单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体的制备与鉴定.pdf

中国生物工程杂志China Biotechnology，2013，33(5):56-61单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体的制备与鉴定*董香梅1孙吉昌2刘春梅3钟子清1赖卫华1魏华1熊勇华1(1 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室南昌3300472 江西省疾病预防控制中心南昌3300029)(3 无锡中德伯尔生物技术有限公司无锡214000)摘要以单核细胞增生李斯特菌细胞碎片免疫 BALB/c 小鼠，间接 ELISA 法成功筛选获得 2 株稳定分泌抗 LM 的单克隆杂交瘤细胞株 4A7、4H11。抗体效价为 1 160 000 以及 1 20 000，亚型为IgG1、IgG2a，Dot-ELISA 结果表明4A7 和4H11 单克隆抗体具有很好的属特异性，Western blot 分析表明 4A7、4H11 抗体分别与单核细胞增生李斯特菌 62 kDa 以及 32 kDa 外膜蛋白抗原表位结合，胶体金免疫电镜实验进一步确证以上抗体可有效识别单核细胞增生李斯特菌细胞表面抗原。关键词单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体外膜蛋白中图分类号TS2016收稿日期:2012-12-28修回日期:2013-03-21*“十 二 五”国 家 科 技 支 撑 计 划(2011BAK10B06、2011BAK10B01)、国家自然科学基金(31271863)，江西省科技厅“井岗之星”人才计划(2010DQ00800)资助项目 通讯作者，电子信箱:yhxiongchen163 com单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)为革兰氏阳性菌，需氧或兼性厌氧。LM 是李斯特菌属(Listeria)中最重要的人畜共患病病原菌，在美国被列为第二大主要的食源性致死病菌，居沙门氏菌之后1。人被 LM 感染后死亡率可达 30%，新生婴幼儿和免疫力低下的人群中死亡率更高达 70%2。目前，已鉴定出 LM 的 16 个血清型3，主要致病血清型为 1/2a、1/2b、4b，其中 50%的人类和动物的李斯特菌病由4b 血清型引起4，常见病症包括脑膜炎、脑脊髓炎以及孕妇流产等5。LM 的传统检测方法包括前增菌、选择性平板分离以及后期生化鉴定等程序。虽然传统检测方法准确率较高，但存在操作程序复杂，检测周期长等缺陷。基于免疫学原理的前处理方法及检测方法是实现 LM 快速筛查的有效手段之一，可大大缩短 LM 整体检测时间，如免疫磁富集6-7，胶体金免疫层析试纸条8 以及酶联免疫吸附方法9-10 等。以上方法学的核心是制备亲和力高、特异性强的属内或种特异性单克隆抗体。本研究以 4b 血清型 LM 细胞碎片为免疫原免疫小鼠，制备抗 LM 的单克隆抗体，并对抗体的特性进行评价。1材料与方法11实验材料111菌株、培养基LM ATCC 13932(4b)、绵羊李斯特 Listeria ivanovii ATCC 19119、威尔氏李斯特 Listeriawelshimeri ATCC 35897、西 尔 李 斯 特 Listeria seeligeriATCC 35967、格氏李斯特 Listeria grayi ATCC 25401、英诺克李斯特 Listeria innocua NCTC 11288(6a)等标准株购自 MBL 公司;50 株单增李斯特菌分离株由江西省疾病预防控制中心惠赠;大肠杆菌 Escherichia coli、沙门氏菌 Salmonella、副溶血弧菌 Vibrio parahaemolyticus、阪崎肠杆菌 Enterobacter sakazakii、枯草芽孢杆菌 Bacillussubtilis、植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum、长双歧杆菌Bifidobacterium longum 等为本实验室保存。李斯特增菌培养基(国标 GB 4789 30-2010)购自北京陆桥技术有限责任公司。112细胞系及实验动物骨髓瘤细胞系 SP2/0-Ag-14、6 8 周龄 BALB/c 小鼠购自扬州大学兽医学院动物中心。113试剂PEG1500 购自 Roche 公司;胎牛血清购自 Invitrogen 公司;IMDM 购自 Gibco 公司;HAT 购自Sigma 公司;鼠源单克隆抗体鉴定试剂盒购自洛阳佰奥实验材料中心;弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HRP标记羊抗鼠 IgG 抗体购自中杉金桥生物技术有限公司;2013，33(5)董香梅 等:单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体的制备与鉴定20 nm 胶体金溶液由江西中德生物工程有限公司提供;其余常规试剂均为国药分析纯。