘要：豆渣作为豆制品生产的副产品，富含营养。为了解决豆渣颗粒大，口感差，难以直接食用的问题，该文对利用黑曲霉和米曲霉发酵豆渣降低其粒度分布进而改善其口感、增加其可食性进行了研究。结果表明：利用黑曲霉和米曲霉在 28，相对湿度为 95%的条件下发酵，能使渣感减弱，吞咽变易，口感明显改善；对发酵 10 d 后豆渣的外观形态、显微镜观察、粒度分布进行考察，均一致表现为发酵后豆渣颗粒显著变小；黑曲霉发酵豆渣对渣感的降低效果好于米曲霉发酵豆渣和未发酵豆渣；发酵使豆渣颗粒变小是口感改善的主要原因；口感改善的根本原因是发酵豆渣过程中所产生的纤维素酶和半纤维素酶降解了豆渣中的纤维素和半纤维素，导致豆渣颗粒变小的缘故。该研究对豆渣的综合利用提供了新途径。关键词：农业废弃物，发酵，菌株，膳食纤维，发酵豆渣，黑曲霉，米曲霉，口感doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2012.07.041中图分类号：TQ920.6文献标志码：A文章编号：1002-6819(2012)-07-0248-06李艳芳，郝建雄，程永强，等.黑曲霉和米曲霉发酵改善豆渣口感J.农业工程学报，2012，28(7)：248253.Li Yanfang,Hao Jianxiong,Cheng Yongqiang,et al.Improvement of okara mouthfeel by Aspergillus niger and Aspergillus oryzaefermentationJ.Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering(Transactions of the CSAE),2012,28(7):248253.(in Chinese with English abstract)0引言中国是一个传统豆制品消费大国，随着对大豆营养认识的进一步深入，其消费量也逐年增加。豆渣作为豆浆、豆腐等传统豆制品生产的副产品，按每加工 1 t 大豆产生 2.5 t 豆渣计，目前国内每年约排放 1 500 万 t 豆渣1-3。但由于豆渣颗粒大，口感粗糙、水分含量高，易腐烂不耐储存等原因，多作为饲料或直接废弃，食用极少，从而造成资源极大浪费。然而，豆渣含有丰富的蛋白质、矿物质和其他营养成分，另外还富含膳食纤维，对于预防肠道癌变、便秘、减肥具有良好功效4。不仅如此，近年来研究还发现，发酵豆渣具有抗氧化5-6、降低血液中胆固醇含量7-8、减少糖尿病患者对胰岛素的消耗9-10等功效。目前豆渣在食品工业中主要有 2 种利用途径：一是烘干粉碎后作为添加辅料用于食品加工，如膨化食品、烘烤食品；二是以豆渣为原料提取豆渣中的保健功能成分如膳食纤维等。但干燥豆渣能耗大，另外豆渣颗粒大也直接限制了豆渣在食品中的添加量；而提取过程中需收稿日期：2011-08-23修订日期：2011-09-26基金项目：国家“十一五”规划关键技术研究与开发项目（项目编号：2006BAD27B09）作者简介：李艳芳（1973），女，助理研究员，河南安阳人，博士，主要从事发酵工程和功能性食品的研究。北京中国农业大学食品科学与营养工程学院，100083。Email:通信作者：李里特（1948），男，陕西西安人，教授，博士，博士生导师，主要研究方向为农产品贮藏与加工。北京中国农业大学食品科学与营养工程学院，100083。Email:要经过酸碱等多种工序处理，易造成环境污染也不利于豆渣的有效利用。改善豆渣口感需要使豆渣粒径变小。目前，减少豆渣粒径主要为机械粉碎法。机械粉碎法能耗高，费用大，且豆渣膳食纤维抵抗变形和吸收冲击能的能力大，即使通过传统的粉碎设备（如砂轮磨、胶体磨等）也很难将豆渣颗粒粉碎到足够小11-13。