枳壳溃疡病致病菌的分离与鉴定_秦倩.pdf

江西农业学报 2023，35（01）：109115ActaAgriculturaeJiangxiDOI:10.19386/ki.jxnyxb.2023.01.018枳壳溃疡病致病菌的分离与鉴定秦 倩，董燕婧，刘红宁，田 磊，张寿文*（江西中医药大学 中药资源与民族药研究中心，江西 南昌 330004）摘 要:以不同种植基地的枳壳溃疡病叶片为供试材料，采用平板划线法对病原菌进行分离，按照柯赫氏鉴定法则对分离的病菌进行致病性鉴定，通过形态学和16S rDNA序列分析，鉴定枳壳溃疡病致病菌的种类。结果表明：从溃疡病症状的枳壳叶片中共分离得到31株细菌，其中XG7、XGZ1、XGZ2、XGZ3、XGZ8、SH9、SH10、YC1、ZS1等9株为枳壳溃疡病致病菌，菌株类型鉴定为地毯草黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas citri pv.citri)，为枳壳溃疡病病原菌的首次报道。研究结果可为研究枳壳溃疡病的发生规律和精准防治提供科学依据。关键词:枳壳；溃疡病；病原菌；分离；鉴定 中图分类号：S435.671 文献标志码：A 文章编号：1001-8581（2023）01-0109-07 Isolation and Identification of Fructus aurantii Canker Pathogens QINQian,DONGYan-jing,LIUHong-ning,TIANLei,ZHANGShou-wen*（JiangxiUniversityofChineseMedicine,ResearchCenterforTraditionalChineseMedicineResourcesandEthnicMedicine,Nanchang330004,China）Abstract:Inthisexperiment,theleaveswithFructus aurantiicankerwhichwerecollectedfromdifferentplantingbaseswereusedasmaterials,andthepathogenicbacteriawasseparatedbystreakplatemethod.ThepathogenicityoftheseparatedbacteriawasidentifiedaccordingtoKoch sidentificationrule.ThepathogenicbacteriatypesofFructus aurantiicankerwereidentifiedbymorphologicalobservationand16SrDNAsequenceanalysis,and31bacterialstrainswereseparatedfromFructus aurantiileaveswithcankersymptoms,ofwhich9strainsXG7,XGZ1,XGZ2,XGZ3,XGZ8,SH9,SH10,YC1andZS1werethemainpathogensofFructus aurantiicanker,and9strainswereidentifiedasXanthomonas citripv.citri,whichwasreportedforthefirsttimeinFructus aurantiicanker.ThestudycanprovidescientificbasisforoccurrenceandprecisecontrolofFructus aurantiicanker.Key words:Fructus aurantii;Canker;Pathogen;Isolation;Identification枳壳为芸香科柑橘属植物酸橙(Citrus aura-ntium L.)及其栽培变种的干燥未成熟果实1，为江西“赣十味”药材之一。随着枳壳种植规模的不断扩大，枳壳溃疡病的发生也日益严重，该病具有传播速度快、防治较困难的特点，严重影响了枳壳药材的品质和产量2-3。柑橘溃疡病是由黄单胞杆菌属黄单胞菌柑橘致病变种(Xanthomonas citripv.citri)引起的致病力强、蔓延广泛的细菌性病害，是一种在柑橘类植物上重点检疫的病害4-8。目前已发现的柑橘溃疡病的致病菌包含A、B、C、D、E等5个菌系，其中致病力最强的A菌系主要分布于亚洲，柑橘属的多个品种都能被其侵染，其中我国南方柑橘产区的病株基本属于毒力较强的A型菌系6,9-10。国内外有关柑橘溃疡病致病菌的分离、鉴定报道较多。从不同产地、不同品种的柑橘属植物中分离出溃疡病致病菌11-16，通过形态、生理生化特性、致病性等方面的系统研究，发现大部分病害均是由柑橘溃疡病(Xcc)引起17-21。目前，针对枳壳溃疡病的分离、鉴定暂无系统性的研究。本研究以不同种植基地的枳壳溃疡病叶片为供试材料，采用平板划线法对病原菌进行分离，根据柯赫氏鉴定法则收稿日期：2022-06-01基金项目：国家重点研发计划（2017YFC1700903）；江西省现代农业产业技术体系建设专项（JXARS-11）。