饮用水能力验证菌落总数结果测量不确定度评定_卢卓君.pdf

2023 年第 1 期 69 CITY AND TOWN WATER SUPPLY水质分析与监测1.引言测量不确定度是指利用可获得的信息，表征赋予被测量量值分散性的非负参数1。在中国合格评定国家认可委员会发布的测量不确定度的要求（CNAS-CL01-G003：2019）中明确要求“实验室应评定和应用测量不确定度，并建立维护测量不确定度有效性的机制”，以满足合格评定机构、消费者和其他各相关方的期望和需求2。测量不确定度一般由若干分量组成，一部分按测量不确定度的 A 类评定，对在规定测量条件下测得的量值用统计分析的方法进行的测量不确定度分量的评定；另一部分按测量不确定度的 B 类评定，根据基于经验或其他信息获得的概率密度函数进行评定。分析不确定度来源时，样品稳定性等分量既不能直接测量也不能以统计学的方式进行评价，实验室应考虑其造成的偏离，偏离的程度可借助于能力验证的结果进行评估3。本研究以能力验证样品检测为例，依据生活饮用水标准检验方法 微生物指标（GB/T 5750.12-2006）进行检测，根据 测量不确定度评定和表示（GB/T 27418-2017）的规定，分析检测结果不确定度的来源，计算本次能力验证测量结果的测量不确定度，进而建立饮用水菌落总数结果测量不确定评定的基本方法，以期为今后生活饮用水中菌落总数的测量不确定度评定提供参考。2.材料与方法2.1 材料与仪器饮用水中微生物能力验证标准样品（由美国 ERA 公司提供，质控样编号：S268-084，盲样编号：S274-084，同时提供配套的 100mL缓冲溶液）。饮用水能力验证菌落总数结果测量不确定度评定卢卓君（广州市自来水有限公司水质监测站/国家城市供水水质监测网广州监测站，广东广州 510160）摘要：为对饮用水能力验证中质控样和盲样的菌落总数结果进行测量不确定度评定，依据 GB/T 5750.12-2006生活饮用水标准检验方法 微生物指标进行测定和计数，再根据 GB/T 27418-2017测量不确定度评定和表示对测定过程中引入的不确定度分量进行评定，计算本次能力验证测量结果的测量不确定度。结果表明：本次能力验证中，在包含率为 95%时，质控样的扩展不确定度为0.029=质控样u（以对数计），盲样的扩展不确定度为0.030=盲样u（以对数计），取反对数后，质控样的取值区间为（222253）CFU/mL，盲样的取值区间为（241277）CFU/mL。本研究建立的方法可以对能力验证菌落总数进行不确定度评定，为生活饮用水菌落总数结果测量不确定度评定提供参考。关键词：不确定度评定；菌落总数；能力验证；饮用水DOI:10.14143/ki.czgs.2023.01.0172023 年第 1 期 70 CITY AND TOWN WATER SUPPLY水质分析与监测营养琼脂（广东环凯微生物科技有限公司，批次：1077491）；恒温培养箱（BINDER KB240）；高压蒸汽灭菌锅（ALP MC-30L）。2.2 实验方法样品处理方法按照美国 ERA 公司提供的能力验证指导说明书进行：在无菌条件下，将质控样和盲样分别转移至 100mL 缓冲溶液中，待充分溶解后，即为待测样品原液。依据生活饮用水标准检验方法 微生物指标（GB/T 5750.12-2006 1.1）菌落总数部分进行检测：以无菌操作方法用灭菌吸管吸取 1mL 充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，倾注约 15mL 已融化并冷却到 45左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀；待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于 36培养箱内培养 48h，选取适宜稀释度平板进行菌落计数4。3.结果与分析3.1 不确定度分量的评定微生物检测的不确定度来源种类较多，包括人员（取样均匀性、稀释梯度、结果计数和修约）、设备（移液器允差、培养箱参数）、环境（检验过程温度、环境洁净度）等方面的影响。通过规范操作减少人员导致的影响；通过使用经检定校准的计量器具，减少设备对检验结果的影响；检验前进行相应耗材的空白验证，对无菌室进行环境监控，确保洁净度符合要求。在本次实验中，检验未涉及稀释过程，并将平皿放置于同一经校准的培养箱中培养，因此只对样品吸取、重复测定结果过程的不确定度进行量化分析。