为了降低豆渣的粒径进而改善其口感，罗勇泉等利用酿酒酵母对豆渣和苹果渣的混和物进行固态发酵，结果发现混合苹果渣的豆渣经发酵后口感得到明显改善14。有鉴于此，本文选用传统发酵豆酱时常用的米曲霉和黑曲霉对新鲜豆渣进行发酵，研究了豆渣发酵前后渣感、口感、粒度分布以及豆渣颗粒的外部形态的变化情况，并通过对发酵豆渣纤维素和半纤维素酶活性变化进行研究，探讨了豆渣发酵口感改善的原因。1材料与方法1.1材料新鲜豆渣：由北京王致和食品集团有限公司提供，样品取自王致和腐乳厂生产线，含水率为 82.13%；试验菌种：米曲霉(Aspergillus oryzae 3.951)由北京市食品酿造研究所提供；黑曲霉(Aspergillus niger)：本实验室保藏。1.2仪器与设备HZQ-F160 型恒温振荡培养箱:哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；KQ-600DE 型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有第 7 期李艳芳等：黑曲霉和米曲霉发酵改善豆渣口感249限公司；GB60003-1985 国家标准检验筛：浙江省虞市春耀仪器纱筛厂制造；GF20022B 型鼓风干燥箱：重庆银河试验仪器有限公司 SZ 12PM10AK 型数码显微镜：奥林巴斯（日本）有限公司 BX5 型数码显微镜：奥林巴斯（中国）有限公司 510M-01 型多参数测定仪：Thermo.Scientifico.Co.Ltd.USAGL-208 型高速冷冻离心机：上海安亭实验仪器厂UVMINI-1240 型紫外分光光度计：SHIMADZU，Japan。1.3试验方法1.3.1孢子悬浮液制备黑曲霉、米曲霉孢子悬浮液制备：首先将米曲霉、黑曲霉分别在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面培养基上活化，然后分别挑取活化好的菌丝接种到装有麸皮培养基的三角瓶上进行扩培培养，活化和扩培条件均为：温度 28、时间 3 d。最后向三角瓶加入适量的质量分数为0.9%生理盐水，振荡后，用无菌纱布过滤，将滤液收集到三角瓶中并用质量分数为 0.9%的生理盐水稀释，制成2 1075 107个/mL 孢子悬浮液备发酵豆渣使用。1.3.2发酵豆渣制备分别称取 130 g 新鲜豆渣于 1 000 mL 的三角瓶中，6层纱布封口，在 121高压灭菌锅内蒸煮 20 min，冷却至室温后，分别加入质量分数为 1%黑曲霉、米曲霉孢子悬浮液孢子悬浮液，以加入质量分数为 1%无菌水的豆渣作为对照（未发酵豆渣），混匀后置于恒温恒湿培养箱培养 10 d（培养条件：28、相对湿度为 95%），每隔 24 h取样 1 次，依次得到黑曲霉、米曲霉发酵豆渣和未发酵豆渣样品 3 种样品。取样后马上进行渣感、吞咽难易、色泽、滋味进行感官评定，其他样品进行冷冻干燥，用以进行粒度分析、外观和显微镜观察、纤维素酶活和半纤维素活测定。每个处理重复 3 次，并对不同培养时间的样品进行指标测定。1.3.3主要测定指标首先对 3 种发酵豆渣样品进行渣感、吞咽难易进行评价、对其色泽、滋味进行描述；其次对发酵 10 d 的 3种样品粒度分布进行统计、并对豆渣颗粒进行外观和显微镜观察；最后对发酵 3 d、10 d 黑曲霉和米曲霉发酵豆渣的纤维素酶活性、半纤维素酶活性进行测定。1.4测定方法1.4.1感官品评方法感官品评方法：分别取豆渣样品 10 g 放于盘中，并随机编号，选 20 名（男女各半，年龄 2028 岁）本研表 1豆渣感官评价评分标准Table 1Standards of sensory evaluation for okara项目评价标准渣感总分（100 分）吞咽难易总分（100 分）强020难下咽020较强2040较难下咽2040中4060勉强下咽4060较弱6080能下咽6080弱80100易下咽80100究室经过培训的评价人员独立完成感官品评，分别在感官品评室内对编号样品的渣感、吞咽难易单独依据打分标准打分，并记录样品的色泽、滋味。