不同菌株果糖基转移酶的活性鉴定与分析.pdf

叶现代农业科技曳圆园园9年第18期果糖基转移酶一般属于内切酶袁能催化蔗糖水解为葡萄糖和果糖袁并通过转果糖基作用形成低聚果糖遥该酶广泛存在于高等植物和微生物中袁能产生该酶的植物有洋葱尧芦笋尧大麦尧香蕉尧甜菜尧莴苣尧菊苣等曰但工业化生产所用的果糖基转移酶大多来自于微生物遥1982年袁Gupta等1从Fusarium oxysporum纯化出果糖基转移酶袁并研究低聚果糖的生物合成机遥1989年袁Hirayama等2纯化出Aspergillus niger渊黑曲酶冤的果糖基转移酶出袁并研究酶的特性遥1991年袁Balken等3从Aspergillus PHoenicis中获得高活性的果糖基转移酶袁其低聚果糖产率为60%遥1996年袁台糖研究所4报道了2株日本曲霉Aspergillus japonicus TIT 90076和TITIKJ1中果糖基转移酶的酶反应动力学和产酶的最适条件遥1997年袁Euzenat等5报道1株枯草杆菌Bacillus subtilis的蔗果聚糖酶渊leavansucrase冤在产生菊糖的同时还能生成低聚果糖曰但与黑曲霉产生的低聚果糖有所不同袁其主要成分是蔗果三糖遥其他有关微生物产果糖基转移酶的报道中袁以枯草芽孢杆菌NCIMB 11871的果糖基转移酶基因研究最为详细袁该酶能特异连接琢1寅2糖苷键袁但该菌株是专利菌种袁在国内使用将受到很多限制6遥本研究主要通过各菌种的培养袁以求获得能特异连接琢1寅2糖苷键的果糖基转移酶的菌种袁为后期功能性低聚糖的应用研究打下基础遥1材料与方法1.1试验材料所用菌种主要有枯草芽胞杆菌尧巨大芽胞杆菌尧产气杆菌尧黑曲霉尧青霉尧米曲霉尧霉菌和四联杆菌袁为本实验室保存和分离遥蔗糖尧葡萄糖尧果糖尧蔗果三糖标样渊纯度 99.9%冤购于Sigma公司袁其他试剂为分析纯遥1.2培养基的配置所用培养基有查氏培养基尧LB培养基尧麸皮培养基和塔莱氏培养基袁配方参考相应文献7-9遥黑曲霉用查氏培养基袁枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌用塔莱氏培养基袁米曲霉用麸皮培养基袁其他用LB培养基遥1.3菌种的培养和粗酶液的制备将菌种接种到相应的固体培养基上袁培养后挑取单菌落与相应液体培养基中培养遥收集菌悬液冰浴30min袁在4益条件下袁10 000rpm离心20min袁收集上清液和细胞遥将菌体细胞置于柠檬酸-磷酸缓冲液中洗涤后袁进行后续的超声波破碎遥经超声波破碎后袁在4益条件下袁10 000rpm条件下离心20min袁收集上清液袁即为胞内粗酶液遥将粗酶液用超滤膜孔径为30KD的超滤杯袁在氮气保护条件下冰浴进行超滤遥滤后酶液在-40益下预冻12h袁之后经冷冻干燥机处理制得干粉状粗酶袁在4益条件下保存备用遥1.4酶促反应取8支试管分别加入2.7g 60%蔗糖溶液尧0.3g粗酶液袁加入后立即置于不同温度水浴中反应24h遥各反应温度如下袁枯草杆菌尧巨大芽孢杆菌和霉状杆菌院温度40益袁pH值6.2曰四联杆菌院温度50益袁pH值6.8曰产气杆菌院温度40益袁pH值6.8曰黑曲霉院温度30益袁pH值6.2曰青酶院温度30益袁pH值6.2曰米曲霉院温度40益袁pH=5.5遥反应结束后再置于沸水浴中灭活10min袁冷却遥所有反应均为磷酸盐-柠檬酸缓冲液遥1.5HPLC分析检测仪器院Waters 1525 Binary HPLC pump袁Waters 2424ELS Detector遥分析条件院色谱柱为Waters Carbohydrate柱渊4.6伊250mm冤袁流动相为乙腈-水渊75院25冤袁流速1.0mL/min袁进样量15滋L袁柱温30益袁分析时间40min袁对照品分析为Sigma公司的标准品遥2结果与分析各菌株的粗酶液催化蔗糖反应通过HPLC的检测结果见图19袁对比标准样品HPLC结果袁从每个样品组分的保留时间上可以鉴定每种酶的催化反应的情况遥结果发现院米曲霉的粗酶液催化蔗糖形成蔗果三糖的效果最好袁其次是黑曲霉尧枯草芽孢杆菌尧巨大芽孢杆菌和产气杆菌曰而青霉摘要通过高效液相色谱仪渊HPLC冤分析不同菌种粗酶液对蔗糖的催化反应袁获得了6种产果糖基转移酶的菌种袁为后期果糖基转移酶的应用打下基础遥关键词果糖基转移酶曰催化反应曰HPLC中图分类号Q555.4文献标识码A文章编号1007-5739渊2009冤18-0332-02Activity Identification and Analysis of Fructosyltransferase from Different StrainsCHEN Li-pingHAN Ya-weiMAO Duo-bin*GUAN Li-hongCHEN Yong-sen渊Zhengzhou Universtiy of Light Industry袁Zhengzhou Hennan 450002冤AbstractCrude enzymes catalyzing sucrose were analyzed by high performance liquid chromatography 渊HPLC冤 from the different strains遥Theresults revealed that strains expressing