孕激素诱导耐药的子宫内膜癌细胞生物学特性的比对分析_邢宝玲.pdf

解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1论著【摘要】目的探讨孕激素诱导耐药子宫内膜癌细胞的生物学特征，为治疗耐药子宫内膜癌提供实验依据。方法以子宫内膜癌 Ishikawa 细胞（IS）为母代，建立孕激素耐药细胞（PR）；通过 CCK8、流式细胞术对比PR 细胞与IS细胞的表型特征；通过RTPCR、Western blotting、PCR+毛细管电泳、RNA 测序技术进行PR 细胞、富含 AT 的结合域 1A（ARID1A）敲除细胞（ARID1A KO）和 MUTL 同源物 1（MLH1）敲除细胞（MLH1 KO）的 B 型孕激素受体（PRB）表达量、ARID1A 表达量、微卫星不稳定（MSI）、基因转录组的检测对比。结果与IS细胞相比，PR细胞凋亡率增高（P=0.026，P0.05）、G0/G1期细胞比例增高（P=0.041，P0.05）及 S 期细胞比例降低（P=0.018，P0.05），差异有统计学意义，PR 细胞增殖率差异无统计学意义（P0.07）；与 IS 细胞相比，PR 细胞的 ARID1A mRNA 和蛋白表达量差异无统计学意义（分别为 P=0.79 和 P=0.64），PR细胞无 MSI，ARID1A KO 和 MLH1 KO 细胞中 PRB 的 mRNA 和蛋白表达量下降，差异有统计学意义（均 P0.05）；与 ARID1A KO 和 MLH1 KO 细胞相比，PR 细胞与 IS 细胞的基因转录组信息更相近。结论与 ARID1A 突变和 MLH1 突变的癌细胞相比，孕激素诱导耐药癌细胞的生物学特性与其母代子宫内膜癌细胞更相似。【关键词】子宫内膜癌；孕激素；B型孕激素受体；富含AT的结合域1A；微卫星不稳定；基因转录组基金项目：上海市浦东新区科技发展基金（PKJ2020Y45）DOI：10.20021/ki.16710770.202.0.02Comparative analysis of biological characteristics of endometrial cancer cell line with progesterone inducedresistanceXING Baoling，ZHANG Yongying，RONG Danping，XIANG Lintao，ZHU HuiDepartment of Pathology，Affiliated Zhoupu Hospital of Shanghai University of Medicine and Health Sciences，Shanghai 201318，ChinaCorresponding author：XING Baoling，Email：【Abstract】ObjectiveTo investigate the biological characteristics of endometrial cancer cell line with progesteronereduced resistance by compared to different cells.MethodsAprogestinresistance cell line（PR）was established by using endometrial carcinoma Ishikawa cells（IS）.By CCK8，flow cytometry，the phenotypic characteristics of PR cells and IS cells were compared.By RTPCR，Western Blot，PCR+capillary electrophoresis，and RNAsequencing，PR，ATrich binding domain 1A Containing protein 1A（ARID1A）knockout cells（ARID1A KO）andMutL homolog 1（MLH1）knockout cells（MLH1 KO）were identified for progesterone receptor type B（PRB）expression，ARID1A expression，Microsatellite Instability（MSI），gene transcriptome detection.ResultsCompared withIS cells，the higher apoptosis rate（P=0.026，P0.05），the higher proportion of cells in