植物内生菌定殖检测技术及其应用_唐广宣.pdf

生物技术进展生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 1 期 55 64Current Biotechnology ISSN 2095-2341进展评述进展评述Reviews植物内生菌定殖检测技术及其应用唐广宣1，2，何莉薇1，2，陈泳妤2，张佳研1，戴雅琪2，吕辉雄2，刘丽辉1，3*1.暨南大学生命科学技术学院，广州 510632；2.华南农业大学资源环境学院，广州 510642；3.广东药科大学生命科学与生物制药学院，广州 510006摘要：自然环境中内生菌定殖于植物体内，对宿主植物产生多种有益效应，但是内生菌定殖情况难以检测，相关研究不够深入系统。目前在该领域使用较为广泛的检测技术包括：荧光标记、抗生素标记、荧光定量PCR和高通量测序等。内生菌通过孔隙伤口和降解细胞壁等方式侵染植物，通过种子垂直传递核心内生菌。对植物内生菌定殖的侵染方式、定殖方法和检测技术进行了归纳和整理，介绍了内生菌多种侵染和迁移途径，总结了目前内生菌定殖在生物防治、促进植物生长和污染修复等方面的功能，综述了多种检测方式在应用中的特点，以期为内生菌定殖植物的相关研究及其应用提供参考依据。关键词：内生菌；侵染途径；定殖检测技术；防治与促生DOI：10.19586/j.20952341.2022.0105 中图分类号：Q934.3 文献标志码：ATechniques on Colonization and Detection of Plant Endophytes and its ApplicationTANG Guangxuan1，2，HE Liwei1，2，CHEN Yongyu2，ZHANG Jiayan1，DAI Yaqi2，LV Huixiong2，LIU Lihui1，3*1.College of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632，China；2.College of Natural Resources and Environment，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；3.College of Life Science and Biopharmaceutical，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，ChinaAbstract：In the natural environment，the colonization of endophyte in plants produce a variety of beneficial effects on host plants，but endophyte colonization is difficult to detect，and the related research is not deep and systematic.At present，the widely used detection techniques in this field include fluorescence labeling，antibiotic labeling，fluorescent quantitative PCR，high throughput sequencing，and so on.Endophytes infect plants through pore wounds and the degraded cell walls，transmitting core endophytes vertically through seeds.In this paper，the infection methods and colonization methods of plant endophytes were summarized.The paper also introduced various ways of infection and migration of endophytes，and summarized the functions of endophyte colonization