产κ-卡拉胶酶菌株的筛选及其发酵条件的优化.pdf

第2 4 卷第l 期2009 年2 月大连水产学院学报J O U R N A LO FD A L I A NF I S H E R I E SU N I V E R S I T YV 0 1 2 4N o 1F e b 2 0 0 9文章编号：1 0 0 0 9 9 5 7(2 0 0 9)0 1-0 0 2 4 0 6产K 一卡拉胶酶菌株的筛选及其发酵条件的优化李俊，马悦欣，冯兵，于杨(大连水产学院农业部海洋水产增养殖学重点开放实验室，辽宁大连1 1 6 0 2 3)摘要：对K 一卡拉胶酶产生菌进行富集培养，以K 一卡拉胶为唯一碳源的平板初筛，从多种海藻上分离纯化获得3 2 株具有卡拉胶酶活性的菌株，经摇瓶复筛，从亮管藻上分离的H C 4 菌株酶活力最高，为5 0 7 5U m L。测定了H C 4 菌株的1 6 Sr R N A 基因序列1 4 3 6b p，在核苷酸序列数据库(N C B I)中进行同源性检索，发现它与T a m l a n aa g a r i v o r a n s 的相似性为9 8。通过单因子筛选和正交试验，确定该菌株产酶的最佳培养基组成为：碳源K 一卡拉胶5g L；氮源蛋白胨3g L 和N a N 0 31g L；无机盐N a C I2 0g L、l(2 H P 0 4 3 H 2 01g,L、M g S 0 4 7 H 2 00 5g L 和C a C l 20 1g L。最佳培养条件为：摇床转速1 5 0r r a i n，2 5 0m L 三角瓶中发酵培养基的装液量5 0m L，接种量4，发酵培养基起始p H7 5，温度2 8，培养时间2 8h。经培养基组成及培养条件优化后，H C 4 菌株的K 一卡拉胶酶酶活力提高到6 0 2 3 0U m L，是优化前的1 1 8 7 倍。关键词：卡拉胶酶产生菌；筛选；发酵条件；优化中图分类号：Q 9 3 9 9文献标志码：A卡拉胶是某些红藻种类的细胞壁多糖。依据其结构，可将卡拉胶分为K 一、入一、。一卡拉胶等。K 一卡拉胶是由1，3 一连接的B D 一半乳糖4 一O一硫酸基和l，4 连接的3，6 内醚一q D 一半乳吡喃糖交替连接的半乳匀多糖。目前已从假单胞菌属P s e u d o m o n a s q 1、噬纤维菌属C y t o p h a g a 4-6 1、弧菌属V b r o【7 1 中发现K 一卡拉胶酶。K 一卡拉胶酶是一种有用的工具酶，能水解K 一卡拉胶的B l，4 糖苷键产生一系列同源偶数寡糖，可用于红藻细胞壁结构的分析和原生质体的分离。已有研究表明，卡拉胶和卡拉胶的降解产物具有抗肿瘤、抗病毒等多种生物学活性【8-1 1 。有关K 一卡拉胶酶产生菌株的培养条件优化国内外报道较少”】。作者从亮管藻体上筛选出一株卡拉胶酶活力较高的H C 4 菌株，并对其产酶培养基和培养条件进行了优化，使其产酶能力有很大提高。1 材料与方法1 1 培养基的组成各种培养基的组成见表l。无机盐母液的配方为：K 2 H P 0 4 3 H 2 01 0g L，M g S 0 4 7 H 2 05g L，F e P 0 4-4 H 2 00 1g L，C a C l 2 lg L。表1 培养基的组成T a b 1C o m p o n e n t so ft h ec u l t u r em e d i a注：培养基用陈海水配制，p H 为7 5，每种培养基还需添加无机盐母液1 0 0 m L。1 2 菌株的筛选将多种海藻样品进行富集培养，以K 一卡拉胶为唯一碳源的选择性培养基初筛分离K 一卡拉胶降解菌，根据菌落周围透明圈或凹坑的大小初步判断菌种的卡拉胶降解能力，筛选出具有K 一卡拉胶酶活性的菌株。进一步通过摇瓶培养进行复筛，将菌株于斜面培养基上活化2 4h 后，接人种子培养基，振荡培养2 4h 后，以4 接种量接入装有5 0m L 复筛培养基的2 5 0m L 三角瓶中，于3 2 下以1 5 0r m i n 振荡培养4 8h，检测发酵液的产酶活力。收稿日期：2 0 0 8 0 3 0 7基金项目：大连水产学院农业部海洋水产增养殖学重点开放实验室开放项目(I(2 0 0 6 1 2)作者简介：李俊(1 9 8 1 一)，女，硕士研究生。通信作者：马悦欣(1 9 6 3 一)，女，教授。E m a i l：m a y u e x i n d l h re d u c n 万方数据第1 期李俊，等：产K 一卡拉胶酶菌株的筛选及其发酵条件的优化2 51 3 酶活力的测定发酵液经离心去除菌体后，取上清液与底物反应，根据还原糖的产生判断K 一卡拉胶酶的活力。1 个酶活力单位(U)定义为：在3 2 下，每分钟产生1 蝎还原糖(以半乳糖计)所需要的酶量。1 4H C A 菌株的1 6 Sr R N A 基因序列测定和分析利用引物对F 2 7 和R 1 4 9 2【1 2】对H C A 菌株的1 6 Sr R N A 基因进行P C R 扩增，使用A B I3 7 7D N A测序仪对P C R 扩增产物进行序列测定并双向测通(北京华大基因研究中心)。