12细菌培养取少量 LM、绵羊、威尔氏、西尔、格氏、以及英诺克李斯特标准菌株及 50 株 LM 食品分离株，分别进行普通 LB 固体培养基划线培养，挑单菌落转入 LB1培养基30 培养 12 24 h 后，再转入 LB2培养基 30 培养18 24 h，平板计数调整菌液浓度为 1 109CFU/ml;阪崎肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌等属外菌以普通 LB液体培养基(pH 72 74)37 培养16 18 h，平板计数调整菌液浓度为 1 109CFU/ml;肠道常见菌如植物乳杆菌及长双歧杆菌等以 MRS 培养基(pH6 2 6 5)37 厌氧培养16 18 h，平板计数调整菌液浓度为1 109CFU/ml。13小鼠免疫免疫原的制备参照文献11 方案进行。LM 标准株按 1 2 培养(2 1 108CFU/ml)，90 热杀 15 min 后9 000 r/min离心 10 min;沉淀经 0 1 mol/L PBS 清洗 3次后加入 3ml PBS 重悬，重悬菌加入 1ml(直径 0 1mm)的玻璃珠涡旋震荡 20 min 破碎菌体，除玻璃珠后加入 DNase I(50g/ml)和 Rnase A(50g/ml)37反应 30 min，9 000 r/min 离心 10 min，沉淀用 1ml PBS重悬获得免疫原。取 12 只 6 8 周龄，血清 LM 阴性的BALB/c 小鼠，分为佐剂与非佐剂两组。佐剂组将制备的 LM 细胞碎片与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳化，经皮下多点注射免疫，剂量为 1 109CFU/只;非佐剂组直接将 LM 细胞碎片免疫小鼠，剂量与佐剂组相同。以后每隔 3 周加强免疫一次，免疫 5 次后间接ELISA 法测定血清效价。融合前 3d 取效价最高小鼠腹腔冲击免疫，抗原剂量为 2 109CFU/只。14杂交瘤细胞筛选间接 ELISA 法进行杂交瘤筛选，其中抗原的包被浓度为 4 108CFU/ml，间接 ELISA 反应条件如下:细胞上清 100l/孔，37作用 60min，PBST 洗涤后加入工作浓度的酶标二抗 100l/孔，37 反应 30 min 后PBST 洗涤 3 次，显色液显色 10 min。15腹水的制备及抗体亚型分析采用体内诱生法12 制备腹水，辛酸-硫酸铵沉淀法13 纯化腹水，间接 ELISA 法测定抗体效价，单克隆抗体亚型鉴定按试剂盒说明书进行。16抗体效价测定间接 ELISA 测定效价，取热杀死 LM 标准株(4 108CFU/ml)全菌抗原包被酶标板，3%脱脂乳封闭酶标板，然后将倍比稀释的抗体加入酶标板孵育 60 min，洗板后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG 的抗体孵育 30 min，经洗板后加入 A、B 显色液显色反应 15 min，2mol/L H2SO4终止反应，450 nm 处测 OD 值，以阳性孔吸光值比阴性孔吸光值大于 2 1 倍的抗体最大稀释倍数为抗体效价。17Dot-ELISA 及 Western blotDot-ELISA 参照文献 14 原理进行，将 PVDF 膜划分小格后置于甲醇中浸泡 30 60 s 活化 PVDF 膜，取出膜稍干后在小格中点待测细菌 2l(108 109CFU/ml)，室温结合 30 min 后 0 1mol/L PBS 洗涤 3 次，5%脱脂乳封闭 60 min 后加入待分析抗体，37 孵育 60min 后 0 1mol/L PBS 洗涤 3 次，加入辣根过氧化物酶标记二抗 37 孵育 30min，以二氨基联苯胺(DAB)为底物显色分析。Western blot 按文献15 方法操作，将LM、绵羊、威尔氏、西尔、格氏以及英诺克李斯特菌标准株的细胞碎片(约 109CFU/ml)进行 SDS-PAGE 后，电转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂乳封闭，与鼠抗 LM 抗体结合，以 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 抗体为二抗，二氨基联苯胺(DAB)为底物显色进行蛋白印迹分析。18胶体金免疫电镜分析参照文献 16 方法，取 100ml 20 nm 胶体金溶液，02mol/L K2CO3溶液调 pH 值至 8 1，室温条件下分别加入 1/10 体积的两种抗 LM 单克隆抗体溶液(抗体浓度为 200g/ml)，室温搅拌反应 1 h 后加入 1/10 体积的 1%PEG 20 000，搅拌反应30 min，继续加入1/10 体积的 10%BSA 的搅拌反应 30 min 后于 4 12 000 r/min 离心 30 min。