第九章 毛细管电泳 仪器分析教材-南京大学.docx

第九章 毛细管电泳基本要求： 1. 理解毛细管电泳分离的原理； 2. 理解胶束电动毛细管色谱分离的基本原理；3. 理解影响毛细管电泳与胶束电动毛细管色谱分离优劣的因素。9.1 电泳基本原理电泳指带电粒子在电场作用下作定向运动的现象。电泳有自由电泳和区带电泳两类，分析工作者感兴趣的是区带电泳。区带电泳是将样品加于载体上，并加一个电场。在电场作用下，各种性质不同的组分以不同的速率向极性相反的两极迁移，此时不考虑样品与载体之间的相互作用，因此电泳不是一个色谱分离过程。实际上，样品与载体之间总有一定作用力，人们就利用这种作用力，并与电泳过程结合起来，以期得到良好的分离。因此，电泳又称电色谱。区带电泳总是在固体或类固体这类载体上进行，常用载体有滤纸（故称纸电泳）、凝胶（故称凝胶电泳），以及醋酸纤维膜、淀粉、琼脂高聚物等。图9-1 区带电泳设备示意图电泳设备简单，操作方便。图9-1就是区带电泳设备的示意图。在左右两边的电解质贮槽中，放入合适的电解质溶液，载体架于两槽之间。电解液通常是一种缓冲液，浓度约0.1molL-1。电解液体积要大，以防止电解产物扩散至载体上，最好在浸入载体的电解液与插入电极的电解液之间有一隔板。载体上所加电压梯度为每厘米数十伏。高电压可以加速迁移，缩短分析时间，但电压梯度须增至每厘米数百伏。可将样品加入其载体一端的起始点。在各组分分离之后，用合适的方法，如喷洒显色剂、紫外光照射等，使组分斑点出现，然后进行定性和定量分析。9.2 高效毛细管电泳装置将开管柱气相色谱理论与技术应用于经典电泳，从而诞生了一种新的高效的分离模式，高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis, HPCE)。它的性能在分离许多生化物质上要优于一般色谱法。毛细管电泳仪装置如图9-2所示。图9-2 毛细管电泳仪结构示意图高压电源供给Pt电极上的电压高达5-30kV。典型毛细管长约10-100cm，内径为25-100m，其材料可以是熔融石英。为了分离需要，也可采用预先经化学或物理吸附改性的毛细管。一般通过加压到电解质缓冲剂容器中或在毛细管出口减压，强使溶液通过毛细管。两端缓冲剂必须定期更换，这是由于在实验过程中，离子不断地被消耗，阴极和阳极缓冲液的pH值升高或降低。被分析样品的加入可以通过两种方法来实现。一是重力注射，即把毛细管一端浸没在样品溶液中，将此溶液提升，超过另一端缓冲液液面约10cm，使样品进入毛细管。二是电动进样，即在数秒种内，加5KV的短脉冲，由于电渗流的作用，使5-50L的样品进入毛细管。常用的检测器有紫外吸收检测器，二极管阵列检测器、荧光检测器、采用碳纤维的安培检测器，以及电导检测器等。9.3 电渗流迁移率毛细管电泳分离的一个重要特性是毛细管内存在电渗流。电渗流的来源如图9-3所示。当缓冲液的pH在4以上，石英管壁上的硅醇基(Si-OH)离解生成阴离子(Si-O-)，使表面带负电荷，它又会吸引溶液中的正离子，形成双电层，从而在管内形成一个个紧挨的“液环”。在强电场作用下，它自然向阴极移动，形成了电渗流。电渗流迁移率大小与缓冲液的pH值高低及离子强度有密切关系。pH值越高，电渗流迁移率越大；离子强度越高，电渗流迁移率反而变小；在pH为9的20mmolL-1的硼酸盐缓冲液中，电渗流迁移率的典型值约为2mms-1。pH值越小，硅醇基带的电荷越少，电渗流迁移率越小；pH值越大，管壁负电荷密度越高，电渗流迁移率越大。