将所测序列在C,e n B a n k数据库(N C B I)用B L A S T 分析(h t t p：w w w n c b i n l m n i h g o v S L A S T)D 3 。1 5H c 4 菌株产酶条件的优化在发酵培养基基础上进行优化。除特别说明外，以下试验中，H C A 菌株活化、种子培养、发酵条件同复筛。发酵液离心后，取上清液测定K 一卡拉胶酶的活力。前一步优化的条件用于后一步试验中。1 5 1N a C I 浓度对产酶的影响选择不同N a C l浓度(1 0、1 5、2 0、2 5g L)的发酵培养基，确定最佳N a C I 含量。1 5 2 碳源对产酶的影响分别以2g L 的琼胶和褐藻胶作为唯一碳源替换K 一卡拉胶，检测H C A菌株产生卡拉胶酶的能力。于发酵培养基中添加不同含量的K 一卡拉胶(1 5g L)，测定K 一卡拉胶含量对菌株产酶的影响。1 5 3氮源对产酶的影响分别以2g L 的N H 4 N 0 3、K N 0 3、(N H 4)2 S 0 4、N H 4 C I、N a N 0 3、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏为唯一氮源，检测不同氮源对菌株产酶的影响。配制不同蛋白胨含量的发酵培养基(O 5 3 0g L)，检测对菌株产酶的影响。配制以2g L 蛋白胨和2g L 硝酸钠为复合氮源的发酵培养基，检测菌株的产酶能力。1 5 4 无机盐对产酶的影响于发酵培养基中添加单一无机盐和复合无机盐，以不加无机盐为对照组，确定对菌株产酶影响最大的一组无机盐组合。1 5 5 正交试验设计正交试验设计参照工业微生物实验技术手册4 1 进行。在上述单因素的基础上选取K 一卡拉胶、蛋白胨、N a N O，和温度做4因素3 水平的正交试验，每组试验设3 个重复，进行发酵产酶，测定酶活力，确定最佳的培养基组成。1 5 6 培养条件的优化在优化的发酵培养基和培养温度基础上，改变摇瓶转速、接种量、装液量和培养基初始p H，检测其对菌株产酶能力的影响。1 5 7H C 4 菌株生长曲线和产酶曲线的测定取经2 4h 培养的H C 4 菌株的液体种子，以最适接种量接人装有最适装液量的优化产酶培养基的2 5 0m L 三角瓶中，在最适摇瓶转速和温度条件下培养，每隔4h 取样，于6 0 0n m 下比色，根据菌液的浊度来判断菌体的生物量。同时测定菌株发酵液的酶活力。2 结果与讨论2 1K 一卡拉胶降解菌的筛选目前已从海藻上分离获得多种K 一卡拉胶降解菌【6 7 1 5J。本试验中，通过富集培养和初筛，从多种海藻上筛选出3 2 株具有K 一卡拉胶酶活性的菌株，摇瓶复筛结果表明，从海带、江篱、蜈蚣藻和亮管藻分离的L J 7、G L 8、G F 3 和H C A 菌株酶活力较高，分别为3 5 5 4、3 0 2 8、4 6 4 5U m L 和5 0 7 5U m L，经过1 0 代传代培养，发现H C A 菌株产酶比较稳定，且酶活力最高，因此，选择该菌株进行其1 6 Sr R N A 基因序列的测定和分析，并对其产酶条件进行优化。2。2H C 4 菌株的1 6 S r R N A 基因序列测定和分析测定了H C A 菌株的1 6 Sr R N A 基因序列1 4 3 6b p(C,e n B a n k 存取号：E U l 2 7 8 3 0)，在核苷酸序列数据库(N C B I)中进行同源性检索时发现它与T a m l a n aa g a r i v o r a n 匹的相似性为9 8 o2 3H C 4 菌株的培养基和发酵条件的优化2 3 IN a C I 对H C 4 茵株产酶的影响于发酵培养基中添加一定浓度的N a C I 对H C A 菌株产酶有较大的影响。该菌株产酶的适宜N a C I 浓度是2 0g L 左右(图1)。据报道，K 一卡拉胶酶的产生和制备使用的培养基含有2 5 3 0g LN a C I【l 3 1 或是人工海水【6 1；而且人工海水对海洋噬纤维菌C y t o p h a g al kC 7 8 3 产K 一卡拉胶酶是必需的旧J。2。3，2 碳源对H C A 菌株产酶的影响从表2 可见：选择2g L 的K 一卡拉胶、褐藻胶、琼胶为唯一碳源进行试验，其中菌株在以K 一卡拉胶为唯一碳源的发酵培养基中产酶活力最高，为6 2 7 2U m L；改变发酵堵养基中K 一卡拉胶浓度(1 5 万方数据大连水产学院学报第2 4 卷g L)，结合后述的正交试验，其中以K 一卡拉胶含量为5g L 时菌株酶活力最高(8 6 3 0U m L)。但K 一卡拉胶浓度过高反而抑制菌株产酶，原因可能是与培养基的黏度增加有关。不同菌株产K 一卡拉胶酶的适宜K 一卡拉胶浓度范围不同，对食卡拉胶假单胞菌P s e u d o m o n a zc a r r a g e e n o v o r a 来说，最适宜产酶的K 一卡拉胶浓度为0 5 1 0g L，增加培养基中的K 一卡拉胶浓度，会使该细菌K 一卡拉胶酶的活力迅速下降6 J。