硬毛粗盖孔菌多糖分级醇沉及抗氧化活性研究_徐晓丹.pdf

硬毛粗盖孔菌多糖分级醇沉及抗氧化活性研究徐晓丹，郑雯月，武笛，樊婉，冀伟（长春理工大学生命科学技术学院，长春130022）摘要：通过对硬毛粗盖孔菌进行液体发酵培养获得菌丝，以冻干菌丝为原料，采用超声辅助热水法提取多糖。用不同终浓度的乙醇溶液（40%、60%和 80%）进行沉淀，分别得到（FCP-40、FCP-60 和 FCP-80）3 个组分。同时，运用不同方法对其化学组成、结构特征和抗氧化活性进行了探究。结果表明，3 个组分的多糖均含有核酸和蛋白质，其中 FCP-40的总糖含量最高，FCP-80 的蛋白质含量最高。不同醇沉组分多糖均含有较长侧链和较多分支且都是三螺旋多糖。3种多糖均具有剂量依赖性的抗氧化活性，且羟基（OH）清除能力相较 DPPH 自由基清除能力而言效果更显著。关键词：硬毛粗盖孔菌；多糖；分级醇沉；结构表征；抗氧化中图分类号：Q819文献标志码：A文章编号：1672-9870（2023）01-0094-08Ethanol Graded Precipitation and Antioxidant Activityof Polysaccharides from Funalia TrogiiXU Xiaodan，ZHENG Wenyue，WU Di，FAN Wan，JI Wei（School of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）Abstract：Mycelium was obtained by liquid fermentation culture of Funalia trogii，and polysaccharides were extracted byultrasound-assisted hot water method using freeze-dried mycelium as raw material.Precipitation with ethanol solutions ofdifferent final concentrations（40%，60%and 80%）into three fractions（FCP-40，FCP-60 and FCP-80）respectively.Thechemical composition，structural characteristics and antioxidant activity were also investigated using different methods.Theresults showed that all three polysaccharide fractions contained nucleic acids and proteins，with the highest total sugarcontent in the FCP-40 and the highest protein content in the FCP-80.All three polysaccharides are contain longer sidechains and more branches and are triple helix polysaccharides.All three polysaccharides have dose-dependent antioxidantactivity and are more effective in scavenging hydroxyl groups than DPPH radicals.Key words：funalia trogii；polysaccharide；ethanol graded precipitation；structural characterization；antioxidant activity全世界人口预期寿命的增加和随之而来的老龄化问题，极大提高了人们对健康以及延缓衰老可能性的关注。活性氧（ROS）和自由基是人体正常代谢过程中产生的一种物质，它们在环境应激条件下，往往会导致组织损伤和疾病1。因此，人们通常使用外来抗氧化剂来减少自由基对人体的伤害。人工合成的抗氧化剂，如丁基羟基苯唑和丁基羟基甲苯，已在食品防腐和化妆品等领域广泛应用，但它们会通过在体内的蓄积提高患癌风险2。