具体评分标准如表 1 所示。1.4.2粒度分布测定豆渣样品粒度分布测定采用湿式筛分法15。分别取 10 g 发酵 10 d 后豆渣的样品,置于加水 200mL 的三角瓶中，随后在超声波清洗器中超声处理(超声条件：20 min，50 W，40 kHz，水温 45)促使颗粒分散(发酵豆渣与未发酵豆渣均采用该超声方式处理，超声处理可能造成豆渣颗粒破碎的影响可忽略)。将超声处理后的样品放于恒温振荡培养箱中于 60、150 r/min 振荡4 h，使豆渣颗粒均匀分散后，倒入依次叠好的标准套筛中进行筛析（叠放次序由上至下为：筛孔直径为 2000、900、450、280、200、30 m 标准检验筛），每层标准筛用自来水冲洗豆渣颗粒 5 min，依次将筛上未通过豆渣颗粒分别转置于已经编号的称量皿中，于烘箱（1053）中烘干 24 h 后称质量（精确至 0.0001 g），并分别计算质量分数（%），由此依次求出 030、30200、200280、280450、450900、9002000、2000 m 颗粒质量分数（%）。1.4.3外观形态及显微镜观察分别取 10 g 发酵 10 d 的豆渣样品,置于加水 200 mL的三角瓶中，随后在超声波清洗器中超声处理 20 min。将超声处理后的样品在恒温振荡培养箱中于 60、150r/min 振荡 4 h 使豆渣颗粒均匀分散后，静止 3 h 后，将上层水分吸出，并依次使用体积分数为 50%、70%、90%、100%乙醇脱水后，放于通风厨中使乙醇挥发，然后分别用奥林巴斯SZ12PM10AK数码显微镜进行外部形态观察；用奥林巴斯 BX5 数码显微镜在 40 倍下进行形态观察。1.4.4纤维素酶活、半纤维素酶活测定1）粗酶液提取：分别取黑曲霉和米曲霉发酵 3 和 10 d的豆渣样品各 50 g 分别放于三角瓶中，按每克干物质（同时要测定当时豆渣中的水分并扣除）加入 10 mL pH 值为6.0 的柠檬酸缓冲液，28、150 r/min 震荡浸提 2 h，8 000r/min 冷冻离心 10 min，上清液即为粗酶原液。将粗酶原液用 pH 6.0 的柠檬酸缓冲液适当稀释后成粗酶液，用于测定纤维素酶活和半纤维素酶活。2）半纤维素酶活力的测定参照 Bailey 等的方法16，并适当改动：取适当稀释倍数的粗酶液 0.1 mL，加入到0.9 mL（用 0.05 mol/L pH 6.0 2-（N-吗啉代）丙磺酸缓冲液配制）1%桦木木聚糖底物溶液中，28反应 10 min，采用 3,5-二硝基水杨酸（DNS）法17测定所释放的还原糖量，以木糖作为标准。半纤维素酶的活力单位定义为：在上述反应条件下，每分钟生成 1 mol 木糖所需要的酶量。3）纤维素酶活力测定方法同上，仅将其中的底物和标准分别替换为羧甲基纤维素与葡萄糖。所有分析结果均表示为每克原始干基碳源所产的酶活力。农业工程学报2012 年2501.5数据处理与分析试验重复 3 次，数据用平均值表示，用 origin 8.0 作图。不同处理之间用 SPSS 16.0 软件采用单因素方差分析进行统计分析，显著性水平为 0.05。2结果与分析2.1发酵豆渣感官评价利用黑曲霉和米曲霉发酵豆渣，发酵过程中的渣感及吞咽难易变化如图 1 所示。图 1不同菌种发酵豆渣过程中的感官变化Fig.1Sensory changes of okara fermented by different strains从图 1a 可以看出，未发酵豆渣渣感在 010 分中间，渣感强；而经黑曲霉发酵豆渣和米曲霉发酵豆渣，二者的渣感在整个发酵过程中均逐渐减弱，前 5 d 发酵豆渣感减少速度较快，其中，黑曲霉发酵豆渣在 5 d 时，渣感强度由强降至弱渣感程度；米曲霉发酵豆渣在 5 d 时，渣感强度由强降低到中等渣感程度。