in biological control，promoting plant growth and remediation of polluted environment.The characteristics of various detection methods in the application were reviewed，the paper was expected to provide reference basis for the related research and application of endophytic bacteria colonizing plants.Key words：endophytes；infection route；colonization detection technology；control and growth promotion植物内生菌是一种可以在健康的植物组织中定居，不会伤害到宿主，同时能够和植物构建和谐生态的微生物1。植物内生菌包括内生细菌（如固氮菌）和内生真菌（如丛枝根真菌），其中内生细收稿日期：20220617；接受日期：20221009基金项目：国家自然科学基金项目（41907301；41977301）；广东省科技创新战略专项资金（“攀登计划”专项资金）项目（pdjh2021b0085）。联系方式：唐广宣 E-mail:；*通信作者 刘丽辉 E-mail:生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology菌具有来源广泛、生殖繁衍快、适应性强、种群多样性和代谢产物丰富等优势，被广泛应用于植物定殖2-3。内生菌通过多种方式侵染植物，定殖在植物组织内部，包括根、茎、叶、花和种子，其中根部内生菌的数量和多样性最为丰富4。长期定殖作用下，内生菌与宿主植株逐步形成稳定的共生关系，且这种互利共栖关系的作用机制已经引起广泛关注。内生菌侵染和定殖是一个时间和空间上的动态过程，定殖过程因实际环境不同可选择不同的定殖方式。这种环境引起的变化在时间上会产生定殖菌数量的动态过程，在空间上定殖菌会在宿主植物不同组织间迁移运动5。大多数情况下，内生菌的定殖过程和机理是无法直接观察的，这导致定殖动态规律与机理的系统性总结和研究存在很大的困难。为进一步克服内生菌定殖动态研究中的困难，更好地探究内生菌的多样性及其与宿主的互作机制，揭示多种定殖机理与过程，有助于该领域逐渐发展出多种高效简便的定殖检测技术。如：利用转基因技术的绿色荧光标记能够实现定殖结果可视化；通过诱导高抗菌株能够实现抗生素标记目标菌；实时荧光定量PCR 与高通量测序技术能够从分子水平检测定殖结果，提高结果精准度6-8。这些技术的发展对更好地探索定殖相关的途径、机理和信号分子等具有重要意义。内生菌构成了植物微生态系统的重要组成部分，占据特殊的生态位，对植物具有抵抗病虫害、促进生长、降解污染物的作用。随着生态学的日益发展，内生菌定殖开始从基础研究转向应用研究，不断推动着农业现代化、环境修复绿色化和生态恢复效益化的进程。定殖方式及其新型检测技术的研究发展能够更好地追踪定殖菌在宿主植物中的迁移变化，从而预测二者的交互作用。本文总结了植物内生菌在定殖过程中的侵染方式、原理及其应用，并对常用的定殖检测方法进行了整理分析，对各种检测技术的优缺点和实际应用进行了归纳。在目前的研究发展水平下，定殖研究与新型分子生物学技术检测方式如高通量测序、实时荧光定量 PCR法相结合可以更好促进内生菌定殖研究的发展，有效探究互作过程中的信号，了解定殖过程与宿主特性，推动定殖研究的应用。1内生菌的侵染和定殖1.1内生菌侵染植物的途径菌株能够通过某些方式进入植物体内，从而在植物体内定居和繁殖。内生菌主要以3种不同方式侵染宿主植物（表1）。通过宿主叶表的气孔、植株自然生长时的擦伤口、人工制造的切口等通道侵入宿主植株体内。如果目标菌株从根部侵入植株，一般选择使用伤根法、灌根法或蘸根法等；如果目标作用部位是茎干，一般选用打孔法以及针刺法；如果目标作用部位是叶片，一般选用伤叶法和喷雾法12。微生物会通过分泌酶对细胞壁进行分解，穿透植物细胞成功进入宿主体内。例如内生细菌伯克霍尔德菌（Burkholderia phytofirmans）能够产生细胞壁降解酶、内切葡聚糖酶和内聚半乳糖醛酸酶等化合物，这些物质参与局部细胞壁降解，穿过内胚层的裂纹，移动进入木质部，进而帮助细菌侵入和定殖5，13。