作者简介：秦倩（1995），女，甘肃天水人，博士研究生，研究方向为中药资源开发与利用。*通信作者：张寿文。江 西 农 业 学 报35 卷110对分离的病菌进行致病性鉴定，通过形态学和16SrDNA序列分析，探明江西地区枳壳溃疡病的致病菌类型，以期为枳壳溃疡病的综合防治研究提供理论依据。1 材料与方法1.1 试验材料、试剂与仪器于2020年67月在江西新干、峡江、鄱阳、宜春、樟树等7个不同的种植基地采集具有典型溃疡病症状的枳壳叶片，共收集到39份溃疡病叶片（表1）；在新干枳壳种植基地采集健康的枳壳植株，将其移栽于江西中医药大学实验室备用。表1 枳壳溃疡病病菌样品表样品编号采集地点地理位置采集日期PY1PY4鄱阳县元宝山种植公司116.70487E，29.49568N2020/06/01XG1XG9新干县商州枳壳种植基地115.47262E，27.71126N2020/06/050XGZ1XGZ10新干县厚城枳壳种植基地/2020/06/05SH1SH10新干县三湖乡枳壳基地115.41936E，27.94387N2020/06/06XJ1、XJ2峡江玉峡药业115.29902E，27.55482N2020/06/06YC1、YC2宜春茂悦农业枳壳基地/2020/07/28ZS1、ZS2樟树枳壳基地/2020/07/28本试验使用的培养基NA：胰蛋白胨5g/L、牛肉提取物3g/L、琼脂15g/L；培养基LB：胰蛋白胨10g/L、酵母浸膏5g/L、氯化钠5g/L。主要使用的试剂和仪器包括：TaqPlusDNA聚合酶、PCR扩增引物（购自生工生物公司）；6DNALoadingDye（购自ThermoFisher公司）；Verity96-WellPCR仪（购自美国ABI公司）；FR-980A凝胶成像仪（购自上海复日科技有限公司）；测序仪，SMA4000UV-VisSpectropHotometer（购自Merinton公司）。1.2 研究方法1.2.1 枳壳溃疡病田间危害症状调查 通过调查枳壳溃疡病的田间发病程度，记录病害叶片的采集时间、地点和病叶症状，同时对具有典型溃疡病的枳壳叶片进行拍照，密封保湿条件下带回实验室保存备用22。1.2.2 病原菌的分离纯化 采用平板划线法对病原菌进行分离23。使用清水冲洗具有典型溃疡病症状的枳壳叶片，置于超净工作台，在病健交界处取下小块病组织，用75%乙醇表面消毒30s，置于0.1%HgCl溶液中消毒35min，然后使用无菌水冲洗3次，以冲洗第三次的无菌水平板划线为对照，每组重复3次。在完全消毒的病斑组织中添加适量无菌水并研碎，取浸出液在NA平板培养基上划线，在28条件下培养形成单个菌落24。选择典型的单个菌落，接于NA培养基上纯化。剩余研磨液转移至LB培养基中，在28条件下富集培养48h，平板划线分离，继续培养24d。挑取单菌落纯化23次后，保存备用。已纯化的菌株置于1.0mLLB液体培养基的菌种保存管中，在28、180r/min下震荡培养24h后，取相同体积的30%无菌甘油加入保存管中，标记编号和时间，置于-80冰箱中保存。1.2.3 病原菌的致病性检测 将分离得到的病菌按照柯赫氏法则进行回接验证，分离得到的病原细菌接种到健康枳壳叶片上，在适宜的温度和湿度下培养一段时间后，观察其叶片是否产生与田间相似的病害症状22。1.2.3.1 菌悬液的制备 将分离纯化得到的菌株在NA平板培养基上划线，于28恒温箱中培养2448h，挑取单株菌落到LB液体培养基中，在28、150r/min条件下振荡培养1624h，使用无菌水稀释菌液浓度至1108CFU/mL，置于4冰箱内保存备用。1.2.3.2 离体叶片针刺接种 接种用的枳壳叶片均采自江西中医药大学的实验室盆栽。基于李云峰等25的离体接种方法进行改进，然后开展试验。根据叶片面积大小用注射器在主脉两侧各针刺35个为1组的针刺孔，每个叶片至少设置2组平行针刺孔，试验组每孔接种100 L菌悬液，然后将叶片置于3层无菌滤纸保湿的培养皿内，以无菌水作为阴性对照，均置于28恒温箱内培养。接种后每天检查叶片的发病情况，记录发病率与开始显症时间26。试验过程中及时补充培养皿中的水分，以保证培养皿内部的湿度。1.2.3.3 接种病原菌的再分离 对接种离体叶片具1 期111秦倩等：枳壳溃疡病致病菌的分离与鉴定有致病性的菌株，在NA培养基上进行再分离，将得到的分离物和原始接种菌株进行菌落形态特征的比较，并初步判断回接分离到的菌株和原始菌株是否属于同一种病原菌，完成柯赫氏法则23。1.2.4 病原菌的形态学观察1.2.4.1 病原菌的菌落形态观察 将纯化的病原菌在NA培养基上活化，培养2448h后观察菌落的形态特征，包括菌落的形状、大小、颜色、光泽以及菌落表面是否隆起或凹陷、菌落边缘的形状、透明度和粘度、培养基颜色的变化等22。1.2.4.2 病原菌的革兰氏染色 参照方中达23细菌革兰氏染色方法对病原菌进行染色并观察。1.2.5 病原菌分子生物学鉴定 将病原菌接种至NA培养基上，待长出单个菌落后，使用试剂盒提取病原菌基因组的DNA，利用细菌通用引物27F(AGTTTGATCMTGGCTCAG)/1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)对病原菌16SrDNA区进行PCR扩增27。