羊乳中掺入牛乳的鉴别技术研究进展_岳明星.pdf

2022 年第 12 期文章编号：1671-9646（2022）12b-0071-04第 12 期（总第 566 期）农产品加工No.122022 年 12 月Farm Products ProcessingDec.摘要：羊乳作为一种新兴乳制品，因其全面的营养价值与独特的保健功能越来越受到人们的青睐。羊乳中掺入牛乳的掺假鉴别是目前乳品行业质量控制的难题之一，其对保障乳品营养健康和质量安全具有重要意义。重点综述了目前国内外现有的羊乳中掺入牛乳的鉴别技术，旨在为进一步完善检测技术体系提供参考。关键词：羊乳；牛乳；掺假；鉴别技术中图分类号：TS252.7文献标志码：Adoi：10.16693/ki.1671-9646（X）.2022.12.047Distinguish of Cow Milk Adulteration in Goat MilkYUE Mingxing，JIAN Weijie，CHEN Si，LI Bo，WEI Qing，CHEN Liang，*XIN Xiulan（College of Bioengineering，Beijing Polytechnic，Beijing 100176，China）Abstract：As an emerging dairy product，goat milk is more and more favored for its comprehensive nutritional value and u-nique health care function.The adulteration identification of cow milk is one of the difficult problems in quality control in thedairy industry，which is of great significance to ensure the safety of dairy products.This paper focused on reviewing the exist-ing identification technology of goat milk mixed with cow milk at home and abroad，aimed to provide a reference for furtherimproving the detection technology system.Key words：goat milk；cow milk；adulteration；detection technology羊乳中掺入牛乳的鉴别技术研究进展岳明星，简伟杰，陈思，李浡，危晴，陈亮，*辛秀兰（北京电子科技职业学院 生物工程学院，北京100176）收稿日期：2022-01-16基金项目：北京电子科技职业学院博士重点课题项目（2021H075-KQ，2020H027-KQ）；老化对小鼠卵母细胞和早期胚胎中 DNA 甲基转移酶表达量化和组蛋白甲基化状态的影响（2017Z005-012-KXB）；玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞和早期胚胎及其后代DNA 甲基化的影响（2018Z002-011-KXB）；动物胚胎冷冻保存（2021H097-KQ）；天然产物国家标准样品研制及产品开发技术研究（SG030801）。作者简介：岳明星（1982），女，博士，讲师，研究方向为生物技术。*通讯作者：辛秀兰（1969），女，博士，教授，研究方向为食品生物技术。现代营养学研究发现，羊乳与人乳蛋白质组成相似，氨基酸比例接母乳，营养成分均衡，消化时间短。另外，羊乳脂肪球小，中短链脂肪酸含量高，易于人体消化吸收，更适合婴儿、中老年人食用。羊乳可降低婴幼儿发生过敏的几率，与牛乳相比，羊乳含有更多易于消化吸收的 a-乳清蛋白，含有较少的致敏蛋白 s1-酪蛋白，可解除或缓解大部分宝宝因牛奶蛋白引起的过敏症。同时，羊奶中免疫球蛋白、核苷酸等天然成分含量也比较高，对婴幼儿的生长发育大有益处。因此，羊乳以其营养丰富、易于吸收等优点被称为“奶中之王”，是世界上公认的最接近于人奶的乳品1。但羊乳产量低、养殖要求高，价格高于牛乳。莎能奶山羊产奶量最高，年产奶量仅为 6001 200 kg，而一头荷斯坦奶牛平均年产 7 00010 000 kg，最高可达 12 000 kg。因为羊奶的资源相对牛奶要珍贵很多，奶山羊与奶牛对生存环境的要求不同，奶牛适宜圈养，喂人工饲料，而奶山羊适宜放牧养殖，以吃青草和干草为主，不喂人工饲料。在国际市场上羊奶比牛奶普遍贵 25 倍。另外，羊奶具有极高的营养价值、医疗保健价值和美容护肤价值。因此，羊奶价格比牛奶高的事实很难改变。