若在管内壁涂上合适的物质或进行化学改性，可以改变电渗流的迁移率。例如蛋白质带有许多正电荷取代基，会紧紧地被束缚于带负电荷的石英管壁上，为消除这种情况，可将一定浓度的二氨基丙烷加入到电解质溶液中，此时以离子状态存在的+H3NCH2CH2CH2NH3+，起到中和管壁电荷的作用。也可通过硅醇基与不同取代基发生键合反应，使管壁电性改变。图9-3 电渗流的形成在外加强电场之后，正离子向阴极迁移，与电渗流方向一致，但移动得比电渗流更快。负离子应向阳极迁移，但由于电渗流迁移率大于阴离子的电泳迁移率，因此负离子慢慢移向阴极。中性分子则随电渗流迁移。可见正离子、中性分子、负离子先后到达检测器。实验证明，不电离的中性溶剂也在管内流动，因此利用中性分子的出峰时间可以测定电渗流迁移率的大小。在外加强电场之后，正离子向阴极迁移，与电渗流方向一致，但移动得比电渗流更快。负离子应向阳极迁移，但由于电渗流迁移率大于阴离子的电泳迁移率，因此负离子慢慢移向阴极。中性分子则随电渗流迁移。可见阳离子、中性分子、负离子先后到达检测器。实验证明，不电离的中性溶剂也在管内流动，因此利用中性分子的出峰时间可以测定电渗流迁移率的大小。9.4 影响分离的因素9.4.1影响选择性的因素 1.离子迁移率离子迁移率（U）决定于离子的电荷。通常，电荷相同的两种离子A和B的分离距离d可表示为： (9.1)V为加在长度为L的毛细管两端的电压；t为迁移时间。为了得到良好分离，离子的迁移率差别要大，电压梯度要大，迁移时间要长。显然，溶剂的粘度低会有利于迁移速率的增加和分离时间缩短。电解质浓度越高，离子强度越大，离子迁移率变小。离子电荷增加，半径减小，其迁移率增大。 2.组分电离度被分离组分的电离度影响迁移速率。电泳时，所用溶剂常常是一种缓冲溶液，它的pH值是一定的。在此pH值下，对pKa不同的组分，离子形式与分子形式所占的比例不会相同，它们在电场下的迁移速率也就不同。例如谷氨酸具有酸碱二重性。它的结构式如下： NH2CHCOOH （pKa12.30, pKa24.18） CH2 CH2 COOH当缓冲溶液pH=2.30时，谷氨酸分子与其阳离子各占一半；当pH=4.18时，则分子与阴离子各占一半。但在pH处于pKa1与pKa2之间的某一值时，谷氨酸一定全部以分子形式存在，没有净电荷，在电场下不迁移，此pH值称为等电点。谷氨酸的等电点在pH3.3处。因此用电泳法分离弱酸时，可以选择合适pH的缓冲溶液，使不同组分之间的电离度和迁移率差别最大。 3.选择合适配体通过形成合适的配合物以改变分子或离子的电性，达到分离目的。9.4.2影响柱效的因素由于在高效毛细管电泳中，没有固定相，消除了来自涡流扩散和固定相的传质阻力，而且很细的管径，也使流动相传质阻力降至次要地位。因此纵向分子扩散成了制约提高柱效的主要因素。根据式（7.20）和式（7.25）可得： (9.2)若只考虑纵向分子扩散，由此引起的方差可表示为： (9.3)D为组分的扩散系数，t为从组分注入到检测器的组分迁移时间，它又可表示为： (9.4)L为样品注入口到检测器的毛细管长度。Uapp为组分的表观迁移率，即组分的电泳迁移率与电渗流迁移率之和。V为外加电压。将式（9.3）和式（9.4）代入式（9.2）得： (9.5)可见，高电压可获得高柱效。在恒定的高电压下，柱效与柱长无关，但是，使用长柱有利施加高电压。但所加电压的极限值又受毛细管热效应的限制。在毛细管电泳中，采用较低电流，可使毛细管内产生的焦耳热大大减小。焦耳热正比于I2R，I为通过毛细管的电流，R为溶液电阻。