这说明发酵可以降低豆渣渣感，发酵前 5 d 发酵豆渣感减少速度快，后期趋于稳定，黑曲霉发酵豆渣改善渣感的效果好于米曲霉发酵豆渣。由图 1b 可以看出，在发酵过程中，黑曲霉和米曲霉发酵豆渣口感均呈上升趋势，其中，黑曲霉发酵豆渣在发酵 6 d 后口感趋于平稳，由未发酵时口感的难以下咽到容易下咽，而米曲霉发酵豆渣在发酵 7 d 后口感趋于平稳，由未发酵时口感难以下咽改善到能下咽的程度，均好于未发酵豆渣的口感。这说明经过黑曲霉和米曲霉发酵豆渣口感均等到了改善，并且在发酵前期改善的效果好；较之米曲霉，黑曲霉对发酵豆渣口感改善效果更好。该结果与图 1a 结果相一致。对发酵豆渣和未发酵豆渣的色泽、滋味进行观察和品评表明：未发酵豆渣色泽均为乳白色，而黑曲霉和米曲霉发酵豆渣分别为黑色和绿色。未发酵豆渣有豆香味，黑曲霉发酵豆渣有发酵香味，米曲霉发酵豆渣在发酵 4 d后，有轻微苦味，说明发酵过程中产生了较多的苦味肽18。通过图 1 说明，经黑曲霉和米曲霉在 28下发酵 10 d 豆渣可以改善豆渣口感。鉴于黑曲霉发酵渣感弱，口感容易接受的原因，故认为黑曲霉可作为发酵制作豆渣酱的发酵菌株。2.2不同菌株发酵 10 d 时豆渣的粒度分布不同菌株发酵 10 d 豆渣的粒度分布如图 2 所示。未发酵豆渣粒度分布主要分别集中在450900、9002000、2000 m 之间；而黑曲霉发酵豆渣和米曲霉发酵豆渣的粒度分布则主要分布在 030 m，即经黑曲霉发酵豆渣和米曲霉发酵豆渣与未发酵豆渣相比，其豆渣颗粒均明显变小，对于感觉敏感的人，口腔可感知的颗粒最小尺寸为 2030 m19。也就是说，由于30 m 的豆渣颗粒的减少，使发酵后豆渣的渣感降低，更容易吞咽。图 2不同菌株发酵 10 d 豆渣的粒度分布Fig.2Particle size distribution of okara fermented for 10 days发酵豆渣其粒度分布向小颗粒方向移动是发酵豆渣相比未发酵豆渣渣感降低，更易下咽的主要原因。ZhuYunping 在研究中也发现，米曲霉发酵豆渣的口感好于未发酵豆渣19，这一点与本研究类似，而且我们还通过粒度分析方法对导致此现象产生的原因做进一步的研究。另外，黑曲霉和米曲霉发酵 10 d 时豆渣的粒度分布相比，黑曲霉发酵豆渣的粒度分布比米曲霉发酵豆渣向小颗粒方向移动的更多，表现为米曲霉发酵豆渣在9002000 m 和450900 m 之间的分布分别占15.82%、6.58%，而黑曲霉发酵豆渣在9002000 m、450900 m 之间的分布分别占 0.58%、0；而黑曲霉发酵豆渣比米曲霉发酵豆渣在30200 m、030 m 的颗粒含量均高。这说明经黑曲霉发酵后，更多的豆渣大颗粒被降解为小颗粒，最终导致黑曲霉发酵豆渣比米曲霉发酵豆渣的渣感下降更明显，更易吞咽。2.3不同菌种发酵 10 d 时豆渣颗粒的外观形态和显微镜观察不同菌种发酵 10 d 时豆渣颗粒的外观形态观察，结果如图 3 所示。未发酵豆渣与米曲霉和黑曲霉发酵豆渣第 7 期李艳芳等：黑曲霉和米曲霉发酵改善豆渣口感251相比，皮状颗粒数量多，体积大，大豆皮手感硬挺，另外还有极少量大豆瓣、种脐存在，小颗粒较少（图 3a）。米曲霉发酵豆渣和黑曲霉发酵豆渣中，豆皮状颗粒明显变少，小颗粒数量增加（图 3b、图 3c）。不同菌种发酵10 d时的豆渣在放大40倍下进行显微镜观察，结果如图 4 所示。未发酵豆渣其颗粒大（图 4a），而米曲霉发酵豆渣大颗粒减少，有的豆渣颗粒因分解而不太完整（图 4b），黑曲霉发酵豆渣中大颗粒数量不但明显比未发酵豆渣少，而且与米曲霉发酵豆渣相比，也明显减小（图 4c），这也与图 2 粒度分布结果一致。