氧化应激因子和铁死亡标志物...妇中的表达情况及其临床意义_宋鹏书.pdf

论著临床研究基金项目：广西壮族自治区卫生健康委员会自筹经费科研课题（）；广西医学高层次骨干人才“”计划项目（）；广西壮族自治区卫生健康委员会重点（培育）实验室建设项目（）第一作者简介：宋鹏书，硕士，初级研究员，研究方向：妊娠期并发症。通信作者简介：何升，博士，研究员，研究方向：出生缺陷。氧化应激因子和铁死亡标志物在子痫前期孕妇中的表达情况及其临床意义宋鹏书 张奕梅 彭振仁 韦金凤 李 英 何 升（广西出生缺陷防治基础研究重点实验室，广西南宁市；广西壮族自治区妇幼保健院产科，广西南宁市）【摘要】目的探讨氧化应激因子和铁死亡标志物在子痫前期孕妇中的表达情况及其临床意义。方法 选取 例子痫前期孕妇作为子痫前期组，例正常孕妇作为对照组。检测两组孕妇外周血中氧化应激因子超氧化物歧化酶（）、丙二醛和谷胱甘肽表达水平。观察两组孕妇胎盘组织的病理学变化，并检测胎盘组织中铁死亡标志物谷胱甘肽过氧化物酶（）和环氧合酶（）的蛋白和 表达水平。结果 子痫前期组孕妇外周血中、谷胱甘肽表达水平低于对照组，丙二醛表达水平高于对照组（均 ）。对照组孕妇胎盘组织的细胞轮廓清晰且排列整齐，绒毛组织几乎无破损；子痫前期组孕妇的胎盘组织出现细胞溶解和血管水肿破裂的现象。子痫前期组孕妇的胎盘组织中 蛋白及 表达水平均低于对照组，而 蛋白及表达水平均高于对照组（均 ）。结论 子痫前期孕妇外周血中的氧化应激因子和胎盘组织中的铁死亡标志物表达异常，氧化应激反应及铁死亡可能参与子痫前期的发病过程。【关键词】子痫前期；氧化应激；铁死亡；谷胱甘肽过氧化物酶；环氧合酶；胎盘组织【中图分类号】【文献标识码】【文章编号】（）：，（，；，）【】，（），（）（），（），（），【】，子痫前期是妊娠期高血压疾病的常见类型之一，主要特征为妊娠 周后出现血压升高、蛋白尿和水肿，其严重影响母胎安全，是导致孕产妇和围产儿死亡的主要因素。迄今为止，子痫前期的发病机制仍未完全阐明，有学者提出子痫前期发病机制的“两阶段”学说，认为氧化应激在子痫前期的发病过程中处于中心地位，它参与子痫前期病理生理的第一阶段，与滋养层细胞侵袭和血管重塑有关；氧化应激通过释放促炎因子、细胞碎片等到血液循环中，参与第二阶段的血管内皮功能障碍和全身炎性反应。铁死亡是近年来发现的一种氧化性、非凋亡性的细胞死亡途径，是指在小分子物质诱导下不同的信号通路直接或间接地影响谷胱甘肽过氧化物酶的表达，从而导致细胞抗氧化能力下降、氧化还原反应失衡、活性氧簇累积过多而发生膜脂质过氧化反应，进而损伤细胞膜的完整性，导致细胞死亡。本研究通过检测子痫前期孕妇外周血中氧化应激因子和胎盘组织中铁死亡标志物的表达水平，探讨妊娠子痫前期发生、发展与氧化应激及铁死亡的相关性。资料和方法 临床资料 将 年 月于广西壮族自治区妇幼保健院产科确诊为子痫前期的 例孕妇作为子痫前期组，将同期在我院产检的 例正常孕妇作为对照组。子痫前期组纳入标准：（）头胎且单胎妊娠；（）年龄 岁；（）符合子痫前期诊断标准，即收缩压 和 或舒张压，蛋白尿 ，可伴有头痛、视觉障碍或上腹部疼痛；（）未合并其他影响铁死亡水平的疾病，如妊娠期贫血和地中海贫血等。排除标准：（）合并羊水污染、胎儿脐带绕颈等产科复杂情况；（）合并慢性高血压、妊娠期糖尿病及肾病；（）合并严重神经及精神障碍；（）严重心、肝、肾功能不全；（）孕周为 周。