5】01 52 02 53 0N a C I(g L 4)图lN a C l 浓度对H C A 菌株产K 一卡拉胶酶活力的影响F i g 1E f f e c to fN a C Ic o n c e n t r a t i o no nK c a r r a g-e e n a s ea c t i v i t yi nH C As t r a i n表2 碳源对H C A 菌株产K 一卡拉胶酶活力的影响T a b 2E f f e c to fc A l r b o l l 擘叭I n：e sO l lK f a r r a g n a s ea c l i v i-t yi nH C As t r a i nU m L琼胶A g a r2褐藻酸钠S o d i u ma l#n a z e23 8 0 3 6 4 31 4 1 9 0 6 62 3 3氮源对H C 4 茵株产酶的影响选择8 种不同的氮源对菌株产酶的影响进行试验，结果见表3。从表3 可见：以2g L 蛋白胨为菌株产酶的最适宜氮源，其次是硝酸钠；以2g L 蛋白胨和2g LN a N O，作为复合氮源时，菌株的酶活力明显高于单一氮源。表3 氮源对H C A 菌株产K 一卡拉胶酶活力的影响T a b 3E f f e c to fn i t r o g e n 剐m D 删洛o nK 一嘲n a s ea c-t i v i t yi nH C 4s t r a i nU m L氮源(g L 一1)N it r o g e n8 0 u r t 7 e。K 一卡拉胶酶活力K C a r r a g e e n a s ea c t i v i t y2 3 4 无机盐对H C A 茵株产酶的影响不同种类的无机盐对菌株产酶能力的影响结果见表4。与不加无机盐对照比较，加单一无机盐对菌株产酶没有任何促进作用(未列出数据)，加不同组合的复合无机盐对菌株产酶的影响有较大差异。从表4 可见：在所试验的几组无机盐中，加K 2 H P 0 4 3 H：0+M g S O。7 H 2 0+C a C l 2 组合的无机盐时，菌株的酶活力最高(2 7 8 1 9U m L)，因此可将其作为培养基中的主要无机盐组分。表4 无机盐对H C A 菌株产K 一卡拉胶酶活力的影响T a b 4E f f e c to fi n o r g a n i cs a l t so nK 一唧n a s ea c t i v i t yi nH C As t r a i n加印如如加mAll11uusBcuu眦时毫JY(I1Ef1一杂蜒苗整辊芈。万方数据第1 期李俊，等：产K 一卡拉胶酶菌株的筛选及其发酵条件的优化2 72 3 5 正交试验结果根据单因素试验结果，选择A(K 一卡拉胶)、B(蛋白胨)、C(N a N O，)、D(温度)进行4 因素3 水平的正交试验，结果见表5。从表5 可见，菌株H C A 产酶的较好培养基组成和培养温度为A：B 3 c。D。按照极差大小可以决定4 个因素的主次顺序依次为：温度 K 一卡拉胶 N a N O，蛋白胨。由此可见，温度对产酶影响最大。表5 正交试验设计方案及试验结果T a b 5D e s i g na n dr e s u l t so fo r t h o g o n a lt e s t2 3 6 摇瓶转速对H C 4 菌株产酶的影响摇瓶内溶氧量对菌株产酶有一定的影响，以1 5 0r m i n 发酵培养时，菌株产酶活力最高(图2)。过低的摇瓶转速(1 0 0r m i n)会使发酵液中的溶氧量降低，不利于菌体的生长，从而影响菌体产酶。增加摇瓶转速(1 0 0r m i n-+1 5 0r m i n)可以提高瓶内溶氧量，使菌体利用培养基速度加快，从而有利于K 一卡拉胶酶的产生。超过1 5 0r m i n 时，酶活力略有下降，可能是瓶内的剪切力增大的缘故。i 兽4 0 0己趸杂警3 0 0藿b罐走牛、1 0 0zO摇瓶转速s h a k i n gs p e c d(r m i n )图2 转速对H C 4 菌株产K 一卡拉胶酶活力的影响2E f f e c to fs h a k i n gs p e e do nK c a r r a g e e n a s ea c-t i v i t yi nH c 4s t r a i n2 3 7 接种量对H C 4 菌株产酶的影响一般来说，增大接种量，菌体生长延滞期缩短。因此，在发酵工业上为了缩短生产周期，通常采用较大的接种量。本试验中种子的接种量为4 时，菌株酶活力最高，接种量过小或过大均不利于菌株产酶(图3)。可能是接种量太大，菌体繁殖过快，容易衰老，从而不利于产酶。暑蚤已鼋嚣犟辱Y接种量I n o c u l u mv o l u m e 图3 接种量对H C 4 菌株产K 一卡拉胶酶活力的影响F i g 3E f f e c to fi n o o J l u mv o l u m eo ni g c a r r a g e e n a s ea c t i v i t yi nH C 4s t r a i n2 3 8 装液量对H C A 菌株产酶的影响于2 5 0m L三角烧瓶中加入2 5、5 0、7 5、1 0 0m L 发酵培养基，考察装液量对菌株产酶的影响。