研究发现，微生物通常会在植物根表面形成生物膜，促进细胞壁降解，从而使微生物更容易侵染和定殖到根部。通过种子的垂直传递，在宿主结种时，内生菌会迁移运动到种子组织附近，从成熟种子的裂缝或者种脐处进入组织内部14。之后伴随着种子的萌发，内生菌实现从亲本传递到宿主后代的目的。由于侵染方式和侵染组织的不同，最终侵染定殖效果会产生差异12，14。有报道指出，内生菌Safensis CS4定殖烟草实验中选用了浸根和叶面喷雾两种侵染方式，结果显示叶面喷雾处理的定殖率大于浸根处理，说明侵染方式影响定殖能力15。因此，探究侵染方式与侵染组织对定殖效果的影响，有助于揭示内生菌的定殖机理，提高内生菌定殖的成功率。1.2内生菌在植物体内定殖内生菌定殖是指通过各种侵染方式使菌株穿过植物体表，进入体内最终在植物内部长期生存并大量繁殖16。Galippe最先推测，细菌能进入植物组织并且在植物组织内定居17。随着植物内生菌的研究发展，发现自然情况下空气中的微生物落到宿主茎叶上会发生定殖，土壤中的微生物通过自身的运动性、趋化性、群体感应等特性到达根际发生定殖，根部是定殖发生的主场所18-19。土壤定殖菌受到宿主根际分泌物的吸引，附着在根56唐广宣，等：植物内生菌定殖检测技术及其应用际形成生物膜，降解宿主植物细胞壁，侵染进入宿主体内，以蒸腾作用为动力，通过导管在植物内迁移，找到适合生长的植物组织生长繁殖20。例如YL6-GFP在小白菜的定殖研究中，因为受到土壤成分的吸引，标记菌株首先从宿主根部入侵，随后由叶柄、叶脉部分向叶肉迁移，最终在宿主各组织内维持一定的定殖密度，说明定殖部位不只是入侵部位21。研究发现目标菌株除了定殖部位会发生改变，定殖量也会发生一定的变化。例如，在变栖克雷伯菌SH-1（Klebsiella variicola SH-1）定殖石斛（Dendrobium officinale）的动态实验中，发现定殖量随时间表现为先增后减，定殖效果随时间有所下降22，这说明应用内生菌定殖时，要充分考虑到定殖是兼具时间和空间的动态变化的过程。内生菌在宿主体内侵染定殖后，目标菌与宿主内其他微生物种群共同构成宿主微生态系统。它们占据不同的生态位并分泌次生代谢产物，一方面与其他微生物产生竞争，引起微生态系统内部发生演替，另一方面结合信号转导，引起宿主产生生理反应，进而影响宿主的营养、发育与抗逆性等23。近年来，关于内生菌定殖植物产生互作关系的研究越来越多。许多研究认为定殖菌作为潜在病原菌释放毒力因子，但是与传统病原菌不同的是内生菌引起的宿主免疫反应不会将其彻底消灭，甚至二者互利互惠24。这种动态的维持机制十分复杂精密，追踪定殖菌侵染后在宿主内的活动过程、产生的活性物质、特殊基因的表达等都需要借助检测手段。传统形态定殖检测技术是利用重分离方法，直接将宿主植物的根、茎、叶和种子等进行研磨，然后涂布培养，筛选目标菌。这种方法无法精准获得目标菌定殖于宿主组织和细胞层面的具体情况，多种结合分子生物学的新型检测技术弥补了这种不足，拓宽了定殖研究的精确度与深度。2植物内生菌定殖的检测方法利用定殖检测技术追踪内生菌定殖生长的情况，能够为研究内生菌促生、抗性、降解有机污染物等有益宿主生长等方面做出贡献。目前常用的新型检测方法包括抗生素检测法、荧光标记法、实时荧光定量法、高通量测序法和特异性寡合核苷酸片段标记法。2.1绿色荧光蛋白标记法绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记方法是通过转基因技术将 GFP基因导入目标菌，在菌内表达绿色荧光蛋白，使得菌体呈现绿色，在紫外光和蓝光照射条件下发出绿色荧光，达到标记菌株的目的25。该方法可以对目的菌株进行长期稳定的标记并直接观察，便于长期追踪内生菌在植物内的定殖情况。GFP存在广谱表达性，能够导入多种内生菌，包括克雷伯氏菌属、泛菌属、假单胞菌属、肠杆菌属、土壤杆菌属和芽孢杆菌属等26。