天然抗氧化剂可以帮徐晓丹，等：硬毛粗盖孔菌多糖分级醇沉及抗氧化活性研究收稿日期：2022-07-13基金项目：吉林省教育厅“十三五”科学技术项目（JJKH20190559）作者简介：徐晓丹（1995-），女，硕士研究生，E-mail：通讯作者：冀伟（1980-），男，博士，副教授，E-mail：长春理工大学学报（自然科学版）Journal of Changchun University of Science and Technology（Natural Science Edition）Vol.46No.1Feb.2023第46卷第1期2023年2月助人们预防心脏病和癌症等多种疾病，还能延缓衰老。所以，近年来药用食用菌已成为开发天然抗氧化剂的研究热点之一3。多孔菌含有天然抗氧化剂成分，是一类具有很高药用价值的真菌，被认为是菌类中生物活性物质的主要来源。多孔菌中的生物活性成分主要包括多糖、萜类、甾类和酚类等4。硬毛粗盖孔菌（Funalia trogii）隶属于多孔菌目（Polyporales），多孔菌科（Polyporaceae），粗毛盖菌属（Funalia）5。硬毛粗盖孔菌是一种白腐真菌，含有钙、镁、铁等无机元素以及多糖等营养成分6。在近年来的国内外研究中，已发现硬毛粗盖孔菌粗提物在药理方面具有抗氧化作用，抗肿瘤细胞毒性等生物活性7，多糖是其主要活性成分之一8。多糖是由相同或不同的单糖与不同的糖苷键连接在一起形成的一种大分子物质，它们广泛分布于植物、藻类、动物、真菌和细菌中9。多糖因其独特的理化性质和较高的生物学活性在食品、医药、石油、化工等领域得到了广泛的应用10。目前为止，已鉴定出数千种多糖，而这些多糖在应用于生物体时几乎没有毒性和副作用11。近年来有报道证实多糖具有抗肿瘤12、抗氧化13和免疫调节14等多种生物活性。多糖的生物活性与许多因素紧密相关。有报道表明，具有三螺旋构象的多糖表现出较强的抗氧化活性15。目前，硬毛粗盖孔菌胞外多糖的结构和抗氧化活性已有报道16。然而，还没有对液体发酵硬毛粗盖孔菌胞内多糖进行研究的报道。因此，本课题创新性地研究了用不同终浓度乙醇分级沉淀不同组分（FCP-40、FCP-60、FCP-80）多糖的理化性质、结构表征、抗氧化活性。通过比较不同多糖组分的 DPPH 自由基清除能力、OH自由基清除能力，发现硬毛粗盖孔菌多糖具有较高的抗氧化能力。1实验材料硬毛粗盖孔菌由吉林农业大学获得，1，1-二苯 基-2-三 硝 基 苯 肼（DPPH）、牛 血 清 白 蛋 白（BSA）、考马斯亮蓝 G250 均由北京索莱宝公司购买；铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、碘化钾、碘、刚果红、氢氧化钠、浓硫酸、磷酸、苯酚、麦芽糖、胰蛋白胨、磷酸二氢钾、葡萄糖、琼脂、新鲜土豆、乙醇均由天津兴复科技有限公司购买。所用化学试剂均为分析纯。2实验方法2.1硬毛粗盖孔菌的培养菌株活化：在经过紫外灯灭菌后的超净台上，将硬毛粗盖孔菌转接到新的马铃薯葡萄糖琼 脂（PDA）培 养 基 上，在 28 条 件 下，培 养 7天，使菌丝均匀长满平板，如图 1（a）所示。液体发酵培养：在超净工作台的台上取边长0.5 cm 左右大小的菌块（4 块）接入装有 100 mL马铃薯葡萄糖液体（PDB）培养基的 250 mL 锥形瓶中，置于恒温培养箱中，28、150 r/min 培养 5天，将培养物按 10%接种量接入 pH 为 6 的液体发酵培养基（50 g 麦芽糖、5 g 胰蛋白胨、1.2 g 磷酸二氢钾）中，在 28、150 r/min 恒温摇床中培养 7 天，如图 1（b）所示。（a）菌株活化（b）液体发酵培养图 1硬毛粗盖孔菌菌株活化和液体发酵培养徐晓丹，等：硬毛粗盖孔菌多糖分级醇沉及抗氧化活性研究第1期95长春理工大学学报（自然科学版）2023年2.2分级醇沉硬毛粗盖孔菌多糖发酵液在 8 000 r/min 下离心 10 min，冷冻干燥菌丝，将干燥的菌丝进行超声提取（超声温度77，超声功率 335 W，料液比 126，提取时间31 min，提取 2 次），提取液在 4 000 r/min 下离心10 min 取上清，加入乙醇，使其终浓度 40%，4 醇沉过夜，离心（6 000 r/min、10 min）取沉淀，冷冻干燥，即得多糖 FCP-40。收集上清，继续添加乙醇至其终浓度为 60%和 80%，得到多糖 FCP-60和 FCP-80。2.3总糖和蛋白质含量的测定采用改进苯酚-硫酸法17测定总糖含量。