结果表明，装液量为5 0m L 时，菌株能产生较高活力的K 一卡拉胶酶(图4)。在摇瓶培养过程中，低装液量导致剪切力增大，因而可能降低菌体的生长速率，限制菌株产酶。OOOOO筋”如笱 万方数据大连水产学院学报第2 4 卷O2 55 07 5I o o1 2 5装液量C u l t u r ev o l u m e m L图4 装液量对H C A 菌株产K 一卡拉胶酶活力的影响F i g,4E f f e c to fc u l t u r ev o l u m eo i lK c a r r a g e e n a s ea c-a v t t yb yH C As t r a i n2 3 9 发酵培养基初始p H 对H C A 菌株产酶的影响培养基的初始p H 强烈影响菌体代谢酶的活性和营养物质的跨膜运输。已发现几种卡拉胶降解菌在培养基p H 为7 8 时产生卡拉胶酶5“J 5 1 7 1。本试验中比较了不同初始p H 的培养基对H C 4 菌株产酶的影响。结果表明，培养基的初始p H 为7 5时，菌体能够旺盛生长并产生较高活力的K 一卡拉胶酶(图5)。2 3 1 0H C A 茵株的生长曲线和产酶曲线利用最适碳源、氮源和无机盐组成的产酶培养基，在最适接种量、装液量、摇瓶转速和温度条件下对H C A 菌株的生长曲线和产酶曲线进行测定。结果表明：菌株生长1 2h 后进入稳定期，而发酵液中的酶活力2 8h 达到最高(6 0 2 3 0U m L)(图6)，即菌株发酵产酶的最高点出现在菌体生长的稳定期之后。食卡拉胶假单胞菌的卡拉胶酶批量生产试验E 蚤已趸饕譬6 06 57 07 58 08 59 0p H图5 起始p H 对H C A 菌株产K 一卡拉胶酶活力的影响D 孚5E f f e c to fi n i t i a lp Ho nK c 8 r r a g e e D a s ea c t i v i t yl nH C As t r a h l中，菌体的生长和产酶也呈现类似的变化规律 1 6 1。细胞浓度在培养3 0 4 0h 时达到高峰，但发酵后期细胞浓度下降，培养基中底物缺乏时，产酶曲线仍会在一段时间内保持上升趋势。本研究中，在优化的产酶培养基和培养条件下，即K 一卡拉胶为5g L、蛋白胨3g L、N a N O，1g L、N a C I2 0g L、K 2 H P 0 4 3 H 2 01g L、M g-S O r 7 H 2 0o 5g L 和C a C l 20 1g L，摇床转速为1 5 0r r a i n、装液量5 0m L、接种量4、发酵培养基起始p H7 5、温度2 8 和培养时间2 8h 时，测定的H C A 菌株发酵液的最高酶活力(6 0 2 3 0U m L)是优化前该菌株酶活力(5 0 7 5U m L)的11 8 7 倍，高于牟海津等【l 副报道的卡拉胶降解菌M 一2 菌株的酶活力。本试验结果为酶的分离纯化及酶解产物的制备提供了依据。培养时间肺善口。胃器暑2一霉酬图6H C A 菌株的生长曲线和产酶曲线F i g,6G r o w t ha n dK-c a r r a g e e n a s ea c t i v i t yi nH C As t r a i n参考文献：1】M c L e a nMw W i l l i a m s o nFB K C a r r a g e e r m s ef r o mP m a o-m o n 4 0 B m 唱钾n o m J E u r o p e a nJ o u r n a l B i o c h e m i s t r y 1 9 7 9。9 3：5 5 3 5 5 8【2】w e i g lJ，g a p h e 砒T h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i so fc a 嗍e e l l l t r lb yOOOO00D枷枷姗姗枷枷啪軎I_譬QsB皇8嚣B毫J譬(：l量n)杂呈l髓甾鼎乎。o5O5O5铊”弱强扫I；譬Q旨cu对蠢JzS暑n)cI=赡髓氆辑牛。万方数据第l 期李俊，等：产K 一卡拉胶酶菌株的筛选及其发酵条件的优化2 9P s e u d o m o n a sm r r a g e e n o v o m：P u r i f i c a t i o no faK c a l T a g e e l l a s e J C a n a d i a nJ o u r n a lo fM i c r o b i o l o g y，1 9 6 6，1 2：9 3 9 9 4 7 K J l 5 b h a l yY。M o d yK。