对照组的纳入标准：（）单胎妊娠；（）年龄 岁；（）妊娠期产检结果均正常；（）孕周为 周。排除标准：（）羊水量异常；（）慢性高血压、妊娠期糖尿病及肾病；（）早产。本研究经广西壮族自治区妇幼保健院医学伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。实验试剂 多聚甲醛固定液（公司，批号：）；超氧化物歧化酶（，）、丙二醛、谷胱甘肽 试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：、）；环氧合酶（，）单克隆抗体、谷胱甘肽过氧化物酶（，）单克隆抗体（，批号：、）；多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号：）；二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号：）；辣根过氧化物标记的山羊抗兔（）（，批号：）；显影液（公司，批号：），试剂、反转录试剂盒、实时荧光定量 试剂盒（公司，批号：、）；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，见表。表 引物信息引物名称引物序列上游引物：下游引物：上游引物：下游引物：上游引物：下游引物：相关指标检测方法 检测氧化应激因子表达水平：在入院后分娩之前采集所有孕妇外周血 ，室温放置 后，在 、条件下离心 ，取上清液，采用 检测血清中丙二醛、和谷胱甘肽的表达水平，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。染色观察胎盘组织病理学变化：在胎盘娩出 内剪取胎盘母体面组织块（大小约），用生理盐水洗净组织表面的血迹后置于 的中性广西医学 年 月第 卷第 期甲醛固定液固定 ，然后冲洗、酒精梯度脱水、透明、包埋、制作切片，将切片烤干后进行脱蜡处理，之后置于不同浓度的酒精脱水 。蒸馏水冲洗后，将载玻片放入苏木精溶液中染色 ，流水冲洗 次后使用盐酸酒精分化处理 ，充分清洗之后使用 伊红染色液染色 ，使用中性树脂进行封片处理，置于显微镜下观察和拍照。检测铁死亡标志物的蛋白表达水平：取胎盘娩出后 内 胎盘母体面组织，用生理盐水洗净组织表面的血迹，将组织称量、剪碎后放入 管中，加入 组织裂解液，低温裂解。然后在、条件下离心，提取组织总蛋白，使用二辛可宁酸法检测蛋白浓度，在 高温下将蛋白行变性处理。通过 分离样品蛋白，以 恒定电流转移到 膜，脱脂奶粉封闭膜 ，使用 冲洗膜 次，每次 。一抗（）和（）单克隆抗体 摇晃孵育过夜，选择（）作为内参蛋白。使用 冲洗膜 次，每次 。加入 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔（）室温孵育 ，使用 冲洗膜 次，每次 ，显影液孵育，上机检测。结果用 图像分析软件对蛋白条带的灰度值进行分析。实时荧光定量 检测铁死亡标志物的 水平：取胎盘娩出后 内 胎盘母体面组织，用冷的 洗净组织表面的血迹，将组织称量、剪碎后放入 管中，采用 试剂提取总，采用 超微量分光光度计测定 浓度，按照反转录试剂盒说明合成。实时荧光定量 反应体系包括 模板 、上下游引物各 ，其余用 水补足 。