G0/G1phase（P=0.041，P0.05）and the lower proportion of Sphase cells（P=0.018，P0.05）of PR cells was statistically significant，the difference of the proliferation rate（P=0.07）of PR cells was not statistically significant.Compared with IS cells，thedifference of ARID1A mRNA and protein expression（P=0.79，P=0.64）of PR cells was not statistically significant，there was no MSI in PR cells，the lower mRNA and protein expressions of PRB of ARID1A KO and MLH1 KO cells孕激素诱导耐药的子宫内膜癌细胞生物学特性的比对分析邢宝玲，张咏英，戎丹平，项霖涛，朱慧上海健康医学院附属周浦医院病理科，上海201318通讯作者：邢宝玲，Email：713解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1（P0.05，P90%，离心取上清。使用 BCA 蛋白浓度检测试剂盒进行蛋白浓度测定，取 80 l 裂解液加入 20 l 5SDSPAGE 蛋白上样缓冲液，沸水煮 5 min。20 g 上样量进行蛋白SDSPAGE 电泳，BioRad 半干法转印到 PVDF 膜后，用2%BSA 溶液封闭1 h，鼠抗PRB单克隆抗体或兔抗 ARID1A 单克隆抗体 4过夜孵育，用连接了HRP的兔抗或鼠抗37孵育1 h，按照1 1的比例配制 ECL 化学发光液，均匀滴加于 PVDF 膜上后，使用凝胶成像系统检测发光。1.2.3实时荧光定量RTPCR检测PRB和ARID1A的mRNA表达水平TRIzol法提取细胞总RNA，用8解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1Nanodrop 1000检测RNA浓度和纯度；按照AccessQuick RTPCR System 的步骤进行逆转录及 cDNA扩增；利用pUC18质粒，构建pUC18PRB和pUC18ARID1A质粒，质粒浓度利用紫外分光光度计进行测量后，依次进行10倍稀释，设空白对照，绘制标准曲线。将 GoTaq qPCR Master Mix 加入样品中，用 MA6000 型实时荧光定量 PCR 仪进行 RTPCR反应，定量分析PRB mRNA及ARID1A mRNA的含量，用 copies/ml 表示。PRB 的引物序列：Forward：5 GTATTTGTGCGTGTGGGTGG3，Reverse：5GTGGGGAGCGCAAGAAAAAG3；ARID1A 的引物序列：Forward：5GGAGATGTACAGCGTGCCAT3，Reverse：5AGAGGTGCGGTTCTCCATTG3。1.2.4CCK8法检测细胞的增殖能力用CCK8试剂盒检测细胞增殖能力，以 2103细胞/孔的浓度100 L 种植于 96 孔细胞培养板，每组 4 个复孔，培养6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h，丢弃培养液，加入含有CCK8的DMEM高葡萄糖液继续在37孵育2 h，全自动酶标仪在波长450 nm条件下读取每孔的吸光度（A）值。1.2.5流式细胞术检测细胞凋亡率按照Annexin凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡，以5 105细胞/孔，每组3个复孔，冷冻的PBS清洗，用 100 L 1AnnexinV Binding Buffer重悬细胞；每100 L细胞悬液，添加5 l Annexin V AbFluorTM 488和2 l PI，室温下，暗处理细胞 15 min；冰上添加 400 l 1 Annexin VBinding Buffer，30 min 内流式细胞仪的 532 nm（FITC channel）和 617 nm（PI channel）通道检测。1.2.6流式细胞术检测细胞周期按照细胞周期检测试剂盒检测细胞周期，取2106细胞/孔，每组3 个复孔，用预冷的 PBS 洗涤细胞，600 g 离心 5min，除去上清，用预冷的 70%乙醇缓慢重悬细胞，将细胞在-20下放置 24 h固定；4 1 000 g 离心5 min，除去乙醇；将细胞重悬于 1 mL 预冷 PBS中，4 500 g 离心细胞 10 min，重复 2 次；将细胞重悬于 0.5 mL 染液中，在黑暗中 37孵育 30min；用 PBS 洗涤细胞，24 h 内在流式细胞仪的通道（Ex/Em=535/615 nm）分析细胞。