PCR反应体系(50 L)：模板DNA(2050ng/L)12 L，27F/1492R引物（10 mol）各2L，dNTP(mix)2 L，TaqBuffer5 L，Taq酶0.5L，加ddH2O至50L。PCR反应条件：95 下处理35min；94下处理30s，5560下处理2530s，72下处理3050s，35个循环；最后72处理58min。待PCR反应完成后，用1琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，于凝胶成像仪下观察目的条带。测序工作委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。将测序结果与GenBank中的已知序列进行Blast比对，并提交GenBank获得登录号28。2 结果与分析2.1 枳壳溃疡病田间病害症状2020年67月上旬在江西新干、三湖、峡江、樟树、宜春等枳壳种植地对发病严重的枳壳溃疡病进行田间观察，发现溃疡病主要侵染枳壳的叶片和果实。从图1中可以看出，枳壳溃疡病的危害症状主要表现为：发病初期，叶片出现黄色针头大小的油渍状半斑点，随着时间的变化向周围扩散并凸起，成为近圆形、淡黄褐色病斑；发病中期，病斑处表皮破裂，隆起更严重，逐渐木栓化，表面粗糙，周围有黄色晕圈出现；发病后期，病斑中央呈火山状裂口凹陷，病斑联合形成不规则的大病斑。abca：发病初期；b：发病中期；c：发病晚期。图1 枳壳溃疡病田间病害症状2.2 枳壳溃疡病的分离与纯化通过对患有枳壳溃疡病的叶片进行分离（图2）及纯化（图3），共获得31株菌株，所有菌株在NA培养基上第1天生长较少，第2天开始大量生长，形成明显菌落。其中8株来自江西新干县商洲枳壳基地，6株来自新干县厚城枳壳基地，2株来峡江枳壳基地，7株来自三湖枳壳基地，4株来自鄱阳，2株来自樟树，2株来自宜春茂悦农业枳壳基地。有菌株在NA培养基上第1天生长较少，第2天开始大量生长，形成明显的菌落。2.3 枳壳溃疡病致病性检测叶片通过刺伤接种进行致病性检测，菌株XG7、XGZ1、XGZ2、XGZ3、XGZ8、SH9、SH10、YC1、ZS1接种7d后，接种部位均出现了明显溃疡病症状，在叶片表皮组织可以观察到黄色病斑（图4a）；随着接种时间的延长，14d后接种部位病斑面积逐渐扩大并蔓延，病斑中间逐渐木栓化（图4b）；接种21d后叶片变枯，接种部位病斑从黄色江 西 农 业 学 报35 卷112变成褐色，病斑突起明显（图4c）；其余菌株与对照组并未表现出明显症状（图4d图4f）。从发病枳壳叶片上均能再分离出与初接菌株相同的分离物（图5），确定为枳壳溃疡病的致病菌。aba：实验组；b：对照组。图2 枳壳溃疡病病原菌的分离图3 枳壳溃疡病病原菌的纯化abcdefa、b、c：接种致病菌7、14、21d后叶片的发病症状；d、e、f：接种无菌水7、14、21d后叶片的发病症状。图4 枳壳溃疡病致病性测定结果2.4 病原菌的形态学观察将分离的枳壳溃疡病致病菌在NA培养基上进行活化，28培养2448h后进行微观形态（图6a）和培养性状（图6b）的观察。枳壳溃疡病致病菌呈短杆状，革兰氏阴性菌，其在NA平板上生长，菌落为黄色，近圆形，中间凸起，边缘光滑，较粘稠。aba：接种前病原菌形态；b：接种后病原菌形态。图5 发病组织病原菌再分离2.5 枳壳溃疡病病原菌16S rDNA鉴定以9个菌株基因组DNA为模板，利用细菌通用引物27F/1492R对9株菌株进行16SrDNA序列的PCR进行扩增，1.0%凝胶电泳后，得到大小约为1500bp的特异性片段，片段大小与预测相符（图7）。将目的片段送样测序，结果表明9个菌株的DNA片段大小基本一致，均为1500bp左右，且序列也基本一致。选取致病菌XG7菌株的16SrDNA序列（图8）递交至GenBank数据库中，获得登录号MK382439.1。在GenBank中进行blast搜索，发现待鉴定的16SrDNA序列MK382439.1与GenBanK种地毯草黄单胞菌柑桔致病菌多个菌株对应序列(CP060470.1、CP060446.1、CP060453.1)的 同 源 性为100%。基于16SrDNA序列，构建地毯草黄单胞1 期113秦倩等：枳壳溃疡病致病菌的分离与鉴定菌种内系统发育树（图9）。发育树清晰显示待鉴定菌株的序列与地毯草黄单胞菌柑桔致病变种菌株的对应序列聚集在同一个分支上，且有较高的支持率。根据以上同源性比较与系统发育树分析，得出待鉴定菌株应属于地毯草黄单胞菌柑橘致病变种(Xanthomonas citri pv.citri)。