沉淀用 10ml 胶体金重悬液(含 1%BSA、2%蔗糖、0 05%PEG 20 000、0 1%NaN3的pH74 002mol/L的磷酸盐缓冲液)重悬获得免疫胶体金溶液。将 100l LM(109CFU/ml)与 100l 免疫胶体金共孵育 45 min 后 6 500r/min 离心 6 min。沉淀用001mol/L PB 缓冲液洗涤3 遍后用200l PB 缓冲液复溶，然后将菌液滴加于铜网上 37烘干，并进行透射电镜分析。2结果与讨论21血清效价分析小鼠经五次免疫后，间接 ELISA 测定免疫血清效75中国生物工程杂志 China BiotechnologyVol 33 No 5 2013价，结果显示佐剂组小鼠效价为 1 40 000 1 80 000，普遍低于非佐剂组(180 000 1 160 000)。采用 Dot-ELISA 分析小鼠血清与李斯特菌属内以及属外常见菌的交叉反应性，结果见表 1。表 1单增李斯特菌抗体与细菌的反应谱Table 1The reactivities of antibodies with different bacteriaStrainSource andstrain number4A74H11 pAb1)StrainSource andstrain number4A74H11pAbL monocytogenesATCC 13932(4b)+4)+2)S anatumATCC 9270L ivanoviiATCC 19119+Shigella FlexneriCollectionL innocuaNCTC 11288(6a)+S sonneiCollectionL welshimeriATCC 35897+E coli O157:H7CMCC 44828L seeligeriATCC 35967+E coli O157:H7ATCC 43888L grayiATCC 254015)+Enteropathogenic E coliCMCC 44496B subtilisCollection+Enteroinvasive E coliCMCC 44350L plantarumCollection+3)Escherichia coliATCC 25922B longumCollection+E sakazakiiCMCC 45402P aeruginosaCollection+E sakazakiiATCC 51329S aureusCollection+E sakazakiiATCC 29544L bulgaricusCollection+Candida albicansCollectionV parahaemolyticusCollection+Micrococcus luteusCollectionV parahaemolyticusCollection+Lactobacillus rhamnosusCollectionS parathpyi AATCC 9150Bifidobacterium lactisCollectionS typhimuriumATCC 13311Bifidobacterium animalisCollectionS choleraesuisATCC 10708Enterobacter cloaceaCollectionS enteritidisATCC 13076Proteus vulgarisCollection1)pAb:polyclonal antibody;2)Strong positive(+);3)Positive(+);4)Weak positive(+);5)Negative()从表1 可知，免疫血清与李斯特菌属内 6 个种均有较强的免疫学反应，与属外的枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、植物乳杆菌以及长双岐杆菌有较强的交叉反应，与金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌以及保加利亚乳杆菌有轻微的交叉反应。将 LM、绵羊、威尔氏、西尔、格氏以及英诺克李斯特菌标准株的细胞碎片(约 109CFU/ml)进行SDS-PAGE，然后进行 Western blot 分析，结果见图 1。图1a 显示，李斯特菌在 24 kDa 100 kDa 分子量间含有丰富的蛋白条带;而从图 1b 蛋白杂交图谱可知，李斯特菌碎片中只有62 kDa，55 kDa，38 kDa，30 kDa 以及 32 kDa的少数蛋白具有较好的抗原性，同时菌体碎片中含有的磷壁酸类物质也具有一定的抗原性(在 14 kDa 24 kDa间产生了系列的阶梯状免疫印迹条带)。22单克隆抗体筛选取效价最高小鼠进行冲击免疫，3d 后取脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，4d 融合孔可见明显的细胞集落，7d后取融合孔上清进行三轮间接 ELISA 法交叉筛选。