1.2.7PCR 及毛细管电泳法检测 MSI吸去贴壁细胞的培养基，刮取细胞转移到离心管，加入蛋白酶 K 及缓冲液 GB，充分混匀，溶液清亮后，加人200 l 无水乙醇，将溶液加入吸附柱CB3中，充分洗涤，将吸附柱CB3转入另一个离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50200 l 洗脱缓冲液TE，离心后，将溶液收集到离心管中；测定纯化后的 DNA 浓度，以 100 ng/l 的投入量进行 PCR 反应，PCR反应试剂为TaKaRa Ex TaqHot Start Version。MSI 检 测 选 取 贝 斯 塔 遗 传 标 记：Bat26、Bat25、D5s346、D2s123和D17S250。PCR扩增产物在 ABI3500 Genetic Analyzer 上进行毛细管电泳，用GeneScan软件进行数据分析。1.2.8RNA测序（RNA sequencing，RNAseq）检测细胞的转录组特征TRIzol 法提取细胞总 RNA，检测 RNA 浓度和纯度，将富集获得的 mRNA 打断为短片段，并逆转录为互补 cDNA（complementaryDNA，cDNA），对其进行修复及适当修饰并进行筛选，筛选后通过 PCR建立cDNA文库。对cDNA文库进行检测确认其符合后续实验要求，上机测序。用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG，www.kegg.jp/kegg/kegg1.html）数据库 及R软件进行通路富集分析，使用Hisat2将两头测序的序列与参考基因组 GRH37 进行比较，根据比对结果，使用Counts v1.5.0函数对每个基因的序列进行计数，绘制该基因的读取计数。采用 DESeq2（1.10.1）进行两组间差异表达分析。用Benjamini和Hochberg的方法对所得的 P 值进行了调整，以控制 FDR（falsediscovery rate）。AQ 值 1为显著差异表达的阈值。1.3统计学分析采用 SPSS 22.0 软件进行统计学分析。计量资料以均值 标准差（MeanSD）表示，各组间数据的比较依据资料的性质，采用 t 检验或方差分析。P0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1孕激素耐药的PR细胞诱导成功PR细胞在含40 mol/L MPA 培养基中的生长速率与母代 IS 细胞在不含 MPA 培养基中生长速率基本一致，其生长曲线见图1A。PR 细胞中的 PRB mRNA 量（411.6933.99）较IS细胞（901.5159.81）明显降低，差异有统计学意义（P0.05，图 1B），Western blot 检测结果表明 PR细胞中的 PRB 蛋白量（5586.502318.57）较 Ishikawa细胞（14093.154631.91）明显降低，差异有统计学意义（P0.05，图 1C），建立了低表达 PRB 的子宫内膜癌耐孕激素细胞株。9解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.13.02.52.01.51.00.50OD450ISPR1 d2 d3 d4 d5 d6 d7 dISPRT/DISISPR118 KDaPR45 KDaPRBactingPRB1.51.00.50.0Relative abundance*ISPR1.20E+031.00E+038.00E+026.00E+024.00E+022.00E+020.00E+00PRB（copies/ml）PR*PRABC图1孕激素耐药的PR细胞A.母代IS细胞和耐孕激素PR细胞的生长曲线图；B.实时荧光定量RTPCR检测PR细胞中PRB mRNA 的表达量（copies/ml）比IS细胞降低；C.Western blot 检测PR细胞中PRB蛋白量比IS细胞降低。