J h aB，竹a 1 S t a t i s t i c a lo p t i n f i z a t i o no f m e Id i u me o r n p o n a n t sf o rK a 帆孵n 丑8 ep r o d u c t i o nb yP s e u d o m o n a s幽，学呦 J】E n z y m ea n dM i c r o b i a lT e c h n o l o g y，2 0 0 7 4 0：8 1 3 8 2 2 S 田w a rG，S a k a t aT，K a h e m o WD T h ep r o d u c t i o na n dc h e m e l e r i s-t i c s0 fc g R r l g g e e r l t a l*f r o mm a r i n eC y t o p h a g a J B u l l e t i no ft h eJ a p a n e s eS o c i e t yo f S c i e n t i f i cF i s h e r i e s，1 9 8 3，4 9：1 6 8 9 1 6 9 4 S a n F a rG，M a t a y o e h iS，O d aH P u r i f i c a t i o no faK a p p a c a 喈e c n 即f r o mI l l l 丑r i l l ec 嘤d i q 萨s p e c i e s J M i c r o b i o l o g ya n dI r a-m u n o l o g y，1 9 8 7。3 1：8 6 9 8 7 7 P o t i nP，S a m e o uA，kG a l lY，e la 1 P u r i f i c a t i o na n dc h a r a e t e r i z a-t i o no f8n e wK a p p a-e,a r r a g e e r m s ef r o mal，l 丑r i n cC y t o p h a g al i k eh e c t e r i u m J E u r o p e a nJ o u r n a lo fB i o c h e m i s t r y，1 9 9 1，2 0 1：2 4 12 4 7 A r a k iT，H a s h i t o m oY，M o r i s h i l aT P u r i f i c a t i o na n dc h a n w t a r i z a-d o no fK c 岫g n a 母ef r o m8m a r i n eb a c t e r i u mV b r o 叩C A-1 0 0 4 J F i s h e r i e sS c i e n c e，1 9 9 9，6 5：9 3 7 9 4 2 H uXK，J i a n gXL，A u b r c eE，e la 1 P 弛p a r a t i o na n di nv i v oa n t i t u m o ga c t i v i t yo f k a p p a a 啪踟o l i g o s a c c h a r l d e s J】，P h i-m a c e u t i c a lB i o l o g y。2 0 0 6，“：6 4 6 6 5 0 M o uHj，J i a n gXL。G u a nHS AK _ c J l l r a g c e i l g i ld e r i v e do l i g o-M c c h a r i d ep r e 删b ye n z y m a t i cd e g r a d a t i o nc o n t a i n i n ga n t i t u m o r a c t i v i t y J J o u r n a lo f A p p l i e dP h y c o i o g y，2 0 0 3，1 5：2 9 7 3 0 3【1 0 N a k a s h i m aH，K i d oY，K o b a y a s h iN，e la 1 P u r i t l e a t i e na n dc h a r-s u z t e r i z a t o no f a c i a nm y e】o b l a s t o s l sa n dh u m a ni m m u n o d d i e i e n c yr i m sr e v e q m et r a n s c r i p t a s ei n h i b i t o r，s u l f a t e dp o l y s a c c h e r i d e se x t r a c t e df r o m 臌a l g a e J A n t i m i c r o b i a lA g e n t sC h e m o-t h e r a p y，1 9 8 7。