其中第一轮筛选以 LM ATCC 13932(4b)为包被抗原;ELISA 吸光值大于 15 的阳性孔继续以枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、植物乳杆菌以及长双岐杆菌混合菌液为包被抗原进行第二轮筛选;吸光值小于 0 2 的阴性图 1李斯特菌细胞碎片的 SDS-PAGE 图谱(a)以及 Western blot(b)Fig 1SDS-PAGE(a)and Western blot(b)of cell fragments of ListeriaM:Protein marker;1:Lmonocytogenes 13932(4b);2:Livanovii 19119;3:Linnocua 11288(6a);4:Lwelshimeri35897;5:L seeligeri 35967;6:L grayi 25401孔以绵羊、威尔氏、西尔、格氏、以及英诺克李斯特混合菌液为包被抗原进行第三轮筛选。结果显示融合孔第一轮初筛有 109 孔呈强阳性，强阳性孔进行第二轮交叉反应排查，有 20 个融合孔吸光值低于 0 2，第三轮筛选发现以上 20 个融合孔上清与李斯特属内其他六种852013，33(5)董香梅 等:单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体的制备与鉴定混合菌液均能发生交叉反应。将以上 20 个融合孔进行亚克隆，其中有两孔五次亚克隆后阳性率达 100%，得到 2 株稳定分泌抗 LM 单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为 4A7 及 4H11。23单克隆抗体效价及亚型鉴定4A7 及 4H11 细胞株产生的腹水经辛酸-硫酸胺法纯化，间接 ELISA 法测定抗体(浓度为 1mg/ml)效价分别为 1160 000 以及 120 000，免疫球蛋白亚型分析为IgG1 以及 IgG2a。24单克隆抗体特异性分析抗体的特异性采用 Dot-ELISA 进行分析(Dot-ELISA 图略)，具体见表 1。从表 1 结果可知，4A7，4H11 单克隆抗体与李斯特菌属内 LM、英诺克、绵羊、西尔、威尔氏均有交叉反应，而与格氏无交叉反应。与属外 30 株常见菌无交叉反应。不同来源的李斯特菌膜蛋白抗原表位可能存在因环境选择性压力而导致差异表达或者变异，造成抗体对不同菌株识别能力存在显著性差异17-18。为了验证以上两株单抗对不同来源菌株适用性，本研究选取了 50 株从食品中分离获得的LM 进行 Dot-ELISA 分析(图 2)，结果显示两株抗体与50 株食品分离菌株均有较好的识别能力;为了进一步表征两株抗体与 LM、绵羊、英诺克、威尔氏、西尔、格氏李斯特菌结合能力的差异，将浓度为 02 g/ml 的 4A7及 4H11 单克隆抗体溶液与包被有不同浓度 LM、绵羊、威尔氏、西尔、格氏以及英诺克李斯特菌(1081010CFU/ml)的酶标板反应，结果见图 3。从图 3a 可知，4A7 与 LM、绵羊、威尔氏、西尔以及英诺克李斯特菌均具有较强的免疫学反应，与格氏李斯特无交叉反应;4H11(图 3b)与西尔李斯特菌的免疫学反应最强，与LM、绵羊、英诺克、威尔氏李斯特菌的免疫学反应较弱，与格氏李斯特菌均无结合反应。从图 3 中还显示当酶标板单增李斯特菌抗原为 108CFU/ml 时，4A7 抗体的ELISA 结果为 40，而 4H11 抗体的 ELISA 结果仅为05左右。表明 4A7 抗体识别单增李斯特菌膜抗原的亲和性远大于 4H11 抗体。图 2两株单克隆抗体属内适用性 Dot-ELISA 分析Fig 2Dot-ELISA analysis of total cellproteins of Listeria with mAbsa:4A7;b:4H11 1:L monocytogenes 13932(4b);2:L ivanovii19119;3:L innocua 11288(6a);4:L welshimeri 35897;5:Lseeligeri 35967;6:L grayi 25401;7-56:50 strains of LM isolatedfrom foods图 3两株单克隆抗体与李斯特菌属内免疫反应性Fig 3The immune-reaction of two mAbs to Listeriaa:4A7;b:4H11;Control:PBS25单增李斯特菌膜蛋白抗原表位分析将 LM、绵羊、威尔氏、西尔、格氏以及英诺克李斯特标准株的细胞碎片进行 SDS-PAGE，电转至 PVDF膜，Western blot 分析单克隆抗体与李斯特菌膜蛋白结合，具体结果见图 4。从图 4 结果可知，4A7、4H11 两株单克隆抗体与单增、绵羊、英诺克、威尔氏以及西尔李斯特菌膜蛋白产生了特异性的杂交条带，与格氏李斯特菌膜蛋白无杂交条带。