*与IS组比较，*P0.010.80.70.60.50.40.30.20.10A450*PRIS时间（h）图2PR细胞增殖检测结果061224487296105.5105104103102PEH103104105106107107.8FITCHQ413.89%Q420.17%Q4394.36%Q441.58%105.5105104103102PEH103104105106107107.8FITCHQ420.22%Q413.07%Q441.24%Q4395.47%898800600Count40020001200400PEA（103）600 718.3G1G2WatsonRMS:3.81Freq G1:35.75Freq S:45.35Freq G2:15.94Mean G1:221.867Mean G2:433.408G2/G1:1.95CV G1:2.81%CV G2:2.74%Freq SubG1:0.17Freq SuberG2:2.78397320240Count1608001200400PEA（103）600 718.9WatsonRMS:2.43Freq G1:32.82Freq S:47.11Freq G2:18.04Mean G1:220.264Mean G2:430.655G2/G1:1.96CV G1:3.72%CV G2:4.54%Freq SubG1:0.30Freq SuberG2:1.72G1G2PRISPRIS图3与IS细胞相比，PR细胞的凋亡率和周期改变A.细胞凋亡图 B.细胞周期图AB2.2与IS细胞相比PR细胞增殖能力的检测结果当 PR 细胞与 IS 细胞均在不含 MPA 的培养基中培养96 h后，PR细胞的A450值为0.720.02，与IS细胞（0.690.01）相比，差异无统计学意义（t=2.46，P=0.07，图2）2.3与IS细胞相比PR细胞凋亡及周期实验结果PR 组的细胞凋亡率为（1.760.15）%，高于 IS组的（1.210.03）%，差异有统计学意义（t=6.03，P=0.026，P0.05，图3A）。PR 组 G0/G1期的细胞比例为（36.290.96）%，高于 IS 组的（32.180.61）%，差异有统计学意义（t=4.76，P=0.041，P0.05）；PR 组 S 期的细胞比例为（45.270.35）%，低于IS组的（47.680.55）%，差异有统计学意义（t=7.29，P=0.018，P0.05），差异较小。PR 组 G2/M 期细胞比例为（16.220.72）%，与 IS 组的（17.390.59）%相比，差异无统计学意义（t=1.76，P=0.23，图3B）。2.4PR细胞中ARID1A表达量的改变PR 细 胞 中 的 ARID1A mRNA 量（6811.82 1612.60）较 IS 细胞（6490.67655.42）的差异无统计学意义（t=0.35，P=0.79，图 4A），PR 细胞中的ARID1A 蛋 白 量（15335.93 3224.86）较 IS 细 胞（16513.312458.78）的差异无统计学意义（t=0.50，P=0.64，图4B）。2.5PR细胞微卫星稳定性检测结果MSI 的判定选取 Bethesda 遗传标记作为评价标 准，检 测 5 个 位 点，即 Bat26、Bat25、D5s346、D2s123 和 D17S250，以 IS 细胞作为对照，如果 PR细胞2 个位点有 MSI（+），为 MSIHigh；若 1 个位点有 MSI（+），为 MSILow；若没有位点出现 MSI，为微卫星稳定（Microsatelite Stable，MSS）。结果显示，与 IS 细胞相比，PR 细胞 Bat26，Bat25，D5s346，D2s123和D17S250基因位点均无突变，PR 细胞无MSI特征（图5，表1）。10解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.12.6ARID1A KO 细胞和 MLH1 KO 细胞中 PRB表达量的改变ARID1A KO 细胞中的 PRB mRNA 量（586.1515.68）较 IS 细胞（901.5159.81）中降低，MLH1 KO细胞中的 PRB mRNA 量（196.7621.96）较 IS 细胞（901.5159.81）中降低，差异有统计学意义（P0.01，图 6A）；ARID1A KO 细胞中的 PRB 的蛋白量（13169.971535.74）较 IS 细胞（18298.983675.24）中 降 低，MLH1 KO 细 胞 中 的 PRB 的 蛋 白 量（4169.541977.14）较 IS 细胞（18298.983675.24）中降低，差异有统计学意义（P0.05）表1 PR细胞MSI的检测结果样本PR基因BAT26D17S250D5S346BAT25D2S123检测位点MSI是否携带否否否否否检测结果MSS图 5PCR 及毛细管电泳技术检测 PR 细胞 MSI 的测序图，参照为IS细胞BAT26D17S250D5S346BAT25D2S123PRishikawaISARID1A KOMLH1 KO1.51.00.50.0Rclatlve abundankoPRBactingISARID1A KO MLH1 KO45 KDa*PRB1.20E+031.00E+038.00E+026.00E+024.00E+022.00E+020.00E+00PRB（copies/ml）ISARID1A KOMLH1 KOMLH1 KO*图6ARID1A KO细胞和MLH1 KO细胞中PRB表达量的改变A.