反应程序设置为 预变性；变性、退火、延伸，个循环；延伸 。以 为内参进行实时荧光定量 反应。每次检测设定 个复孔。根据实时荧光定量 扩增曲线，得到每个样本的循环周期数（值），使用 法计算各组目的基因的相对表达水平。统计学分析 采用 软件进行统计学分析。计量资料以（）表示，比较采用两独立样本 检验。以 为差异具有统计学意义。结 果 两组孕妇外周血中氧化应激因子表达水平的比较 子痫前期孕妇外周血中的、谷胱甘肽表达水平低于对照组孕妇，丙二醛表达水平高于对照组（均 ），见表。表 两组孕妇外周血中、丙二醛和谷胱甘肽表达水平的比较（）组别（）丙二醛（）谷胱甘肽（）对照组 子痫前期组 值 值 两组孕妇胎盘组织的病理学变化 对照组孕妇胎盘组织的细胞轮廓清晰且排列整齐，绒毛组织几乎无破损。子痫前期孕妇的胎盘组织出现细胞溶解、血管水肿破裂的现象。见图。图 两组孕妇胎盘组织的病理学变化（，）两组孕妇胎盘组织中铁死亡标志物蛋白表达水平的比较 子痫前期组孕妇胎盘组织中 蛋白表达水平低于对照组孕妇，而 蛋白表达水平高于对照组孕妇（均 ），见图 和表。图 两组孕妇胎盘组织中 和 的蛋白表达水平表 两组孕妇胎盘组织中 和 蛋白相对表达水平的比较（）组别对照组 子痫前期组 值 值 ，两组孕妇胎盘组织中铁死亡标志物 表达水平的比较子痫前期组孕妇胎盘组织中 的表达水平低于对照组孕妇，的表达水平高于对照组孕妇（均 ），见表。表 两组孕妇胎盘组织中 和 的 相对表达水平的比较（）组别对照组 子痫前期 值 值 讨 论 相关调查报告显示，全球范围内每年约有 万人死于妊娠期高血压疾病，占孕产妇死亡总人数的。子痫前期是妊娠期高血压疾病的其中一种类型，以高血压和蛋白尿为主要特征，严重时可导致孕妇出现多器官系统功能损害或衰竭，甚至死亡。子痫前期主要的病理生理变化是全身小动脉血管痉挛、血管内皮细胞受损及脏器血液灌注量下降。但目前子痫前期的发病机制仍未完全阐明，相关预防及治疗措施仍需要进一步完善。氧化应激反应是体内维持正常妊娠的关键，但该反应加剧可能会导致子痫前期的发生。研究发现，氧化应激参与子痫前期病理生理的第一阶段，与滋养层细胞侵袭和血管重塑有关。本研究采集两组孕妇的外周血进行检测，发现相比于正常孕妇，子痫前期孕妇外周血中 和谷胱甘肽表达水平降低，丙二醛表达水平升高，提示子痫前期孕妇体内的氧化应激作用强于正常孕妇，说明子痫前期的发病与氧化应激反应增强有关，这与国内外关于子痫前期发病机制的研究结果 一致。本研究对比了子痫前期孕妇与正常孕妇胎盘组织的病理学变化，发现子痫前期孕妇的胎盘组织出现细胞溶解及血管水肿破裂现象，分析原因可能是子痫前期孕妇机体氧化应激反应加剧，导致机体代谢紊乱，血液流速加快致使胎盘组织的血管肿胀甚至破裂。针对氧化应激反应在子痫前期发病中作用的探索或许能为临床上预防和治疗子痫前期提供新方向。铁作为生命活动的必需微量元素，在细胞运输、生物合成、机体代谢过程中发挥重要作用。但当铁过量时，游离铁可作为氧化应激反应的催化剂，加速活性氧簇的生成；游离铁还具有较强的氧化性，可直接损害一些大分子物质如蛋白质、核酸、脂质等，导致细胞膜铁依赖性脂质过氧化，进而诱导细胞程序性死亡，这种细胞死亡的方式称为铁死亡。流行病学研究表明，过量摄入铁或者高铁状态可能对妊娠妇女产生不利影响，并与流产和子痫前期等不良妊娠的发生和发展有关。丙二醛是脂质过氧化最具特征性的产物，可导致细胞铁死亡。