试验结果证明，发酵豆渣与未发酵豆渣相比，发酵豆渣渣感降低，吞咽难易等到改善的原因是因为发酵豆渣粒度分布改变，颗粒减小的缘故。Zhu Yunping19对蒸煮豆渣和经米曲霉、雅致放射毛霉发酵 2.5 d 后豆渣进行扫描电镜观察，也发现经发酵后豆渣的纤维块明显减少，认为可能是豆渣变细腻的原因之一。本试验中对发酵豆渣外部形态观察，有效验证了豆渣颗粒的粒度分布，客观地反映了豆渣发酵后颗粒的大小及发酵效果。图 3不同菌种发酵 10 d 时豆渣颗粒外观形态观察Fig.3Photographs of okara fermented by different strains图 4不同菌种发酵 10 d 豆渣微观结构（410 倍）Fig.4Microphotograph of okara fermented by Aspergillus oryzae and Aspergillus niger for 10 days2.4米曲霉和黑曲霉产纤维素酶、半纤维素酶能力比较对黑曲霉和米曲霉发酵豆渣的纤维素酶和半纤维素酶活力进行了测定，试验结果如图 5 所示。从图 5a 可以看出，米曲霉和黑曲霉发酵 3 d 的豆渣的纤维素酶活比发酵 10 d 的纤维素酶活高，米曲霉发酵 3、10 d 的纤维素酶活分别为 0.70 和 0.10 U/g，而黑曲霉分别为 1.58 和 0.31U/g。黑曲霉发酵豆渣 3 d 时，其纤维素酶活比米曲霉发酵豆渣的高出了 0.88 U/g。由图 5b 可以看出，米曲霉和黑曲霉发酵 3 d 的豆渣的半纤维素酶活比发酵 10 d 的半纤维素酶活高，米曲霉发酵 3、10 d 的半纤维素酶活分别为 12.74 和 2.60 U/g，而黑曲霉分别为 19.24 和 3.79 U/g，同时黑曲霉发酵豆渣发酵 3 d 时半纤维素酶活显著高于米曲霉发酵豆渣。由图 5a、图 5b 可以看出，在发酵过程中均产生了纤维素酶和半纤维素酶，分解了豆渣中的纤维素和半纤维素。此结果揭示了米曲霉发酵豆渣和黑曲霉发酵豆渣的粒度（图 2）减小，也再次证明发酵豆渣外观形态和显微镜观察中（图 3、图 4）豆渣颗粒变小。这是因为黑曲霉和米曲霉在发酵豆渣中产生了纤维素酶、半纤维素酶，促进了豆渣中不溶性膳食纤维的降解，使豆渣颗粒变小，最终表现为发酵豆渣渣感降低，吞咽容易（见图 1），因而改善了发酵豆渣的口感。试验中发现发酵 3 d 比发酵 10 d 时的纤维素和半纤维素酶活高，说明纤维素和半纤维素酶活的产生主要集中在发酵前期，这也是发酵前期豆渣的渣感降低明显、吞咽容易，口感改善明显的原因。此外，黑曲霉发酵豆渣的纤维素、半纤维素酶活在发酵 3 d 时，均高于米曲霉发酵豆渣，说明黑曲霉发酵豆渣在发酵前期产生了更多的纤维素酶、半纤维素酶，从而导致黑曲霉发酵豆渣的渣感降低、吞咽容易，口感改善效果好于米曲霉发酵豆渣。农业工程学报2012 年252注：a、b、c、d 之间差异显著（p0.05）图 5不同菌株发酵 3、10 d 纤维素酶活及半纤维素酶活变化Fig.5Changes of cellulase and hemicellulase activity of okara fermented by Aspergillus oryzae and Aspergillus niger for 3 and 10 days3结论1）利用黑曲霉和米曲霉发酵豆渣，粒度分布和外观形态观察其渣颗粒均变小，渣感降低，吞咽容易，口感得到明显改善，说明微生物发酵法改善豆渣口感的方法是可行的。2）黑曲霉发酵豆渣渣感弱，易吞咽，改善口感的效果优于米曲霉发酵豆渣，可作为豆渣发酵的良好菌株。3）发酵豆渣过程中产生的纤维素、半纤维素酶，降解了豆渣中的纤维素和半纤维素，是发酵豆渣颗粒变小、渣感降低、吞咽容易，口感改善的原因。