通过与分子量 Marker 比对计95中国生物工程杂志 China BiotechnologyVol 33 No 5 2013算，4A7 结合的李斯特菌膜蛋白分子量约为 62 kDa，而4H11 结合的李斯特菌膜蛋白分子量约为 32 kDa。进一步通过胶体金免疫电镜分析两株抗体与 LM 抗原结合表位，具体结果见图 5。从图 5a 中可知，未标记抗体的胶体金不能与 LM 有效地结合，电镜下菌体表面未能观测到胶体金颗粒;而 4A7 标记的胶体金能有效识别LM 表面抗原，电镜下菌体表面可见大量的免疫金颗粒(图 5b)，4H11 标记的胶体金亦能有效识别 LM 表面抗原，电镜下可观察到菌体表面存在少量的免疫金颗粒(图 5c)，表明 4H11 抗体与 LM 结合能力弱可能与 LM菌体表面抗原表位较少有关。图 4两株单克隆抗体的 Western blot 分析Fig 4Western blot analysis of two kindsof mAbs to Listeria1:L monocytogenes 13932(4b);2:L ivanovii 19119;3:Linnocua 11288(6a);4:L welshimeri 35897;5:L seeligeri 35967;6:L grayi 25401图 5免疫金鉴定 LM 4b 抗原表位Fig 5Detection of L monocytogenes serotype 4bantigenic epitope by Immunogold with mAbsa:PBS(30000 );b:4A7(50000 );c:4H11(30000 )3结论本文共制备获得两株针对李斯特菌属(格式李斯特菌除外)的单克隆抗体 4H11、4A7。4H11 抗体免疫球蛋白亚型 IgG2a，效价 1 20 000，识别 LM 菌体表面32 kDa 蛋白。4A7 抗体免疫球蛋白亚型 IgG1，效价为1160 000，识别 LM 菌体表面 62 kDa 蛋白。Dot-ELISA结果显示以上抗体均能有效识别食品中分离获得的 50株 LM 菌株，与属外 30 株常见菌均无交叉反应。间接ELISA 以及胶体金免疫电镜实验显示4A7 具有比4H11抗体更强的识别 LM 膜抗原的能力。李斯特菌属中 LM和绵羊李斯特菌为两株致病性菌株，4A7 对以上两种致病李斯特菌均有较好的亲和力，因此该抗体不仅可用作免疫磁捕获抗体19，同时也可应用于免疫学快速筛查方法的配对抗体20，为 LM 及其相关致病李斯特菌的临床及食品检测奠定基础。参考文献1Scallan E，Hoekstra R M，Angulo F J，et al Foodborne 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Biotechnology CO，LTD，Wuxi214000，China)AbstractTwo strains of mAbs against L monocytogenes，namely 4A7 and 4H11，are generated byimmuned the BALB/c mice using the cell fragments of L monocytogenes as the immunogen The titers of mAbsare 1 160 000，1 20 000 and the subclasses of mAbs are IgG1，IgG2a，respectively The specificity of the mAbsis evaluated using Dot-ELISA method and the two strains of mAbs show a high infinity to Listeria monocytogenes，Listeria ivanovii，Listeria welshimeri，Listeria seeligeri and Listeria innocua whereas exhibit no cross-reactivity withListeria grayi and other 30 common bacteriasWestern-blot analysis showes the mAbs 4A7 and 4H11canrecognize the membrane proteins of Lmonocytogenes with the molecular weight of 62 kDa and 32 kDa，respectively Immuno-gold based transmission electron microscopy further demonstrates that the mAbs are capableof binding the membrane antigens of L monocytogenesKey wordsListeria monocytogenesMonoclonal antibodyMembrane proteins16