谷胱甘肽是 催化过氧化物转化为醇的协同因子，谷胱甘肽缺乏引起的半胱氨酸缺乏直接使 失活，并导致随后的细胞铁死亡。本研究结果显示，子痫前期孕妇的外周血丙二醛表达水平升高，而谷胱甘肽表达水平下降，提示细胞铁死亡可能在子痫前期发生和发展过程中发挥作用。研究发现，蛋白具有清除脂质过氧化物的功能，失活可打破体内氧化平衡，产生大量的脂质过氧化物，破坏细胞膜结构，引发细胞铁死亡。是目前公认的铁死亡标志物，也是催化前列腺素合成的重要限速酶，其表达受各种炎症介质诱导，在子痫前期的氧化应激和炎症反应中具有重要作用。因此，本研究还检测铁死亡标志物、在孕妇胎盘组织中的表达情况。本研究结果显示，子痫前期孕妇胎盘组织中 蛋白和 表达水平低于正常孕妇，而 蛋白和表达水平高于正常孕妇，进一步说明了细胞铁死亡在子痫前期的发展中具有重要意义。我们推测其原因可能是氧化铁的激增会导致胎盘母胎界面过度的膜脂过氧化和铁死亡，导致血管内蜕膜的绒毛外滋养层细胞的浅层浸润和母体螺旋动脉的重塑不理想，进而引发子痫前期。综上所述，子痫前期孕妇外周血中氧化应激因子和胎盘组织中铁死亡标志物的表达异常，提示妊娠子痫前期与机体氧化应激反应和胎盘铁死亡反应增强有关。此结论或可为进一步寻找子痫前期新的临床干预方法提供新思路。参 考 文 献 ：，（）：何亚君 子痫前期发病高危因素及其对妊娠结局的影响分析 中国妇幼保健，（）：，（），（）：（下转第 页）广西医学 年 月第 卷第 期 李清华，马志红，李立，等 与 在喉鳞状细胞癌中的表达及临床意义 河北医学，（）：中国抗癌协会小儿肿瘤专业委员会 儿童肾母细胞瘤诊断治疗建议（）中华儿科杂志，（）：孟德光，王佳荣，常晓峰，等 难治性小儿肾母细胞瘤中 的表达及其与临床病理特征和预后的关系中国肿瘤外科杂志，（）：李 露，史艳侠 儿童肾母细胞瘤的诊断与治疗 中国临床医生杂志，（）：，：，（）：赵雨霏，陶圆 基因在恶性肿瘤中的研究进展 中国肿瘤临床，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：党裔武，陆会平，陈罡 和 在肺癌中的研究进展 右江医学，（）：高 杰，靳昊，张娟，等 调控 对口腔鳞癌细胞 细胞增殖、凋亡及迁移的影响 医学分子生物学杂志，（）：钟文静，战鹏，朱晓峰，等 与 在 中的表达及其与病理特征的关系 医学信息，（）：王建国，陶耀业，陈成，等 蛋白在肝内胆管细胞癌组织中的表达及临床意义 浙江临床医学，（）：杜红飞，庞雪利，阳燕，等 在膀胱癌组织及细胞 中 的 表 达 及 意 义 现 代 肿 瘤 医 学，（）：（收稿日期：修回日期：）（上接第 页），：中华医学会妇产科学分会妊娠期高血压疾病学组 妊娠期高血压疾病诊治指南（）中华妇产科杂志，（）：李冠琳，杨慧霞 子痫前期的预测与预防 中华妇产科杂志，（）：，；（）：，：史云芳，翁文芳，林 燕 拉贝洛尔对子痫前期孕妇外周血氧化应激产物表达及分娩的影响 临床合理用药杂志，（）：，：马臣杰，张 雯，曾瑾，等 铁死亡调控机制的研究进展 生物学杂志，（）：董 捷，颜建英，张勤建 铁与子痫前期发病的研究进展 中华围产医学杂志，（）：，（）（），（）：，（）：，：，（）：，：马建彩，武 红，杨丽萍，等 和 在子痫前期胎盘组织中的表达及意义 标记免疫分析与临床，（）：（收稿日期：修回日期：），