因此，GFP可以作为一种监测目标菌株在宿主植物中定殖情况表1内生菌侵染植物的途径Table 1The way of endophytic bacteria infecting plants方式通 过 宿 主的气孔、擦伤口、切口等 通 道 侵染内 生 菌 分泌 酶 来 降解 宿 主 细胞纤维素通 过 种 子的 垂 直 传递定殖原理根部接种内生菌的主要入侵途径是通过根系与土壤等摩擦而造成的伤口进入；茎部接种则是以茎干上的皮孔、蜜腺等作为通道；叶部则是通过气孔、水孔等9通过代谢产生细胞壁降解酶等物质对局部细胞壁进行降解；内生菌穿过内胚层的裂纹，移动进入木质部，进而帮助细菌侵入和定殖5内生菌与宿主可协同进化，参与宿主的生长、繁衍，伴随着种子的萌发，通过种子的垂直传递将内生菌从亲本传到后代特点用于定殖研究中较为便捷的侵染方式属于植物的原始自身操作方式，内生菌不受植物体外其他因素影响宿主种子的表面普遍带有独特的共生微生物群落，会影响种子的萌发、生长和宿主健康，也是植物内生菌垂直传播的一种方式应用根部侵染法：伤根法、灌根法、浸根法、蘸根法；茎干侵染法：打孔法、针刺法；叶片：伤叶法、喷雾法。有研究采用喷雾和灌根相结合的方法，用枯草芽孢杆菌 Y13（Bacillus subtilis 13）侵染油茶10如蓝细菌（Brasilonema）能分泌破坏植物细胞壁的水解酶进而侵入植物体内种子内生菌的垂直传递规律用于现代生物育种中，有研究使用内生细菌PW7悬液处理黑麦草（Lolium multiflorum L.）种子进行浸种定殖1157生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology的报告基因，了解标记菌在宿主体内是否成功定殖，以及对目标菌株进行实时定位观察。例如，通过GFP标记内生菌枯草芽孢杆菌YN201490（Bacillus subtilis YN201490），利用荧光拍照技术证明菌株YN201490能在黄瓜中稳定定殖，同时获得该菌在黄瓜中的定殖量维持在103104 CFU g-1鲜重 27。与 GFP 标记法同时发展的是其观测技术，GFP标记的内生菌侵入宿主植物后，需要借助检测技术进行观测6。重分离是最简便的一种方法，取宿主植物的组织进行研磨，培养组织内的微生物，随后在黑暗环境下使用长波紫外灯或者蓝光对菌群进行照射，观察是否有发荧光的菌株28。为获取更加精准的定殖情况，可以利用显微镜辅助观察，实现定殖结果可视化。选择有适当滤光片的荧光显微镜，将被测组织或细胞送镜检测，直接观察菌株定殖情况并拍照计数29。另外，已有研究采用双光子激光共聚焦扫描镜对标记菌在宿主中的位置进行长期追踪以及准确定位分析30。双光子激光共聚焦扫描镜能有效地克服普通显微镜的光漂泊现象，使观察结果更加准确、效果更佳，对内生菌定殖机制的研究帮助更大。目前 GFP 标记菌株的主要研究领域是基因导入方式和定殖检测方式。此外，定殖中的调节机制、目标菌株定殖后的发光机理和新型突变体荧光蛋白的改良应用等方面仍需深入研究。未来，荧光蛋白在内生菌定殖研究中仍会起到重要作用。2.2抗生素标记法抗生素标记法依靠菌株的自生抗性或者人工诱化，筛选高抗抗生素的菌株变体，并以此为手段进行菌株的定殖检测7。这种标记方法具有易分析、低消耗、快速、适用广的优点，卡那霉素、利福平、氨苄青霉素、链霉素、腐霉利、四环素和青霉素等抗生素在标记中都会经常被用到31。由于利福平标记法的生防性状不易丧失，因此被作为一种最常用的抗生素标记方法32。应用抗生素标记法进行内生菌定殖检测时，首先采用浓度梯度法筛选得到突变抗性菌株，再通过多代培养，验证突变体子代菌株能否稳定保持抗性，以确保遗传稳定性及其他重要特性没有发生改变和丧失。例如，目标菌株羽毛针禾（Stipagrostis pennata）根部内生假单胞菌 XG11（Pseudomonas XG11）通过抗生素梯度诱导培养，筛选出四环素作为抗药性突变体的XG11菌。将四环素抗性XG11定殖小麦，定时采样，研磨法处理小麦不同组织，研磨匀浆涂布于含有300 g mL-1四环素的培养基中培养，完成对XG11定殖结果及定殖量的检测，实现内生菌定殖的定量定性分析33。目前抗生素标记法的研究已从单抗生素标记发展到了多种抗生素同时标记，例如：有研究通过多抗生素诱导法得到解淀粉芽孢杆菌N24菌（Bacillus amyloliquefaciens N24），该菌株具有链霉素和利福平两种药物的抗性，能够同时有效地解决葡萄白粉病和葡萄霜霉病34。这种多抗性标记的方法不但能够为定殖研究提供一种检测手段，还为农业生产中作物的抗病性研究提供了一个新方向。近年来，多抗标记法在生物防治植物病害中起到了极大的作用，相关应用的文章发表数量呈现上升趋势，该方法有望成为内生菌促进植物抗性发展的研究热点。