所产生焦耳热可通过窄径毛细管壁迅速传递给周围空气或用来冷却的液体介质，因此有的毛细管加有冷却套管。如果毛细管的表面积与体积之比不足够大，散热就不够良好。由于管壁与管中心的温差，使溶液粘度改变，使正常的电渗流流型受到扰动，而向流体动力学流型转变，使峰展宽（图9-4）。图9-4电渗流速度流型（a）和流体动力学速度流型（b） 在毛细管电泳中，还有一些其他因素使峰展宽。如所加入样品的初始带宽；组分在管壁上的吸附效应；组分与缓冲剂离子的迁移率以及样品浓度与电解质浓度的不相同匹配而偏离理想的电泳电行为，等等。95 胶束电动毛细管色谱 9.5.1原 理用普通的毛细管电泳方法无法分离中性分子，因为它们只随电渗流而迁移，其迁移速率与电流迁移速率相同。胶束电动毛细管色谱(micellar electrokinetic capillary chromatography,MEKC),既可以分离离子，更重要的是可以分离中性分子。将一种离子表面活性剂，如十二烷基磺酸钠加入到毛细管电泳的缓冲溶液中，当表面活性剂分子的浓度超过临界胶束浓度（即形成胶束的最低浓度）时，它们就会聚集形成具有三维结构的胶束。所形成的胶束有这样的特点，疏水尾基都指向中心，而带电荷的首基则指向表面。由十二烷基磺酸钠形成的胶束是一种阴离子胶束，它必然向阳极迁移，而强大的电渗流使缓冲液向阴极迁移。由于电渗流速度高于以相反方向迁移的胶束迁移率，从而形成了快速移动的缓冲液水相和慢速移动的胶束相，后者相对前者来说，移动极慢，或视作“不移动”，因此把胶束相称为“准固定相”。当被分析的中性化合物从毛细管一端注入后，就在水相与胶束相两相之间迅速建立分配平衡，一部分分子与胶束结合，随胶束相慢慢迁移，而另一部分则随电渗流迅速迁移。由于不同的中性分子在水相与胶束相之间的分配系数有差异，经过一定距离的差速移行后便得到分离（图9-5）。出峰的次序一般决定于被分析物的疏水性。越是疏水物质，与胶束中心的尾基作用越强，迁移时间越长；反之，越是亲水物质，迁移时间越短。若不同的离子与胶束的带电荷首基之间的作用强弱不同，从而使不同离子的分离选择性也可以提高。图9-5 胶束电动色谱原理示意图样品（阳离子、阴离子和中性分子）都在阳极端注入。由于中性分子的迁移时间（tR）介于电渗流迁移时间（to）与胶束迁移时间（tmc）之间，其分配比可表示为： (9.6)当胶束相移动速度趋近于零时，tmc趋向无穷大，则式（9.6）与式（6.16）相同。to可以通过注入与胶束不作用的物质，如丙酮、甲酰胺等来测得。使用全部溶于胶束的物质，如亲脂染料来测定tmc。在胶束电动色谱中，被分离的物质对分离度的表示，类似于式（6.32）。 (9.7)式中最后一项说明了胶束电动色谱不同于高效液相色谱之处，是此方法特征的替现。当胶束相的移动速度趋近于零时，最后一项趋近于1，则式（9.7）变成式（6.32）。与在高效毛细管电泳中一样，外加电压越高，理论塔板数越大，但过高的电压，使温度上升，反而不利分离。合适的k值应为 ，此时分离度最大。一般，k在1-5之间为佳，它可以通过改变准固定相的浓度来达到。迁移时间比越小，分离度越大。对大多数离子胶束而言，在中性或碱性条件下， 范围在0.2-0.4之间。通过电渗流速度的减小，加入有机溶剂以及减小pH，都可以使 值减小，但分析时间延长。值的改变，可以通过选择准固定相的类型、缓冲液的性质（特别是含有不同手性选择剂的缓冲液）以及添加剂等来改变。9.5.2常用表面活性剂在胶束电动毛细管色谱法中，影响分离的变数更多，如在缓冲液中加入不同的阴、阳离子和两性离子，加入不同有机溶剂，以及加入不同表面活性剂，从而改变被分析物在两相之间的分配系数。