参考文献1Golbitz P.Traditional soyfoods:processing and productsJ.Journal of nutrition，1995,125(3 Suppl):S570S572.2夏剑秋，江连洲，王喜泉，等.国内外大豆加工业生产现状与发展趋势J.中国油脂，2003，28(9)：815.Xia Jianqiu,Jiang Lianzhou,Wang Xiquan,et al.Presentsituation and developing trend of soybean processing indomesfic and overseasJ.China Oils and Fats,2003,28(9):815.(in Chinese with English abstract)3张振山，叶素萍，李泉，等.豆渣的处理与加工利用J.食品科学，2004，25(10)：400406.Zhang Zhenshan,Ye Suping,Li Quan,et al.The processingand utilizing of okaraJ.Food Science,2004,25(10):400406.(in Chinese with English abstract)4李里特.大豆加工与利用M.北京：化学工业出版社，2002：384414.5GoulderT,AlbertiK.DietaryfibreanddiabetesJ.Diabetologia,1978,15(4):285287.6Oliveira F,Freire D,Castilho L.Production of poly(3-hydroxybutyrate)by solid-state fermentation with RalstoniaeutrophaJ.Biotechnology 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the mouthfeel of okara through fermention at 28,relative humidity 95%.Afterfermention with Aspergillus oryzae and Aspergillus niger,the particle size of okara decreased.The morphologicalanalysis also showed the reduced particle size of fermented okara.Furthermore,the cellulase and hemicellulase activitywere detected in the okara fermented by Aspergillus oryzae and Aspergillus niger for 3 and 10 days,which suggestedthat the both strains could induce the generation of celluase and hemicelluase in okara and lead to reduced particle sizeof fermented okara.The research can provide a new method for the unilization of fresh okara.Key words:agricultural products,fermentation,strain,dietary fiber,fermented okara,Aspergillus oryzae,Aspergillusniger,taste