此外，抗生素标记方法作为一种常用的定殖检测手段，对内生菌在宿主内存活状况的检测具有良好效果。2.3实时荧光定量PCR法实时荧光定量 PCR 法（real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）通常是针对目标菌株特定基因序列定量检测，以反映内生菌定殖数量35。针对定殖菌设计特异性基因片段，片段在体系中循环扩增，产物以荧光的形式显示，qPCR中的光学检测系统对荧光信号全过程采集，当光到达一定强度，获得阈值时片段拷贝数，通过标准曲线计算定殖菌个数6，12。针对目标菌的基因组设计高特异性荧光探针用于定殖菌的qPCR诊断鉴定，能够量化组织内定殖菌的数量。近年来，使用较为广泛的探针包括Taq Man探针和SYBR染料，它们的优势在于特异性强、反应快速、自动化程度非常高36。Taq Man探针法通过密闭操作，有效减少了假阳性和污染现象，增加了操作的自动化程度。而SYBR染色法能够保证荧光信号强度与PCR产物同步增加，因此可绘制两者相关的数量曲线图，用于计算目的基因的数量37。除此之外，qPCR技术可以很好地分析目标菌株定殖过程中发挥特殊作用的基因，极大地降低了探究定殖机理的难度。例如，有研究将内生菌吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007（Burkholderia pyrrocinia JK-SH007）接种杨树后，除了利用qPCR技术检测菌株的定殖情况外，还分析了多聚半乳糖醛酸酶基因 BpPG 在定殖中发挥的作用，有助于58唐广宣，等：植物内生菌定殖检测技术及其应用该菌定殖机理的揭示38。目前qPCR技术在内生菌定殖检测中应用广泛，促进了内生菌定殖研究发展，为实际生产带来效益。2.4高通量测序法高通量测序法包括16S基因测序和宏基因测序。高通量测序法通过对宿主植物组织进行测序，定性定量分析获得样本菌群结构，即菌种的组成和丰度，分析菌种的组成可知目的菌定殖是否成功，分析丰度则可知菌株的定殖量39。16S rRNA基因测序与宏基因测序深入探究宿主微生物群落物种丰度的变化，若宿主内目标菌种所在属的丰度增加，可初步判定定殖成功40。宏基因测序获得宿主组织全基因，通过与目标菌株的基因序列比对，可进一步明确内生菌定殖情况。Kong等41将戈登氏菌QH-11（Gordonia QH-11）定殖油菜（Brassica napus L.），通过高通量测序结果发现接种后油菜根部及根际土壤戈登属的丰度从无到有显著提高，第30天时戈登属依旧存在，证明QH-11能够长期稳定定殖于油菜。庞杰等42从镉污染水稻中分离获得具有耐镉能力的红苍白草螺菌R-13（Herbaspirillum rubrisubalbicans R-13），将R-13定殖于龙葵宿主植株中，定期采样后利用高通量测序分析宿主组织内生菌群的组成与丰度，结果显示龙葵组织中稳定包含R-13基因序列，证明R-13成功定殖。此外，有研究以山羽藓（Abietinella abietina）为材料，通过高通量测序技术得到了山羽藓微生物的群落结构，其中内共生菌包含226个属，慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium jordan）和鞘脂单胞菌属（Sphingomonas sp.）为优势属，因此研究人员可预测定殖结果43。选择合适的目标菌株种属及侵染方式进行定殖，一定程度上能够加大目标菌株的生态位，提高定殖成功的概率。利用该方法定期对植物的不同组织进行测序，可探测目标菌的活动轨迹。例如对果桑测序发现感病果桑的根部内生菌可通过茎杆移动，定殖到感病的果实中，此检测为生物防治的发展提供了理论依据44。目前对于高通量测序技术的应用比较广泛，宏基因测序在定殖菌的基因和功能层面展开研究，从遗传水平上对菌株进行解读，有助于探索内生菌在宿主植物体内的功能基因、代谢路径和定殖机制39。比如孟宪法等45利用高通量测序技术发现内生菌欧文氏菌（Erwinia）的种间信号分子AHLs（Acyl-homoserine Lactones）可以借助群体感应碳水化合物在宿主内的消化分解等代谢过程，进而进行系统调控。因此，可利用高通量测序展开定殖菌与宿主间信号交流的研究，为定殖机制和定殖代谢途径的探索做出贡献。