其中尤以表面活性剂的影响最大。不同类型的活性剂强烈影响分离体系的选择性。1.长链烷基表面活性剂常用的是阴离子型十二烷基磺酸钠。它们会形成球形胶束，离子基团裸露在外，中心为疏水基团。溴化十六烷基三甲铵属阳离子型。由光学活性氨基酸衍生化合成的表面活性剂，可以用来分离对映体。2.胆汁酸盐表面活性剂胆汁酸盐是来源于生物体的阴离子表面活性剂，结构如图9-6图9-6胆汁酸盐结构它们可以形成一个螺旋形胶束。R1、R2和R3基团可以是氢、羟基，R4可以是不同的羧基或磺基钠盐。与长链烷基表面活性剂比较，它的相对溶解能力较弱。胆汁酸盐是一种天然手性表面活性剂，因此除了成功分离疏水化合物外，还可以分离对映体。 3.高分子质量表面活性剂大多数表面活性剂在形成分子聚集体时。都有一个临界胶束浓度和聚集数目的问题。由于高分子质量表面活性剂的结构特殊（图9-7），它能与一种分子形成。胶束与低分子量表面活性剂相比，刚性和稳定性好，分子尺寸可以调控，临界胶束浓度基本为零，因此与温度、缓冲剂浓度和添加剂性质等无关。有机溶剂浓较高时不会破坏胶束。若在制备聚合表面活性剂时，引入含手性中心的基团，则可用来分离对映体。图9-7 高分子质量表面活性剂9.6 应用由于毛细管电泳的分离模式多样化，毛细管内壁的修饰方法及流动的缓冲液中的添加剂的不同，以及新检测技术的发展，使毛细管电泳的应用非常广泛。将各种高效液相色谱的柱制备技术移植到毛细管电泳中，就产生了毛细管电色谱。它可用来分离、检测土壤及水等环境的多环芳烃；分离多种阴离子和阳离子；获得不同价态或形态的无机离子的信息。毛细管电泳的另一个重要应用是在药物及临床方面，已成为研究的不可缺少的手段。它可用于几百种药物中主要成分、所含杂质的定性及定量分析。在临床诊断中，可用于检测药物及其在体内的代谢过程的研究。在生命科学中，毛细管电泳技术更显出它的优越性，因而应用更广。它可用来测定DNA的各种形式及DNA序列。用毛细管胶束电动色谱可以分离碱基、核苷酸等。毛细管电泳在生物大分子蛋白和肽的研究中应用十分广泛。它可用来检测纯度，如可以检测出多肽链上的单个氨基酸的差异；若与质谱联用，可以推断蛋白质的分子结构。采用最新技术，基至可以检测单细胞、单分子，如监测钠离子和钾离子在胚胎组织膜内外的传送。单细胞的检测为在分子水平上研究细胞的行为提供了极为重要的工具，而单分子的检测为在单分子水平上开展动力学研究展示了广阔的前景。由于目前有多种手性选择剂可以使用，因此具有高分离能力的毛细管电泳在手性分离中极为重要。将合适的手性选择剂加入缓冲剂中，其分离效率优于高效液相色谱法。习 题1.用色谱基本理论来解释高效毛细管电泳能实现高效和高速分离的原因。2.提高毛细管电泳柱效的措施有哪些？3.按经典电泳理论，阳离子和阴离子分别向阴极和阳极迁移，在高效毛细管电泳中，为什么可以在阴极检测出所有离子？4.在低pH缓冲溶液中检测阴离子会发生困难。这是为什么？为了解决这一困难，你认为应该怎样做（提示：从仪器方面考虑）？5.有什么办法可以测得电渗流迁移率和准固定相迁移率？6.你能否通过物理或化学的处理方法，使电渗流的迁移率改变或方向逆转（即流向阳极）？7.从色谱基本理论出发，比较胶束电动毛细管色谱与毛细管电泳的最大差别是什么？8.采用什么方法可以使中性分子分离？为什么？9.对于下列化合物，谁的电泳迁移率大？为什么？10.用毛细管电泳法分离以下两个化合物。在缓冲液的pH分别为8.5和4.0时，请判断它们出峰的次序。在pH8.5时都呈二价阴离子；pH4.0时为一价阴离子。