3.2 各标准不确定度的评定3.2.1 取样过程中相对标准不确定度1)(Vurel3.2.1.1 移液器校准引入的相对标准不确定度在 取 样 过 程 中 均 使 用 经 检 定 合 格 的1001000L移液器，检定点为 1000L时，其最大允许误差为 1.0%，故 1001000L移液枪校准引起的不确定度宜采用 B 类评定，按矩形分布（3=k）为：774005.0301.0)(00.1=Vurel则由移液器校准引入的相对标准不确定度：006.07740.005000.17740.005=000.1)(=)(0011=.relrelVuVu3.2.1.2 温 度 引 入 的 相 对 标 准 不 确 定度2)(Vurel由温度引入的不确定度有两部分：温度变动对器具体积的影响；温度变动对器具内液体体积的影响；但水的体积膨胀系数（/101.24-）显著大于移液器陶瓷活塞的体积膨胀系数（约为/1015-），统计时一般只考虑前者，忽略温度对器具体积的影响5。移液器检定时水温为 22.4，实验室温度变化范围为 6，温度变化引起的不确定度宜采用 B 类评定，按矩形分布（3=k）为：7000.0727.0000=3101.26000.1=)(42Vurel3.2.2 重复测定结果的标准不确定度本次实验取盲样和质控样分别平行测定40 次。采用统计学方法对重复性检测引起的不确定度进行评定。质控样的检测结果和不确定度统计见文末附表 1，盲样检测的结果和不确定度统计见文末附表 2。根据贝塞尔公式，计算出质控样检测结果对数值的样本标准偏差为：2023 年第 1 期 71 CITY AND TOWN WATER SUPPLY水质分析与监测919 023.0)lg(lg1112=-=niiiXXns质控样质控样的标准不确定度为：782 003.040919 023.0)(=nsrepu质控样质控样质控样的相对标准不确定度为：592 001.0375.2782 003.0lg)()(n=iXrepurepu质控样质控样根据贝塞尔公式，计算出盲样检测结果对数值的样本标准偏差为：432 026.0)lg(lg1112=-=njjjXXns盲样盲样的标准不确定度为：179 004.040432 026.0)(=nsrepu盲样盲样盲样的相对标准不确定度为：733 001.0412.2179 004.0l g(=jnXrepurepu盲样）盲样）3.3.3 合成不确定度和拓展不确定度u 质控样的合成相对标准不确定度为：033006.0)()()()(22221=+=+质控样质控样repuVuVucrelunrelrel合成标准不确定度为：273 014.0lg)()(c=iXcreluu质控样质控样取置信水平 P=95%，自由度 v=39，由 t分布表得 k 2.023，则质控样的拓展不确定度为：0.0299840.028=)(2.023=c质控样质控样uu质控样对数范围为029.0375.2，取反对数后，质控样中菌落总数的测试结果可估算为（222253）CFU/mL。盲样的合成相对标准不确定度为：072006.0)()()(22221=+=盲样)(盲样repuVuVucrelunrelrel合成标准不确定度为：646 014.0lg)crel()(c=jXuu盲样盲样取置信水平 P=95%，自由度 v=39，由 t分布表得 k 2.023，则盲样的拓展不确定度为：030.06290.029=)(2.023=c盲样盲样uu盲样对数范围为030.0 412.2，取反对数后，盲样中菌落总数的测试结果可估算为（241277）CFU/mL。4.结语不同微生物培养过程中存在互生、拮抗等相互作用，明显显现出不均一性，难以准确反映样品中的真实值6。本次试验样品为能力验证标准样品，具有很高的稳定性和均匀性，严格操作可最大限度地减少和避免对不确定度的影响。此次能力验证中，本实验室的结果是令人满意的。因此实验室进行饮用水菌落总数结果测量不确定度的评定时，可借助能力验证的结果进行评估。菌落总数的检测结果发散性较大，直接使用贝塞尔公式计算所得到的不确定度不适合每一个样本8。而微生物呈指数型生长和死亡，选用对数正态分布，用指数表示可以使数据简易化。因此本实验对检测结果取对数值后，算得检测结果的对数样本标准偏差，再利用贝塞尔公式进行计算。菌落总数的检测作为生活饮用水检验的重要组成部分，反映水质是否符合卫生安全要求。正确评定不确定度可以保证检测结果的科学性和公正性，在结果处于超标临界值时发挥重要的判定作用。参考文献：1 GB/T 27418-2017,测量不确定度评定和表示 S2023 年第 1 期 72 CITY AND TOWN WATER SUPPLY水质分析与监测2 CNAS-CL01-G003-2019,测量不确定度的要求 S3 岁源,吴晓军,曹俊,等.食品检验中菌落总数的不确定度评定 J.江苏卫生保健，2013，15（6）：684 GB/T 5750.12-2006，生活饮用水标准检验方法 微生物指标 S5 曹宏燕.分析测试中测量不确定度及评定 第三部分 分析测试中主要不确定度分量的评定 J.冶金分析，2005（03）：82876 李志明.影响菌落总数测定 结果的特殊因素 J.中国卫生检验杂志,2008（2）7 夏宏丽.使用标准物质评定食品菌落总数的不确定度 J.