高通量测序技术的兴起为内生菌定殖研究提供了更广阔的应用平台，并且16S rRNA基因测序与宏基因测序结合，能够更精准地获得定殖菌功能基因、定殖动态和微生态群落多样性。但是该方法还存在一定的局限性，比如检测成本高、后续分析数据量大等45。高通量测序技术有望通过不断改进推动生物菌剂的商业化发展，在未来发挥更大的作用。2.5特异性寡核苷酸片段标记法特异性寡核苷酸片段标记法是以特异的RNA或者DNA序列为探针，通过与宿主或者菌落的DNA进行杂交，从而实现对内生菌定殖结果的检测，该方法具有特异性强和灵敏度高的特点，有效地提升了实验的效率和准确率46。结合rRNA含量的不同，依据探针亮度强弱能够实现对细菌活性的有效评估。刘佳等47根据内生菌XG32中16S RNA的特异性，设计了寡核苷酸探针，结合特异性验证和杂交条件优化，成功检测了 XG32菌在番茄根际的定殖和分布情况。寡核苷酸探针标记荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术使检测更为准确，当目标菌株的 RNA 或者 DNA 与核酸探针杂交以后，借助激光扫描仪或者荧光显微镜就能够对荧光信号进行观察48。该技术可以监测菌株定殖信号，例如以葡萄微繁殖产生的苗为材料，采用DOPE-FISH方法，对葡萄微繁殖植株进行根际定殖试验，结合共聚焦显微镜，探索定殖过程中路德维希肠杆菌（Enterobacter ludwigii Env6）与宿主间产生的代谢信号49。此外，还有利用寡核苷酸芯片法进行标记，该法主要分为表达谱芯片和检测芯片两种。芯片标记技术可用于基因实变检测、多态性分析、转基因检测等，广泛应用于内生菌在转基因作物方面的定殖研究50。2.6其他检测方法除以上检测方法外，再分离法、外源编码酶标记法、同位素示踪法、组织染色法、放射性标记和示踪分析相结合等方法在一定程度上可以用于定殖检测51-52。其中，外源编码酶标记法是借助-59生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology葡糖醛酸糖酶基因（gusA）、荧光素酶基因（LuxAB）和-半乳糖苷酶基因（LacZ）等编码酶基因进行检测46，51。由于各种检测方法都有自身的优势和不足，因此在实践中需要根据目的和条件进行综合考量，选择合适的检测方法，也可以结合多种检测方法相互验证，从而使定殖检测更加可靠和精准。常用新型检测方法及其优缺点汇总于表2。3内生菌的应用多样性的内生菌在生物防治、促进宿主植物生长、降解有机污染物等多方面均有一定程度的促进作用。开发内生菌作为菌剂替代化肥和农药应用于农业生产，能高效发挥相关作用。利用内生菌修复环境问题，彻底矿化污染物，治理污染土壤与水体。内生菌应用产生多种有益效果，同时符合绿色和谐发展的时代理念，相信该领域的应用会得到更多重视。3.1生物防治植物病害的生物防治是植物保护的一种自然方式，可减少化学物质的投入，相比其他生防技术的优势非常明显，近年来得到广泛应用。在生物防治中，内生菌具有受保护的生态位优势，与栖息在植物周围的微生物相比更具有优势，因为能直接接触宿主细胞及其代谢产物，能够快速做出反应，发挥有益效应56。内生菌主要借助重寄生作用、溶菌作用、营养物质的竞争和产生抗菌物质等方面实现病虫害的防治57。研究发现，一些内生菌定殖后能够产生细胞壁降解酶、细菌素和抗生素等抑菌物质，甚至部分内生菌可同时分泌多种抗菌物质以达到加强抗菌的效果58。还有一些研究发现，内生菌定殖后分泌的一种抗菌物质能够对多种病害实现有效防治，其中具有较强抗菌活性的内生菌PCE45产生的PCP-1抗菌肽能有效抑制多种病原菌，该物质对稻瘟病菌（Pyricularia oryzae Cav）和 玉 米 弯 孢 菌（Curvularia lunata（Walk）Boed）的抑菌率可达到93.5%和95.5%59。此外，内生菌定殖后可以通过与病原菌争夺营养物质和生态位起到一定程度的防治作用24。