实时荧光定量 RTPCR 检测两组细胞 PRB mRNA 的表达量（copies/ml）；B.Western blot检测两组细胞PRB蛋白量。*与IS组比较，*P0.05），说明PR细胞与IS细胞的表型相似。随着对子宫内膜癌发生发展分子机制认识的不断深入，一些学者对孕激素耐药的研究从孕激素与孕激素受体相互作用拓展到发现基因改变导致孕激素不敏感的现象。Panayiotis 等13从 Cochrane、Embase、MEDLINE 和 PubMed 等 4 大数据库中筛选出 34 篇早期子宫内膜癌保育治疗的论文，包括 9 165 位患者，分析后总结出了子宫内膜癌常见基因改变对孕激素治疗的不同影响，PTEN和POLE 改变是保守治疗的良好预后因素，评分0分，有利于保育治疗；MSI、CTNNB1 和 KRAS 改变是一般预后因素，评分1分，告知患者复发风险后可 以 保 育 治 疗；PIK3CA、HER2、ARID1A、P53、L1CAM 和 FGFR2 改变是差预后因素，评分 26分，ARID1A 评分为 3 分，不推荐进行保育治疗。约 30%的子宫内膜癌丢失一个或多个 MMR（Mismatch repair，MMR）蛋白，形成错配修复缺陷（Deficiency of mismatch repair，dMMR），Chung 等14的临床研究发现 Dmmr/MSIH 型子宫内膜癌患者在初始治疗时即对孕激素的反应差，可能这类患者的孕激素治疗与孕激素受体表达无关；而本实验显示 MLH1 KO/MSIH 细胞的 PRB 表达量显著减少，提示PRB减少可能是dMMR/MSIH 型子宫内膜癌患者孕激素耐药的原因，其中的机制还需要进一步研究。另外，ARID1A基因突变常见于子宫内膜癌，突变率约 35%15，本课题组前期对 PR 细胞和ARID1A KO 细胞的研究发现，ARID1A 突变和孕激素长期作用均可使癌细胞中的 pAkt 增多及PRB减少，产生孕激素耐药，但是，pAkt抑制剂可以逆转PR细胞的耐药，却无助于提高ARID1A KO细胞中PRB表达及改善其耐药4。在子宫内膜癌细胞中，ARID1A 突变和dMMR/MSIH 都可以导致PRB 表达下降，反之，孕激素诱导的 PRB 减少对ARID1A基因和微卫星状态并无影响，从细胞水平上证明 ARID1A 突变和 MSIH 是子宫内膜癌孕激素耐药的始发因素，耐药特征与孕激素的诱导无关，可能是不易逆转的孕激素耐药状态，需要寻找有效的靶点来提高 PRB 的表达或对抗 PRB 降低形成的下游信号通路的改变。基因转录组分析结果显示，在 PR、ARID1AKO 和 MLH1 KO 3 组细胞中，PR 细胞与 IS 细胞的基因转录组信息最为相近；与 IS 细胞相比，PR 细胞仅有 273 个基因 mRNA 发生明显的上调或下调，而ARID1A KO细胞和MLH1 KO细胞中显著改变的基因数量比 PR 细胞中明显增多，PR 细胞的基因改变更简单；此外，基因富集分析发现 PR 细胞中基因差异最大和数目最多的 10 个信号通路中包括与脂代谢和糖代谢相关的通路，代谢综合征与 I 型子宫内膜癌的发生、发展和治疗密切相关16，进一步说明了 PR 细胞与 IS 细胞生物学特性的相似。所以，PR细胞仅在有限程度上改变了I型子宫内膜癌细胞的生物学特征，与 ARID1A 突变和MLH1 突变的孕激素耐药相比，孕激素诱导耐药可能是较为容易逆转的状态，还需要更深入的基础实验和临床研究以寻找恢复孕激素敏感性的途径。作者贡献声明邢宝玲负责参与课题实验设计、实施、论文攥写和相关行政、技术工作支持；张咏英参与实验实施和论文攥写；戎丹平参与实验设计和实施；项霖涛负责负责数据采集和分析、论文攥写和相关行政、技术工作支持；朱慧参与实验设计和实施、负责数据采集和分析利益冲突所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突机构伦理问题研究方案经上海健康医学院附属周浦医院伦理委员会批准参考文献1Chen W，Zheng R，Baade PD，et al.Cancer statistics inChina，2015 J.CA Cancer J Clin，2016，66（2）：115132.2Zhuo Z，Wang A，Yu H.Metformin targeting 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