采用考马斯亮蓝法18测定蛋白质含量。2.4紫外可见光谱分析将 FCP-40、FCP-60 和 FCP-80 配制成浓度为1 mg/mL 的多糖溶液，采用紫外-可见分光光度计 对 3 种 硬 毛 粗 盖 孔 菌 多 糖 分 级 醇 沉 组 分 在200400 nm 处进行紫外光谱扫描。2.5I2-KI 分析称取多糖样品 2 mg，溶于 2 mL 蒸馏水，加入1.2 mL 碘试剂（含 0.02%I2的 0.2%KI 溶液），混匀后，20 静置 15 min，确保其充分反应。使用紫外分光光度计在 300700 nm 处测定混合物的吸光度。2.6刚果红分析将样品（2 mL，1 mg/mL）与刚果红溶液（2 mL，80 mol/L）混 合，加 入 1mol/L 的 NaOH，使 溶 液NaOH终浓度为00.5 mol/L，在室温下反应10 min，充分混匀后用紫外可见记录光谱仪在300700 nm处进行扫描。记录最大吸收波长变化。2.7-消去反应称取不同组分多糖，加入 0.2 mol/L 的 NaOH配制成 0.2 g/L 的多糖溶液，以蒸馏水作为空白对照，于 45 反应 3 h 后进行紫外光谱扫描。2.8羟基自由基清除活性测定将 50 L 溶解在去离子水（0.1252 mg/mL）中的多糖与 50 L 水杨酸钠（6 mmol/L）、50 L硫酸亚铁（6 mmol/L）和 50 L 过氧化氢（0.025%）混合后于 37 下孵育 30 min。待反应结束后在510 nm 处测其吸光度为Ai，用蒸馏水取代样品溶液测得A0，用蒸馏水代替双氧水溶液测得吸光度Aj。以Vc为阳性对照。对羟基自由基的清除活性用如下式计算：OH 清除率（%）=1-（Ai-Aj）/A0 100%（1）2.9DPPH 自由基清除活性测定用 50%乙 醇 将 DPPH 配 制 成 0.2 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液，将其置于冰箱中保存。将多糖溶于一定蒸馏水中，配制（0.1252 mg/mL）多糖溶液，取 100 L 多糖溶液，分别加入 100 L 0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液，混匀后避光静置30 min，然后在 517 nm 下测其吸光度为Ai。用蒸馏水代替多糖溶液为空白对照，测定的吸光度为A0，用无水乙醇代替 DPPH 乙醇溶液测得吸光度Aj，Vc同样处理作为阳性对照。DPPH 自由基清除率按下列公式计算：DPPH 清除率（%）=1-（Ai-Aj）/A0 100%（2）2.10总抗氧化能力测定配制（0.1252 mg/mL）多糖溶液，置于冰箱中保存备用。将 1.0 mL 的磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH=6.6）和 1 mL 浓度为 1%的铁氰化钾溶液加入装有 1.0 mL 不同浓度多糖溶液的试管中，将试管在 50 水浴中振荡 20 min 使其混合均匀，取出后冷却。然后，加入 1 mL 浓度为 10%的三氯乙酸溶液，于离心机中 3 000 r/min 离心 10 min，收集上清液加入 1 mL 蒸馏水和 0.2 mL 浓度为 0.1%的三氯化铁溶液，室温下静置 10 min 后在 700nm 处测其吸光度。Vc同样处理作为阳性对照。2.11数据分析采 用 Origin 2018 和 GraphPad Prism 8.0 软 件对数据进行处理和作图，采用 GraphPad Prism 8.096进行所有统计分析。数据结果以平均值标准差（MeanSD）表示。3结果与分析3.1总糖和蛋白质含量葡萄糖标准曲线：将干燥葡萄糖配制成 0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL 的葡萄糖标准溶液，采用苯酚-硫酸法测定其在 490 nm 处的吸光度。通过实验发现：葡萄糖浓度在 0.020.1 mg/mL范围内遵守比尔定律，得到吸光度Y与浓度X（mg/mL）的线性回归方程为Y=9.416 7X-0.003，相关系数R2=0.999 3。牛血清蛋白标准曲线：将干燥牛血清蛋白配制成 0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL 的牛血清蛋白标准溶液，采用考马斯亮蓝法测定其在 595 nm处 的 吸 光 度。