比如，内生菌定殖后快速占领植物内易侵染的点位，随后在这些点位和病原菌进行营养、水分和氧气方面的竞争，减弱病原菌活性，达到防治病原菌的表2常用的内生菌定殖检测方法汇总Table 2The commonly used detection methods for colonization of endophyte方法荧光蛋白标记法抗生素标记法实时荧光定量PCR法高通量测序法特异性寡合核苷酸片段标记法优点后续操作简单，可直接观察，能够长时间且稳定地标记，保持荧光时不会对生物体功能产生影响26易于分析统计、消耗低、快速、适用范围广等检测方便、反应迅速、灵敏度高、自动化高，可以很好地分析目标菌株定殖过程中发挥特殊作用的基因灵敏度高、可操作性强，能够精准解析目标菌株的代谢途径和功能基因。通过测序也可以检测受体植株的微生物群落和丰度灵敏度高、特异性强，大大地提高了实验的准确率和效率缺点标记基因重组到质粒上表达的不稳定性较高，并且成功率不高。相比之下，重组到基因组的稳定性较高。此外，将重组 DNA 导入革兰氏阳性菌的难度较阴性菌更大定量不准确、准确率低、回收下限较高且易出现抗生素屏蔽现象对设备要求较高，并且会产生气溶胶污染问题，从而导致出现假阳性，影响结果的准确性和特异性54成本高、后续需分析大量数据等基因结构的高度多态性造成可操作性差应用受荧光蛋白基因的导入方式、菌株侵染标记方式和定殖检测方式等影响，包括使用绿色荧光蛋白标记菌株YN28-P43GFPmut3a，观测其在烟草体内的定殖量及分布51该法是一种常用的定殖检测手段，已从单抗生素标记发展到了多种抗生素同时标记，广泛应用于生物防治植物病害中。例如以拮抗病原真菌双抗性和抗利福平为标记，对辣椒体内的枯草芽孢杆菌 BS-2（Bacillus subtilis BS-2）定殖情况进行观测53广泛应用于内生菌的定殖检测中。如DaSilva等55利用实时荧光定量PCR筛选出适用于甘薯不同组织的内生菌基因从遗传水平上对菌株进行解读，探索内生菌在宿主植物体内的功能基因、代谢路径、定殖机制等，例如利用高通量测序法，确定R-13菌能否成功定殖于龙葵体内42发展出了寡核苷酸探针双标记荧光原位杂交技术（DOPE-FISH）和芯片标记技术，这些技术可以更加精准地检测目标菌株在宿主体内的定殖情况60唐广宣，等：植物内生菌定殖检测技术及其应用效果60。另外，内生菌中会出现一类铁载体，该载体可有效争夺附近的铁离子，使病原菌无法获得铁元素而出现生长抑制61。总而言之，内生菌进行定殖后借助以上方式能够发挥良好的生防作用，目前该方式已经在实际生产操作中得到逐步应用。3.2促进植物生长一些内生菌定殖到植物体内后，可以促进宿主植物生长，提高宿主生物量、株高等生长指标，增加氮含量和叶绿素含量等，还可以改善营养形态和促进吸收，对宿主生长过程进行加速56。目前研究重点是内生菌发挥促生作用的机制，主要包括直接促生和间接促生两种方式。直接促生是内生菌定殖后产生乙烯、刺激性植物激素以及分泌有机酸等物质，从而改进植物营养状况62。例如，对欧洲油菜（Brassica napus）接种产生长素的促生菌，发现宿主根部增粗且分枝越来越多63。间接促生是宿主接种内生菌之后能够实现有效的生物防治、诱导系统抗性或促进根瘤和菌根的形成，增强共生作用2。其中，固氮菌属定殖后具有分泌抗生素、铁载体、调节物质以及固氮等功能，通过这些物质进行生物防治，能帮助宿主减少在病虫害方面损失的能量，促进宿主更好地生长发育64。目前内生菌定殖在促进植物对营养物质的吸收和利用、提高作物产量、拮抗病原菌等功能上已得到研究者们的广泛重视。未来该方法很可能逐步代替化肥、农药和人工生长调节剂，促进绿色农业的可持续发展。3.3降解有机污染物有机污染物在环境中具有持久性、积累性、生物放大性等特点，随着食物链和食物网进行传递，对生态系统和人体健康造成威胁65。近年来，大量研究发现内生菌定殖植物对有机污染有良好的降解效果。内生菌定殖植物后通过产生降解酶代谢有机污染物，降低污染物毒性，虽然植物自身能够降解一些有机污染物，使之变成一些小分子物质，但微生物降解是去除有机物污染物的主要途径66。内生菌降解有机污染物可以完全矿化为CO2与H2O，且内生菌本身对植物无害，因此利用内生菌降解有机污染物受到了广泛关注。降解内生菌通过定殖帮助宿主提高对污染物的耐受程度，促进根系对营养物质的吸收，而定殖菌利用宿主组织存活并实现氧的转移，同时产生特定降解酶，降解宿主无法转化的有机污染物67。例如，内生菌枯草芽孢杆菌定殖水稻实验中，宿主为定殖菌提供生存所需的物质，定殖菌分泌邻苯二甲酸酯（phthalic acid ester，PAEs）降解酶，缓解PAEs对植物的生长胁迫，同时产生的降解产物又作为碳源和能源供定殖菌生长68。