在国际市场，羊乳产品的生产和销售呈现出强劲的增长势头。近年来，我国的羊乳制品在市场上得到了消费者的认可，不少消费者选择了喝羊乳。婴幼儿羊乳粉的价格也普遍高于牛乳粉。近年来，随着羊乳消费人数的增加和消费市场的不断扩大，在羊乳中掺入牛乳的现象时有发生。为了降低成本、提高供应量，一些不法商贩在羊乳及羊乳制品（如奶粉、酸奶、奶酪等）中掺牛乳成分冒充羊乳，以此来欺骗消费者。同时，羊乳中掺入牛乳的行为可能会导致对牛乳过敏者不知情况下误食，发生过敏反应，危害消费者健康与婴幼儿的生命安全2。针对这一问题，如何快速鉴别羊乳中掺入牛乳，对保障消费者安全、保护守法羊乳企业的合法权益农产品加工2022 年第 12 期具有重要意义。如何快速鉴别羊乳及其制品中掺入牛乳源成分，保证羊乳的营养健康和质量安全对维护羊乳制品消费市场健康可持续发展至关重要。从电泳法、免疫法、色谱法等方面鉴别分析了羊乳中掺入牛乳，对不同方法的灵敏度、检出限进行了对比。1羊乳与牛乳主要组分比较鉴别之前，熟知羊乳和牛乳组分含量差异是非常必要的，以找到合适的标记成分进行鉴别掺假。羊乳与牛乳中蛋白质种类及含量3见表 1。从表 1 可看出，羊奶与牛奶组成相近，但其各组分含量存在差别，因此这些组分差距是建立鉴别方法的依据。2电泳法2.1聚丙烯凝胶电泳法（SDS-PAGE）SDS-PAGE 是分析蛋白的一种常用技术，技术原理是通过各种蛋白分子量大小、携带电荷数的不同导致的迁移速率不同而进行分离。Tamimed A Y 等人4利用 SDS-PAGE 法对 s1-酪蛋白进行标记，发现牛乳中 s1-酪蛋白的迁移速率显著高于羊乳中s1-酪蛋白。Kaminarides S E 等人5利用牛乳酸乳中的副 -酪蛋白为标记成分，对羊乳酸乳进行检测，牛乳检出限为 1%。Veloso A C A 等人6采用尿素-PAGE 法根据牛乳 s-酪蛋白组成不同于羊乳，可将混入羊乳中 5%的牛乳检出。2.2等电点聚焦（IEF）等电点聚焦是根据蛋白等电点主要对不同基因变异体的酪蛋白进行分离。该方法对山羊原料乳和乳制品中掺牛乳的检出均有很高的灵敏度。依据的主要标记成分是-caseins 的水解产物，2-caseins和 3-caseins，这 2 种蛋白的等电点范围在 pH 值6.57.5。该方法的检出灵敏度可达到 0.5%7，缺点是不适用鉴别羊乳中掺入牛乳清浓缩蛋白。2.3毛细管电泳（CE）毛细管电泳（Capillary electrophoresis，CE）又称高效毛细管电泳，是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。毛细管电泳实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，使分析化学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。长期困扰生物大分子（如蛋白质）的分离分析也因此有了新的转机。毛细管电泳在乳制品检测分析中，可对乳清蛋白和酪蛋白进行有效分离和精准的定量。Cartoni G等人8开展采用毛细管电泳法鉴别了羊乳制品中掺入的牛乳源性成分。以 pH 值 9.2 的硼酸钠为背景电解质，利用甲基硅烷毛细管，目标蛋白峰具有很好的分辨率。混合液体乳样品中牛乳的最低检出限 2%，混合奶酪样品中检出体积分数为 4%。个体遗传差异和热处理会影响检测结果。DeJongN等人9已成功将羊乳中掺入的牛乳（1%）检出。Molina E 等人10分析混合乳中酪蛋白的毛细管电泳图，利用偏最小二乘回归法和主成分回归分析法，对获得的目标蛋白峰进行了判定，采用二次多项式模式分析时，不同品种乳制品含量百分比的均方根预测误差低于 2.4%。毛细管电泳的出现将 s1-酪蛋白作为标记组分，可以使混入牛奶的检出限从8%降到 1%11。此外，-酪蛋白、-酪蛋白也可作为指纹成分12。电泳法鉴别羊乳和牛乳的标记组分见表 2。3PCR 技术根据对不同动物组织中存在的特异性 DNA 序列设计引物，进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，根据不同动物组织中特异性序列的差异进而达到鉴别乳品种的目的。Lopez-Calleja I 等人13利用针对线粒体12S rRNA 的基因引物，建立了对绵羊和山羊奶中掺入牛奶的聚合酶链反应（PCR）鉴定方法。利用与保守 DNA 序列互补的正向引物，以及针对奶牛的反向引物，从牛奶的 DNA 中获得了一个 223 bp 的特定片段，而在绵羊和山羊奶 DNA 中没有获得扩增信号。该技术应用于原料乳、巴氏杀菌乳和常温牛羊混合奶，使对牛奶的特异性检测具有良好的灵敏度阈值（0.1%）。该技术建立的 PCR 检测方法是一种快速、直接的方法，适用于牛奶和其他乳制品的常规鉴定分析。