3 1：1 5 2 4 一1 5 2 8【1 1】Y 枷a d aT，O g a m oA，S a i t oT，d|1 P 呷m t i o ua n da n t i H I Va c t i v i t yo fl o w m o l e c u l a r w e i g h t 锄g，e r sa n dt h e i rd e r i v a-r i v e s J C a r b o h y d r a t eP o l y m e r s，1 9 9 7。3 2：5 1 5 5 1 2 eDJ 1 6 S 2 3 Sr R N As e q u e n c i n g。i nN u c l e i ca c i dT e c h-n i q u e si nB a c t e r i a lS y s t e m a t i e s M S t a e k e b r a n d tE，G o o d f e l l o wM N e wY o r k：J o h nW i l e y S o n s 1 9 9 1：1 1 5 1 7 5 1 3 M t s c h u lSF，G i s hW，M i l l e rW，e la i B a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l J】J o u r n a lo fM o l e e u h rB i o l o g y。1 9 9 0，2 1 5：4 0 3 4 1 0。1 4 诸葛健，王正祥工业微生物实验技术手册 M 北京：中国轻工业出版社，1 9 9 4：6 1 5 6 1 9 1 5 牟海津，江晓路，蒋营，等卡拉胶降解菌M 一2 的筛选与产酶性质 J 中国水产科学，2 0 0 2(3)：2 5 1 2 5 4 1 6 O s t g a m MK，W a n g e nBF，K n u t s e nSH，e ta 1 h 学一i k 曲t l ep r o-d u d i o na n d m r f f l e a t i e no fK a p p a c 跚曙码弘e n 蹴f r o mP s e u d o-m r t a sc a r r a g e e n o v o r af o ra p p l i c a t i o n si ns e a w e e db i o t e c h n o l o g y J E n z y m ea n dM i c r o b i a lT e c h n o l o g y，1 9 9 3，1 5：3 2 6-3 3 3 1 7 Y a p h eW，B a x t e rB T h ee n z y m eh y d r o l y s i so f 伽丽g e 哪蛐 J A p p l i e dM i c r o b i o l o g y，1 9 5 5，3：3 8 0-3 5 3 S c r e e n i n ga n do p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sb yaK-c a r r a g e e n a s ep r o d u c i n gb a c t e r i u mL IJ u n，M AY u e x i n，F E N GB i n g，Y UY a n g(K 吖L a b o r a t o r yo fM a r l c u l t u r e，A g r i c u l t u r eM i n i s t r y，P R C，D a l i a nF i s h e r i e sU n i v e r s i t y，D a l t o n1 1 6 0 2 3，C h i n a)A b s t r a c t：T h es c r e e n i n go faK c a r r a g e c n a s ep r o d u c i n gb a c t e r i u ma n do p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n st oy i e l dah i g h e rp r o d u c t i o no fe x t r a c e l l u l a re n z y m ew e r ec o n d u c t e db ye n r i c h m e n tc u l t u r et e c h n i q u ea n df i r s t-s c r e e n i n gb yK c a r r a g e e n a np l a t ec o n t a i n i n gK c a r r a g e e n a na ss o l es o u r c eo fc a r b o na n de n e r g y At o t a lo f3 2i s o l a t e st h a ta c t i v e l yd e g r a d e dK c a r r a g e e n a nw e r es c r e e n e df r o mv a