通 过 实 验 发 现：蛋 白 质 浓 度 在0.020.1 mg/mL 范围内遵守比尔定律，得到吸光度Y与 浓 度X（mg/mL）的 线 性 回 归 方 程 为Y=6.098X+0.023 1，相关系数R2=0.995 5。乙醇可以通过降低多糖水溶液的介电常数，减少多糖与水的作用，从而使多糖聚合沉淀，不同浓度的乙醇可沉淀出不同的多糖19。通过超声辅助热水法提取和分级醇沉后，不同组分硬毛粗盖孔菌多糖的总糖含量和蛋白质含量如表1 所示，3 种醇沉组分的总糖含量由高到低的顺序 为 FCP-40FCP-60FCP-80，其 中，FCP-40 的总 糖 含 量 高 达 75.74%。蛋 白 质 含 量 的 顺 序 为FCP-80FCP-60FCP-40，其中，FCP-80和 FCP-60的蛋白质含量较高，且 FCP-80 最高，含量达到17.95%，而 FCP-40 含 量 仅 为 6.62%。FCP-40 和其他两种组分多糖的化学成分之间存在显著性差异。表 1不同组分多糖总糖和蛋白质含量醇沉组分FCP-40FCP-60FCP-80总糖含量/%75.740.13a36.650.07b35.280.06b蛋白质含量/%6.620.15b15.360.17a17.950.19a注：同列数据不同小写字母表示差异显著（P0.05）。3.2UV 分析根据之前的研究20，在 260 nm 和 280 nm 附近出现吸收峰，表明有核酸和蛋白质存在。如图 2 所示，紫外-可见扫描光谱显示，FCP-40 在260 nm 和 280 nm 处有上升趋势但均无明显吸收峰，说明 FCP-40 含有少量核酸和蛋白。FCP-60和 FCP-80 在 260 nm 和 280 nm 处均有明显吸收峰，表明它们含有比 FCP-40 更多的核酸和蛋白质。这与多糖的化学成分分析（表 1）结果一致。图 2多糖紫外光谱3.3I2-KI 分析I2-KI 反应结果（图 3）表明，最大吸收峰主要集中在 350 nm 附近，565 nm 处没有吸收峰，说明多糖存在较长的侧链和较多的分支21。此外，多糖和碘试剂反应，溶液无明显变化也表明多糖中不含淀粉。图 3多糖与I2-KI反应物紫外光谱3.4刚果红分析研究表明，多糖的三螺旋结构对其生物活性徐晓丹，等：硬毛粗盖孔菌多糖分级醇沉及抗氧化活性研究第1期97长春理工大学学报（自然科学版）2023年非常重要22。具有三螺旋结构的多糖样品在弱碱性条件下可以与刚果红形成配合物。与刚果红相比，它的紫外吸收会发生红移。但随着氢氧化钠浓度的增加，多糖分子之间的氢键会断裂，三螺旋结构分解为单链，不能与刚果红形成配合物，导致max迅速下降。FCP-40、FCP-60 和 FCP-80 的刚果红反应结果如图 4 所示，在弱碱性条件下，多糖溶液与刚果红反应物的max值与刚果红相比有明显的红移。这表明 FCP-40、FCP-60 和 FCP-80 均包含三螺旋结构。图 4多糖-刚果红复合物的最大吸收波长变化3.5-消去反应多糖与蛋白质中某一肽段的连接是蛋白聚糖的重要结构特征。目前发现的连接方式中，主要分为两种：一种是糖链与天冬酰胺连接（N-型糖苷键连接）；另一种是与丝氨酸或苏氨酸连接（O-型糖苷键连接）23。-消去反应是一种简易快速检测糖蛋白的方法。在弱碱条件下，O-型糖苷键能发生-消去反应，与糖链连接的丝氨酸、苏氨酸分别转化成-氨基丙烯酸、-氨基丁烯酸，这些不饱和氨基酸在 240 nm 处会出现明显紫外吸收峰，而与天冬酰胺连接的 N-型糖苷键则不会发生这样的变化。FCP-40（图5）经 NaOH 处理后在 240 nm 处没有明显变化，可能是因为蛋白质含量较少或蛋白与糖链的连接方式为 N-型糖苷键连接。FCP-60（图 6）和 FCP-80（图 7）经 NaOH 处理后在 240 nm 处有明显上升趋势，其蛋白和糖链的连接方式为 O-型糖苷键连接。图 50.2 mol/L NaOH 处理前后 FCP-40 紫外光谱图 60.2 mol/L NaOH 处理前后 FCP-60 紫外光谱图 70.2 mol/L NaOH 处理前后 FCP-80 紫外光谱3.6羟基自由基清除活性分析羟基自由基被认为是最活跃、最危险的自由基之一，它可以攻击活细胞中的生物分子，如氨基酸、脂质和核酸，诱导细胞凋亡。因此，羟基自由基的消除对于细胞或食物系统中的抗氧化98是至关重要的24。Geng L16发现硬毛粗盖孔菌胞外粗多糖浓度为 2 mg/mL 时，羟基清除能力仅为 14.13%。