有研究发现这种方式不仅能有效降低环境中污染物的含量，同时还能减少植物累积的污染物，实现植物内环境与外环境的双重修复。例如多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）具有非常强的毒性且在土壤中状态稳定，功能内生菌定殖小麦能够显著促进小麦体内芘和土壤中PAHs的降解69。综上，对有机物进行内生菌定殖降解，能够修复土壤并帮助宿主更好的生长发育，实现在宿主内“边生产边修复”的策略。3.4其他应用除了以上作用，内生菌定殖还有其他医药学、分子生物学、植物保护学等多方面价值。研究发现，药用植物的内生菌可分泌产生抗肿瘤、抑菌、药用活性物质等功能成分70。如果将这些内生菌定殖到其他药用植物中，对新药研发、药用植物栽培等方面会产生巨大的促进作用。在基因工程方面，内生菌定殖期间可以发挥外源载体的作用。例如，用棉花的内生菌作为载体，对苏云金芽胞杆菌基因进行转移，实现对玉米茎蛀虫和棉花蚜虫防治工程菌的构建，然后再向不同的作物中定殖该工程菌实现生物防治71。此外，目前分离出具有强化植物修复潜力的内生菌遍布多个菌属，使用内生菌定殖还能降低土壤中的重金属含量。Li等72将苏丹草的内生菌根定殖到苏丹高粱后，增加了宿主植物 49%95%的铜吸收量，且 83%86%的铜富集在植物根部，能够显著降低土壤的铜含量，从而实现对根际土壤中铜的更大利用。21世纪以来，随着生物检测技术和微生物学的高速发展，内生菌定殖检测方法更加精确化和多样化，内生菌定殖应用也更加广泛。但是在实际生产中依旧需要注意许多问题，例如作物的微生态环境是否适合目标菌株生存、目标菌株特定功能的稳定性以及宿主的栽培条件方式是否影响定殖等。同时还需深入研究目标菌株与植物的有益互作以及是否会在正常条件或恶劣环境下产生有害互作。61生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology4展望近年来，有关内生菌研究的文献众多，涵盖生物学、生物多样性、植物功能、植物生理、潜在价值优化等诸多方面，但是少有研究提供内生菌定殖的微观机理、动态过程、宿主反应、信号分子等内容。内生菌确实影响宿主的生长、拮抗病原菌以及产生对人类有价值的次生代谢物，但是分离获得的大部分内生菌由于在实际环境中营养条件不足和生长缓慢等原因无法稳定存活与繁殖。此外，内生菌在定殖过程易受栽培条件与定殖方式影响，这使得定殖菌与宿主植物之间互作机理研究更加困难。因此，结合包括高通量测序、转基因标记、特异性寡核苷酸标记、qPCR等多种新型检测技术，能够有效探究二者互作过程中的宿主反应，掌握内生菌的定殖过程，捕捉定殖效益功能基因。未来关于定殖研究工作可以从以下4个方面展开：筛选有益内生菌，选择匹配的宿主与侵染方式，结合实际应用；利用分子技术，研究调控定殖过程的行为基因、代谢方式与互作机制；结合生理学与分子生物学，预测定殖菌与宿主的交互作用，优化田间定殖，推动菌剂商业化发展；开发多种内生菌组合，应用组合定殖宿主，探究宿主内各菌种如何发挥效应、如何迁移分布、如何联合代谢，构建宿主内新型微生物群落。这些问题的解决能够加速内生菌定殖在实际生产上的应用，将定殖内生菌发展为一种具有特定功能的生物接种剂，在防治病虫害、促进生产、保护环境等方面做出贡献，实现现代化农业的持续发展和成功转型。相信随着内生菌定殖研究的逐渐发展，内生菌定殖相关的应用将远不止生物防治、促生、污染修复等方面，内生菌定殖有望作为一种绿色的方法在实践中得到更多推广。参考文献 1 TRIVEDI P,LEACH J E,TRINGE S G,et al.Plant-microbiome interactions:from community assembly to plant healthJ.Nat.Rev.Microbiol.,2020,18(11):607-621.2 AFZAL I,SHINWARI Z K,SIKANDAR S,et al.Plant beneficial endophytic bacteria:mechanisms,diversity,host range and genetic determinantsJ.Microbiol.Res.,2019,221:36-49.3 NAIK B 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