ab图6 枳壳溃疡病致病菌的微观形态和培养性状100-3000bpLadder-K1.7%Acarosebp30002000150012001000900800700600500400300200100图7 枳壳溃疡病致病菌株的PCR电泳图TGGCTCAGAGTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACAGTAAGAGCTTGCTCTTATGGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGGAATACATCGGAATCTACTCTTTCGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAATACCGCATACGACCTACGGGTGAAAGCGGAGGACCTTCGGGCTTCGCGCGGTTGAATGAGCCGATGTCGGATTAGCTAGTTGGCGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGGGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCCCTTTTGTTGGGAAAGAAAAGCAGTCGGTTAATACCCGATTGTTCTGACGGTACCCAAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTGGTTTAAGTCTGTTGTGAAAGCCCTGGGCTCAACCTGGGAATTGCAGTGGATACTGGGTCACTAGAGTGTGGTAGAGGGTAGCGGAATTCCCGGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATCGGGAGGAACATCCGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGACCAACACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGTGCAATTTGGCACGCAGTATCGAAGCTAACGCGTTAAGTTCGCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACGGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAAGGAGACCGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTACTACAATGGTAGGGACAGAGGGCTGCAAACCCGCGAGGGCAAGCCAATCCCAGAAACCCTATCTCAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGAAGCAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTGCCACGGTGTGGCCGATGACTGGGGTGAAGTCT图8 菌株Xg7 16SrDNA基因序列江 西 农 业 学 报35 卷114图9 菌株Xg7基于16 S rDNA基因序列构建的系统发育树3 结论与讨论柑橘溃疡病最明显的症状是具有典型的火山口状的病斑，严重危害枳壳的叶片、果实等部位，本研究对具有典型症状的溃疡病叶片进行反复分离，部分分离得到溃疡病菌，推测未分离到溃疡病菌的样品可能是由于剪取的病斑组织木栓化严重，导致很难分离得到病菌。因此，在取材的时候应选择没有木栓化的组织进行病原菌的分离。本试验从江西7个枳壳种植基地采集到39份枳壳溃疡病样品，通过对叶片病菌的分离和纯化，共获得31株菌株，通过对这些菌株进行致病性检测，结果表明：XG7、XGZ1、XGZ2、XGZ3、XGZ8、SH9、SH10、YC1、ZS1等9株菌株对枳壳健康叶片具有致病性。结合菌株形态学特征和相关文献，通过16SrDNA全序列分析构建系统发育树等技术，首次将病原菌XG7鉴定为地毯草黄单胞菌柑橘致病变种(Xanthomonas citri pv.citri)，明确了引起江西地区枳壳溃疡病的致病菌类型是柑橘溃疡病，研究结果为枳壳溃疡病的发生规律、致病机理和综合防治等研究奠定了理论基础。参考文献：1 国家药典委员会.中华人民共和国药典 M.北京:中国医药科技出版社,2020.2 黄开航.防治柑橘溃疡病问题的思考 J.热带农业工程,2019,43(3):97-99.3 张璟,费长亮,张卫东,等.阳新县柑桔溃疡病的发病原因与防控技术 J.湖北植保,2019(2):46-48.4 范桂萍,普群,李钊,等.玉溪市柑橘溃疡病的发生与防控 J.中国热带农业,2019(4):40-42,34.5 潘贞珍,黄运鹏,黄桂香,等.3个柑橘品种叶片结构和生化物质与柑橘溃疡病抗性的相关性研究 J.中国果树,2020(4):31-36.6 EbrahimiZ,RezaeiR,Masoumi-AslA,etal.VariationintheaggressivenessofXanthomonas citri subsp.citripathotypesAandA*onthreeCitrus species,andepiphyticgrowthonsomecitrusweeds J.CropandPastureScience,2020,71(3):260-267.7 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