Bania J 等人14和 Maudet C 等人15已成功采用PCR 技术，将混入羊乳及羊乳奶酪中的牛乳检出，且检出限可达到0.1%。基于 DNA 的稳定性，经过高温处理的乳样也可表 1羊乳与牛乳中蛋白质种类及含量种 类羊乳牛乳酪蛋白s1-酪蛋白s2-酪蛋白+酪蛋白乳清蛋白82.7018.928.5255.2617.3082.6530.807.5044.3517.35表 2电泳法鉴别羊乳和牛乳的标记组分鉴别技术标 记 组 分参 考 文 献聚丙烯凝胶电泳法牛奶副-casein牛奶 S1-casein牛奶-caseinKaminarides et al.（2002）Tamime et al.（1999）Veloso et al.（2002）等电点聚焦（IEF）牛奶 2-和 3-caseinsAnonym（2001）毛细管电泳山羊乳-乳白蛋白和牛奶-乳球蛋白 A牛乳，绵羊乳和山羊乳酪蛋白和乳清蛋白Cartoni et al.（1999）De Jong et al.（1993）/g （100 g 蛋白质）-1722022 年第 12 期以达到此检出限。目前，已发展出一种连接酶链式反应（LCR）和酶免疫测定（EIA）相结合的 PCR 技术。以不同于绵羊和山羊乳的牛乳中 -酪蛋白中8411 位基因为基础，提取 DNA，PCR 扩增 -酪蛋白，以扩增得到的片段为模板，进一步和不同品种乳特异性引物进行 LCR 反应，检测出牛乳16。以DNA 为基础的检测方法的优点就是灵敏性高、检测速度快。由于 DNA 是来自于体细胞，而体细胞的计数会受许多因素的影响，导致该方法难以准确定量牛乳的含量。4ELISA 酶联免疫法近年来，随着免疫学技术的成熟和发展，利用ELISA 方法在羊乳中定量检测掺入的牛乳成分受到越来越多的关注。该方法的原理主要是利用特定单抗和多抗与乳清蛋白（牛-Lg，羊乳清）、酪蛋白（牛-casein，-casein，s1-casein）及酪蛋白水解肽发生特异性反应，达到检测目的，其检测灵敏度可低于 0.5%。和其他技术相比，ELISA 方法操作简单、灵敏高、检测成本低，缺点就是该方法耗时长、要求较高的抗血清浓度17。Hurley I P 等人18开发了一种间接竞争性 ELISA方法，用于快速鉴别山羊、绵羊和水牛奶中的掺入牛奶。该试验使用了一种针对牛 IgG 产生的单克隆抗体，该抗体可识别牛 IgG 和 IgG 重链上的一个物种特异性表位。使用过氧化物酶偶联的抗小鼠 IgG 抗体检测结合的单克隆抗体，随后底物在酶的作用下，通过测定不同掺假乳样混合物时，吸光度有明显差异。ELISA 方法具有高度特异性的。该检测方法的检测限为 1.0 g/mL 牛 IgG，或 0.1%的牛乳检测限。该方法具有较高的重复性，适用于高通量筛选。此外，夹心-ELISA 法19-20在检测牛乳成分方面得到广泛应用。薛海燕等人21在羊乳中掺入牛乳的间接 ELISA定量检测时选择抗 -酪蛋白多克隆血清，间接ELISA 法用于原乳检测时，掺入牛乳的百分含量与A450 nm 在 4%50%呈线性关系，该方法的最低检出量为 4%。所建立的 ELISA 方法变异系数 5%，回收率在 94%105%，符合方法学要求，可用于牛乳掺假的定量检测。对灭菌乳的检测表明，热处理不改变 -酪蛋白与抗体反应的特性，方法还可用于经热加工的乳品检测中。以 ELISA 原理开发的快检试剂盒具有准确度高、专一性强、灵敏度高等优点，操作方便，不需要特殊的仪器设备，可同时对几十个甚至上百个样品进行检测，避免了常规检测方法存在的耗时长、操作繁琐等缺点。因此，该方法适合乳品质量安全现场快速检测，是乳品掺假检测技术的重要手段。ELISA 技术鉴别羊乳中的掺入牛源性成分见表 3。表 3ELISA 技术鉴别羊乳中的掺入牛源性成分抗原抗体ELISA 类型检测下限抗体专一性提高方法牛乳清蛋白牛乳酪蛋白牛 s1-酪蛋白牛 -酪蛋白牛 IgG多克隆抗体（兔抗牛）多克隆抗体（兔抗牛）多克隆抗体（兔抗牛）单克隆抗体（鼠抗牛）单克隆抗体（鼠抗牛）间接 ELISA间接 ELISA竞争 ELISA竞争 ELISA竞争 ELISA1.00%（v/v）1.00%0.15%0.50%0.10%抗血清经过亲和色谱纯化，用生物素标记后，再经过羊乳清蛋白免疫吸附提高专一性抗血清经过亲和色谱纯化，用生物素标记后，再经过羊乳酪蛋白免疫吸附提高专一性将牛 s1-酪蛋白的特异性片段与载体结合，构建高特异性抗原，以提高对应抗体的专一性单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备5色谱技术5.1液相色谱 HPLCHPLC 分析技术是鉴别羊乳中掺入牛乳的另一项技术。此项技术的优势在于其高速、简单，可实现自动化。目前，反向色谱（RP-HPLC）、离子交换色谱、疏水性液相色谱均可用于分析乳蛋白。