中国卫生检验杂志，2012，022（006）：145014518 钟雨婷，张立实,王君.食品中微生物 的 分 布 J.卫 生 研 究,2016,v.45（02）：1421469 孙晓琴,杨金辉.番茄干中菌落总数测定结果的不确定度评定J.中国卫生检验杂志,2008，018（011）：2388，2394作者通联：附表 1质控样检测结果和不确定度评定编号检测结果（iX）检测结果取对数（iX lg）残差平方（2lglg)(iiXX-）12112.324 0.002 55122172.3360.001 46932192.340 0.001 18042202.342 0.001 04852212.344 0.000 92462222.346 0.000 80972242.350 0.000 602编号检测结果（iX）检测结果取对数（iX lg）残差平方（2lglg)(iiXX-）82242.350 0.000 60292252.352 0.000 511102272.356 0.000 352112292.3600.000 224122292.3600.000 224132322.3650.000 087142322.3650.000 087152332.367 0.000 055162332.367 0.000 055172352.371 0.000 014182352.371 0.000 014192362.3730.000 004202362.3730.000 004212372.3750.000 000222372.3750.000 000232382.3770.000 003242392.378 0.000 013252402.380 0.000 029262402.380 0.000 029272402.380 0.000 029282422.3840.000 081292452.389 0.000 207302462.3910.000 261312492.3960.000 458322492.3960.000 458332522.401 0.000 7082023 年第 1 期 73 CITY AND TOWN WATER SUPPLY水质分析与监测编号检测结果（iX）检测结果取对数（iX lg）残差平方（2lglg)(iiXX-）342522.401 0.000 708352532.403 0.000 802362552.4070.001 008372562.408 0.001 119382592.413 0.001 483392612.4170.001 751402652.4230.002 3482.375lg=iX2lglg1in)(XiiX-=312022.0=注：数据采用四舍六入法计。附表 2盲样检测结果和不确定度统计编号检测结果（iX）检测结果取对数（iX lg）残差平方（2lglg)(iiXX-）12202.342 0.004 87122402.380 0.001 02432422.3840.000 80742432.3860.000 70852432.3860.000 70862442.3870.000 61672452.3890.000 53182462.3910.000 45392462.3910.000 453102472.3930.000 381112482.3940.000 316122502.3980.000 204132502.3980.000 204142502.3980.000 204152512.4000.000 157编号检测结果（iX）检测结果取对数（iX lg）残差平方（2lglg)(iiXX-）162512.4000.000 157172532.403 0.000 083182542.4050.000 054192552.4070.000 032202562.4080.000 016212572.4100.000 005222582.4120.000 000232612.4170.000 020242612.4170.000 020252632.420 0.000 060262632.420 0.000 060272642.4220.000 088282652.423 0.000 122292672.4270.000 204302682.4280.000 253312692.4300.000 308322702.431 0.000 367332702.431 0.000 367342722.4350.000 500352752.4390.000 735362752.4390.000 735372792.4460.001 115382792.4460.001 115392942.4680.003 151403092.490 0.006 044 2.412lg=jX2lglg1jn)(jXjX-=247027.0=注：数据采用四舍六入法计。