r i o u ss e a w e e d s S t r a i nH C 4i s o h t e df r o mH y a l o s i p h o n i ac a e s p i t o s as h o w e dt h em a x i m u ma c t i v i t yb ys e c o n d s c r e e n i n go fs h a k i n gc u l t u r e F r a g m e n to f1 4 3 6b ps e q u e n c eo fs t r a i n sH C A1 6 Sr R N Ag e n ew a sa m p l i f i e d，w h i c hs h o w e d9 8 s i m i l a r i t yt oT a m l a n aa g a r i v o r a n sw h e na n a l y z e da tN a t i o n a lC e n t e rf o rB i o t e c h n o l o g yI n f o r m a t i o n(N C B I)d a t a b a s e T h ec u h u r ec o n d i t i o n sf o rt h es t r a i nH C 4w e r es t a n d a r d i z e df o rt h em a x i m a lp r o d u c t i v i t yo ft h ee x t r a c e l l u l a rK c a r r a g e e n a s e T h eo p t i m a lm e d i u mc o r n p o n e n t sd e t e r m i n e db ys i n g l ef a c t o rt e s ta n do r t h o g o n Mt e s tw e r ef o u n da st h ef o l l o w i n g：K c a r r a g e e n a n5g L p e p t o n e3g L，N a N 0 3 lg L，N a C I2 0g L，K 2 H P 0 4 3 H 2 0lg L，M g S 0 4 7 H 2 00 5g L，a n dC a C l 2 0 1g L T h eo p t i m Mc u l t u r ec o n d i t i o nw e r eo b s e r v e da st h ef o l l o w i n g：s h a k i n gs p e e d15 0r r a i n 5 0m Lm e d i u mi n2 5 0m LE r l e n m e y e rf l a s k，i n o c u l u mv o l u m e4，i n i t i a lm e d i u mp H7 5，i n c u b a t i o nt e m p e r a t u r e2 8 a n di n c u b a t i o nt i m e2 8h I nt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s，t h eK c a r r a g e e n a s ea c t i v i t yw a sf o u n dt oi n c r e a s eb y1 0 8 7f o l d sc o m p a r e dw i t ht h eu n o p t i m i z e dc o n d i t i o n s K e yw o r d s：K c a r r a g e e n a s ep r o d u c t i o nb a c t e r i u m；s c r e e n i n g；f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n；o p t i m i z a t i o n】口H瞪口p 万方数据产-卡拉胶酶菌株的筛选及其发酵条件的优化产-卡拉胶酶菌株的筛选及其发酵条件的优化作者：李俊，马悦欣，冯兵，于杨，LI Jun，MA Yue-xin，FENG Bing，YU Yang作者单位：大连水产学院,农业部海洋水产增养殖学重点开放实验室,辽宁,大连,116023刊名：大连水产学院学报英文刊名：JOURNAL OF DALIAN FISHERIES UNIVERSITY年，卷(期)：2009,24(1)参考文献(17条)参考文献(17条)1.McLean M W;Williamson F B-Carrageenase from Pseudomonas carrageenovora外文期刊 19792.Weigl J;Yaphe W The enzymatic hydrolysis of carrageenan by Pseudomonas carrageen