fructosyltransferase were obtained in this study袁which would lay the foundation for the application offructosyltransferase遥Key wordsFructosyltransferase曰catalyzing reaction曰HPLC不同菌株果糖基转移酶的活性鉴定与分析陈利平韩亚伟毛多斌*管丽红陈永森渊郑州轻工业学院袁河南郑州 450002冤基金项目国家自然科学基金项目渊No院20676127冤曰郑州轻工业学院重点基金项目渊XYYJJ02冤遥作者简介陈利平渊1972-冤袁女袁河南永城人袁讲师袁从事酶功能分析及其应用研究工作遥*通讯作者收稿日期2009-08-25农业基础科学332叶现代农业科技曳圆园园9年第18期50 000mAU200 000300 00017.520.015.012.510.07.55.0时间椅min25.022.5350 000250 000100 000150 000图8青霉菌的HPLC分析和霉状杆菌没有表现出任何转果糖基的活性遥因此袁本试验共获得6种产果糖基转移酶的菌种遥渊下转第339页冤FructoseGlucose60 0001-KestoseSucrosemAU40 00080 000100 000120 00017.520.015.012.510.07.55.0时间椅min图1标样的HPLC分析120 000mAU60 000180 000240 000300 00017.520.015.012.510.07.55.0时间椅min25.022.5图2枯草芽孢杆菌的HPLC分析200 000mAU100 000300 000400 000500 00017.520.015.012.510.07.55.0时间椅min25.022.50图3四联杆菌的HPLC分析120 000mAU60 000180 000240 000300 00017.520.015.012.510.07.55.0时间椅min25.022.5图4巨大芽孢杆菌的HPLC分析120 000mAU60 000180 000240 000300 00017.520.015.012.510.07.55.0时间椅min25.022.5图5产气杆菌的HPLC分析120 000mAU60 000180 000240 000300 00017.520.015.012.510.07.55.0时间椅min25.022.5图6霉状杆菌的HPLC分析120 000mAU60 000180 000240 000300 00017.520.015.012.510.07.55.0时间椅min25.022.5图7米曲霉菌的HPLC分析农业基础科学333叶现代农业科技曳圆园园9年第18期渊上接第335页冤报袁1995袁12渊2冤院133原135.21 邵展袁刘春安.胃粘膜病变M.北京院中国科学技术出版社袁1992.22 RODERICKPJ袁WILKESHC袁MEADET W.Thegastrointestinalto-xicity of aspirin院an overview of randomised controlled trailsJ.Br J ClinPharmacol袁1993渊35冤院219-226.50 000mAU200 000300 00017.520.015.012.510.07.55.0时间椅min25.022.5250 000100 000150 000图9黑曲霉菌的HPLC分析3讨论果糖基转移酶的一个最大特点就是在低浓度蔗糖时能水解蔗糖袁形成果糖和葡萄糖曰在高浓度时又能把分解的果糖转移到蔗糖上袁形成蔗果三糖10遥因此袁在本试验中以果糖尧葡萄糖尧蔗果三糖和蔗糖作为标准对照遥从结果中可以清晰看出只要有蔗果三糖存在袁果糖的含量都会相对偏少袁唯有枯草芽孢杆菌的果糖偏高袁具体原因还需要进一步分析遥试验所用的都是菌体的粗酶液袁因此对反应的催化效率可能有一定影响袁如果能通过纯化袁其效果会更好遥总之袁通过本试验获得了6种产果糖基转移酶的菌株袁为后期果糖基转移酶的应用研究打下了基础遥4参考文献1 GUPTA AK袁NAGPAL B袁KAUR N.Glucofructosan biosynthesis inFusarium oxysporum:regulation and substrate specificity of fructosyltransferase and invertaseJ.Phytochemistry袁1982渊21冤院1249-1253.2 HIRAYAMA M袁SUMI N袁HIDAKA H袁et al.Purification properties of afructooligosaccharides-producing 茁-fructofuranosidase from AspergillusnigerATCC20611J.Agriculturalandbiologicalchemistry袁1989渊53冤院667-673.3 VAN BALKEN JAM袁VAN DOOREN TH JGM袁VAN DEN TWEELWJJ袁et al.Production of lkestose with intact mycelium of Aspergillusphoenicis containing sucrose-1-fructosyltransferase J.Applied Microbi-ology and Biotechnology袁1991渊35冤院216-221.4 WENCHANG CH.