而在该研究中（图 8），当浓度为 2 mg/mL 时，FCP-40、FCP-60 和 FCP-80 的羟基清除能力 分 别 为 40.58%、55.72%和 60.66%。总 体 上，FCP-60 和 FCP-80 组分对羟基自由基的清除能力明显高于 FCP-40 组分，且 FCP-80 组分的羟基自由基的清除能力最好，最高清除率为60.66%。图 8羟基自由基清除能力3.7DPPH 自由基清除活性分析DPPH 是一种由稳定的自由基分子组成的结晶粉末。在实验室中，经常被用于检测涉及自由基的化学反应，评价各种物质的抗氧化活性。如图 9 所示，在剂量范围（0.1252 mg/mL）内，3种多糖组分的 DPPH 自由基清除活性缓慢增加。其中 FCP-60 和 FCP-80 组分具有较高的 DPPH 自由基清除活性。天然活性化合物（抗氧化剂）对DPPH 自由基清除活性与其供氢能力有关，结果表明硬毛粗盖孔菌多糖有供氢能力，进而发挥自由基清除活性。图 9DPPH 自由基清除能力3.8总抗氧化能力分析多糖的还原能力与它的总抗氧化活性有关，还原能力越强，其总抗氧化能力就越强。因此，测定多糖的还原能力可以间接比较其抗氧化能力。还原剂主要通过自身电子清除自由基，起到还原作用，可将 Fe3+还原为 Fe2+，然后与铁氰化钾溶液反应形成普鲁士蓝，该产物在 700 nm 处有特殊吸光度，且吸光度越高，还原能力越强。如图 10 所示，3 个多糖组分的还原能力随浓度的增加均呈增长趋势。FCP-40、FCP-60 和 FCP-80组分在 700 nm 处的最高吸光度分别为 0.818 3、1.045 1 和 1.272 2，而相同浓度下，Vc的还原能力远远高于多糖的还原能力。图 10总抗氧化能力4结论本研究采用液体发酵方法获得硬毛粗盖孔菌菌丝，通过超声辅助热水法提取多糖，将提取液分别用不同终浓度乙醇进行沉淀，得到（FCP-40、FCP-60 和 FCP-80）3 个组分。同时，运用不同方法对其化学成分、结构特征和抗氧化活性进行了探究。不同醇沉组分多糖的总糖含量随乙醇体积增大而降低，蛋白质含量随乙醇体积增 大 而 升 高。结 果 表 明，FCP-40、FCP-60 和FCP-80 总糖含量分别为 75.74%、36.65%、35.28%；蛋白质含量分别为 6.62%、15.36%、17.95%。由紫外 光 谱 分 析 结 果 可 知，FCP-60 和 FCP-80 相 对FCP-40 含有较多核酸和蛋白质。I2-KI 分析结果表明，3 种多糖均不含淀粉且含有较长侧链和较徐晓丹，等：硬毛粗盖孔菌多糖分级醇沉及抗氧化活性研究第1期99长春理工大学学报（自然科学版）2023年多分支。由刚果红分析结果可知，3 种多糖均含有三螺旋结构，FCP-60 和 FCP-80 较 FCP-40 发生更明显红移现象。-消去反应表明，多糖中含有的蛋白质与其连接方式为 O-型糖苷键连接。乙醇浓度越高，沉淀出来的多糖分子量越小。通过比较不同醇沉组分多糖的抗氧化活性发现，3 种多糖均具有剂量依赖性的抗氧化活性且清除OH 能力相较 DPPH 自由基清除能力而言效果更显著。此外，随着乙醇体积分数的增加，清除OH 和 DPPH 自由基的能力也逐渐增强。研究结果表明运用该方法能得到不同醇沉组分的多糖，并通过不同分析方法可以筛选出抗氧化活性较高的组分，这为硬毛粗盖孔菌多糖的研究和开发提供了一定的理论依据。总体而言，硬毛粗盖孔菌多糖具有一定抗氧化活性，可以作为一种潜在的抗氧化剂。参考文献1HAO L，SHENG Z，LU J，et al.Characterization andantioxidant activities of extracellular and intracellularpolysaccharides from Fomitopsis pinicolaJ.Carbohydrate Polymers，2016（141）：54-59.2PARK M，KIM M.Analysis of antioxidant and anti-inflammatory activities of solvent fractions from rhynchosia nulubilis cultivated with ganoderma lucidum 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