RP-HPLC 主要用于分析乳中的乳清蛋白（-La，-Lg和 BSA），根据羊乳和牛乳中各种乳清蛋白的保留时间不同进行区分22。Veloso A C A 等人6也采用 RP-HPLC 技术成功以-casein 为标记成分，检测出羊乳中掺入 5%的牛乳。疏水交互作用色谱（HIC）与强变性剂结合，分析酪蛋白的峰面积比值，如 s1 酪蛋白/酪蛋白，s2 酪蛋白/酪蛋白，酪蛋白/酪蛋白，s2 酪蛋白/s1 酪蛋白，作为检测羊乳中掺入牛乳的指标23。液质联用的新技术，目前在检出牛乳方面得到发展和应用。根据蛋白结构建立的牛乳指纹图谱，可以快速、简单地对蛋白样品进行检测。Cozzolino R等人24使用基质辅助激光解析/电离质谱（MALDIMS）以牛 -乳球蛋白 A 和 B 为标记成分成功准确检出羊奶中混入的牛奶。5.2气相色谱低分子量脂肪酸在羊乳和牛乳的脂肪中含量均比较高。但羊乳中 C60，C80，C100，C120，C140 直链脂肪酸含量均高于牛乳，其中 C100直链脂肪酸含量的差别最为显著。以此为基础，可以检测羊乳产品中掺入的牛乳。岳明星，等：羊乳中掺入牛乳的鉴别技术研究进展73农产品加工2022 年第 12 期葛武鹏等人25分析牛、羊乳及其酸乳、奶酪脂肪酸组成及变化特点，羊乳及其制品的脂肪酸质量优于牛乳及其制品，牛、羊乳加工后长链饱和脂肪酸含量降低，短链饱和脂肪酸含量增加。Benassi 建立了基于 C12/C10 比值的检测技术，当羊乳中掺入牛乳的含量在 15%20%时都可以检测出来。相关研究表明，基于 C4/C6+C8 和 C12/C10 的比例可以定量检测羊乳及其制品中掺入的牛乳成分。6光谱技术近红外光谱技术是近年来发展起来的一项高速、高效分析技术。褚莹等人26利用近红外光谱技术结合多种化学计量方法，快速鉴别掺假羊乳。分别对用偏最小二乘差别分析（PLS-DA），fisher 线性辨别和多层感知器（MLP）神经网络法建立校正的模型进行检验验证。其中，MLP 神经网络法鉴别效果最佳，正确率可达 100%。近红外光谱技术结合适当的化学计量学法，实现羊奶掺假检测的快速无损鉴别。7感官法目前，采用电子舌对羊乳的真假进行鉴别也成为一种新型技术。电子舌有 36 个交叉灵敏的传感器，可成功辨别 5 种基本的味道。Dias L A 等人27将电子舌设备与线性判别分析相结合，测定记录不同数据信号，建立模型，进而对脱脂乳中是否掺有牛乳进行辨别，其中辨别灵敏度和特异性分别可达到97%和 93%。8结语羊乳制品作为新兴的乳制品，正逐渐被广大消费者接受，未来具有广阔的市场前景。因此，针对羊乳制品中掺入牛乳这一检测需求，选择特异性强、灵敏度高、检测速度快的鉴别方法，对确保我国羊乳营养品质、质量安全水平、产业健康发展具有重要意义。通过对以上各种方法进行比较，在将来快速、简单、无损、实时性、低成本的方法还有待继续探索与推广。参考文献：陈建明，冯建忠，张居农.山羊奶营养及加工工艺特性 J.中国奶牛，2009（4）：42-45.杨光，王加启，卜登攀，等.乳及乳制品蛋白质掺假检测研究进展 J.食品科学，2010（9）：306-312.Ceballos L S，Moralesa E R，Adarve G T，et al.Composition of goat and cow milk produced under similar conditionsand analyzed by identical methodology J.Journal of FoodComposition and Analysis，2009，22（4）：322-329.Tamime A Y，Barclay M N I，Law A J R，et al.Kishk-adried fermented milk/cereal mixture.2 Assessment of a variety of protein analytical techniques for determining adulteration and proteolysis J.Le Lait，1999，79（3）：331-339.Kaminarides S E，Koukiassa P.Detection of bovine milk inovine yoghurt by electrophoresis of para-casein J.Food Chemistry，2002，78（1）：53-55.Veloso A C A，Teixeira N，Ferreira I M.Separation andquantification of the major casein 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