茁-fructofuranosidase production by Aspergillus jap-onicus in shaking batch cultures as affected by initial sucrose concentrationJ.Biotechnology Letters袁1996渊18冤院69-72.5 EUZENAT O袁GUIBERT A袁COMBES D.Production of fructo-oligosaccharidesbylevansucrasefromBacillussubtilisC4 J.ProcessBioch-emistry袁1997渊32冤院237-243.6 SEIBEL J袁MORARU R袁G魻TZE S袁et al.Synthesis of sucrose analoguesand the mechanism of action of Bacillus subtilis fructosyltransferase 渊leva-nsucrase冤J.Carbohydrate Research袁2006袁341院2335-2349.7 SAMBROOK J袁FRITSCH EF袁MANIATIS T.Molecular Cloning院ALaboratory Manual袁ThirdM.New York院Cold Spring Harbor Labora-tory Press袁1989.8CHEETHAMPSJ袁HACKINGAJ袁VLITOS M.Synthesisofnoveldisacc-harides by a newly isolated fructosyltransferase from Bacillus subtilisJ.Enzyme and Microbial Technology袁1989渊11冤院212-219.9 唐江涛袁覃益民袁杨梅袁等.米曲霉 GX0015茁-果糖基转移酶分离纯化及酶学性质研究J.食品与生物袁2007渊10冤院7-810 LI HJ袁YANG AF袁ZHANG XC袁et al.Improving freezing tolerance oftransgenic tobacco expressingsucrose:sucrose1-fructosyl transferase genefrom Lactuca sativaJ.Plant Cell Tissue and Organ Culture袁2007渊89冤院37-48.渊上接第333页冤身的生存所应履行的道德义务与责任遥合理调节与控制人类自身的生产与再生产袁使人与自然真正公平相处袁这是维护生态平衡的基本要求遥2.3加强生态法制教育保护自然环境袁建设生态文明袁不仅需要人类的道德袁更需要社会法制的保障遥目前袁为了保护生态环境袁人类开始制订世界性的环境保护公约遥如联合国于1993年成立了可持续发展委员会袁审议叶21世纪议程曳在全球的执行情况袁目前有80多个国家向联合国可持续发展委员会提交了执行叶21世纪议程曳的国家报告遥与此同时袁不同国家也根据各自的自然环境和社会发展状况袁制定了各种独具特色的环境保护纲要和法规遥目前袁环境法学已成为人们研究的一个新领域遥生态法制教育的根本宗旨是袁让人们了解各种保护自然尧保护环境的法规与条例袁从而能更加自觉地遵循自然生态法则遥3按照自然规律谋发展建立生态文明袁就必须在发展经济的过程中尊重自然袁按照自然规律来办事袁改变生活方式袁倡导绿色消费袁走可持续发展和可持续消费的道路曰必须在全社会培养环境保护意识和道德袁建立和完善生态保护制度袁形成善待自然袁爱护自然袁保护自然的社会风尚遥只有人与自然和谐袁才能给人类带来福祉曰否则袁就只能给人类带来灾难与贫穷遥要把生态文明观贯穿到物质文明尧精神文明和政治文明的建设中去袁推进社会走上生产发展尧生活富裕尧生态良好的文明发展道路遥4结语建立人与自然和谐发展的生态文明袁是一种崇高的社会理想袁实现这种理想需要人们在生产方式尧生活习惯尧思想观念等方面进行变革尧创新袁这是一项艰巨尧持久的挑战性工作遥在新世纪袁要把这种理想作为指引经济社会发展的灯塔袁积极探索袁大胆实践袁不断推陈出新袁实现人类社会文明发展的新飞跃遥当代生态文明理念的产生袁不仅引起人们自然观的新变化袁也引起社会尧政治尧经济等方面观念的变化遥党野十七冶大提出的生态文明袁建立在物质文明尧精神文明和政治文明三大文明基础之上遥因此袁生态文明将成为越来越多人的共识袁并正在从理论形态向实践形态迅速转化遥5参考文献1 李景源袁杨通进袁余涌.论生态文明N.光明日报袁2004-04-30渊A1冤.2 杨多贵袁周志田.我国人与自然和谐发展面临的挑战及其战略选择J.上海经济研究袁2005渊4冤院22-24.3 陈敏豪.归程何处要生态史观话文明M.北京院中国林业出版社袁2002.4 杜艳袁刘强.落实科学发展观袁建设生态文明村J.内蒙古农业科技袁2009渊1冤院7-8.农业基础科学339