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详细方案解决单细胞样本测序芯片使用

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2020年4月19日
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详细方案解决单细胞样本测序芯片使用

近年来研究者认识到肿瘤细胞异质性的存在，继续使用之前的做法——将整个肿瘤组织作为一个样本进行研究，并不能正确的揭示出肿瘤组织中细胞内基因的变化。同样，在动物胚胎发育和植物分生组织研究中，单细胞或者微量细胞也是最重要和最关键的样本类型。因此，激光显微切割(LCM)和单细胞分选技术被大量的应用在这些研究中。可是，如何将显微切割或细胞分选得到的少量甚至单细胞有效的应用在下游研究中，是研究者面临的重大挑战。
1990年，Van Gelder等提出了Eberwine法，将cDNA经过T7体外转录系统合成aRNA，即最经典的RNA线性扩增方法。在此之后，很多非常优秀的学者基于Eberwine法研究出多种不同的RNA扩增方法。基于Eberwine法的线性扩增使用量噬菌体的强启动子，对真核生物的mRNA序列没有偏好，因此扩增产物能够非常好地保持原始转录本中mRNA的丰度，具有非常高的保真度。
Epicentre (an illumina company)利用其著名的T7体外转录体系，对Eberwine技术进行了改良。基于改良技术，提供了多个系列的RNA扩增产品，适用于单细胞样本或者微量RNA样本。
1. 第一链cDNA合成.
使用T7-Oligo(dT)引物
2. 第二链cDNA合成.
cDNA:RNA杂交产物中的RNA被RNase H消化成RNA片段后，合成为第二链cDNA。无需纯化。
3. 体外转录合成aRNA.
带有T7转录启动子并具有方向性的双链cDNA经体外转录后生产aRNA
4. 纯化aRNA.
TargetAmp 1-round的全部扩增步骤为上述1-4步.
TargetAmp 2-round 需要继续进行以下5-8步.
5.第二轮的第一链cDNA合成.
经第一轮合成并纯化得到的RNA经逆转录合成第一链cDNA，使用随机引物.
6.第二轮的第二链cDNA合成.
cDNA:RNA杂交产物中的RNA被RNase H消化成RNA片段。使用T7-Oligo(dT)引物合成cDNA。
7. 体外转录合成 aRNA (Aminoallyl-aRNA).
8. 纯化aRNA， TargetAmp 2-round 扩增过程完成
TargetAmp™技术在芯片和测序中的应用文献：
1. Takacs, E. M., et al. ( ) Ontogeny of the Maize Shoot Apical Meristem. PLANT CELL 24, 3219-3234
该研究经过对玉米的晶胚顶端区域和幼苗进行显微切割后，进行转录组测序。对SAM的个体发生学进行分析。
“Total RNA isolated from the microdissected cells was subjected to two rounds of linear amplification to generate microgram quantities of RNA amenable to RNA-seq analyses (reviewed in Brooks et al., ). Amplified RNA was used to construct cDNA libraries and Illumina-based RNA-seq generated a total of 130 million 44-bp sequence reads that were aligned to the maize genome (see Methods; Schnable et al. , ).”
2. Yang, F., et al. ( ) Laser microdissection and microarray analysis of breast tumors reveal ER-alpha related genes and pathways. Oncogene 25, 1413-9
该研究经过LCM技术分离乳癌组织的上皮细胞，利用Affymetrix Hu133A芯片对基因表示情况进行了分析。对扩增RNA在芯片中的应用进行了论证，并给予了高度认可：“ Therefore, our result agrees with the published studies that two rounds of T7-based RNA amplification accurately preserve the mRNA abundance in the RNA samples, and the combination of LCM and RNA amplification is a reliable approach for gene expression profiling”
3. Fragouli, E., et al. ( ) Transcriptomic profiling of human oocytes: association of meiotic aneuploidy and altered oocyte gene expression. Mol. Hum. Reprod. 16, 570-582 .cn 该研究对不同病人的卵母细胞中基因表示差异进行了深入的分析。