细菌脂多糖对猪圆环病毒2型...PK-15细胞中复制的影响_张歆明.pdf

动物医学进展,2 0 2 3,4 4(2):2 4-2 9P r o g r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e细菌脂多糖对猪圆环病毒2型在P K-1 5细胞中复制的影响 收稿日期:2 0 2 2-0 1-2 2 基金项目:广东省重点领域研究计划项目(2 0 1 9 B 0 2 0 2 1 1 0 0 3)作者简介:张歆明(1 9 9 7-),男,安徽淮北人,硕士研究生,主要从事病原分子生物学研究。*通讯作者张歆明1,2,徐 舸1,2,郑钦生3,刘献辉1,2,张鹏飞1,2,王爽云1,2,张乐宜1,2,刘燕玲1,2,宋长绪1,2*(1.华南农业大学国家生猪种业工程技术研究中心,广东广州5 1 0 0 0 0;2.岭南现代农业科学与技术广东省实验室,广东广州5 1 0 0 0 0;3.华南农业大学食品学院,广东广州5 1 0 0 0 0)摘 要:研究脂多糖(L P S)对P C V 2在P K-1 5细胞复制的影响,并探究其内在机制。用不同来源的L P S刺激感染P C V 2的P K-1 5细胞,实时荧光定量P C R检测不同时间点对病毒复制的影响,以及N F-B信号通路相关分子表达水平,吸附试验验证L P S对P C V 2感染过程的影响,用P y m o l软件对P C V 2衣壳蛋白与L P S进行分子对接。结果表明,L P S刺激P K-1 5细胞1 2h抑制P C V 2的复制,而刺激2 4h和4 8h促进P C V 2的复制,L P S还可以抑制P C V 2病毒的吸附过程。对L P S与P C V 2的C a p蛋白进行结构功能预测,发现二者有多处结合位点,表明L P S可能通过与P C V 2核衣壳蛋白直接作用抑制P C V 2与受体结合影响病毒前期吸附过程。后期L P S通过激活T L R 4/N F-B信号通路,促进I F N-的表达,使病毒复制滴度增加。说明L P S对P C V 2的复制存在双重影响,总体上促进P C V 2的复制。关键词:脂多糖;猪圆环病毒2型;吸附;核因子 B;干扰素中图分类号:S 8 5 2.6 5 9.2文献标识码:A文章编号:1 0 0 7-5 0 3 8(2 0 2 3)0 2-0 0 2 4-0 6 猪圆环病毒2型(P o r c i n ec i r c o v i r u s2,P C V 2)是一种小的无襄膜的单链环状D NA病毒1。主要引起“猪圆环病毒相关疾病”(P o r c i n ec i r c o v i r u s-a s-s o c i a t e dd i s e a s e s,P C VA D),该病的主要临床症状表现为仔猪断奶后多系统衰竭综合征(P o s tw e a n i n gm u l t i s y s t e m i cw a s t i n gs y n d r o m e,PMWS)、猪皮炎与肾病综合征(P o r c i n ed e r m a t i t i sa n dn e p h r o p a t h ys y n d r o m e,P D N S)和繁殖障碍相关疾病,虽然针对P C V 2的多种疫苗已经被广泛使用,但是由于其复杂的免疫逃逸机制和变异株的不断产生,致使病毒很难被有效的防控,对全世界养猪业都造成严重的影响。P C V 2经常与许多致病菌和病毒共感染,而且与单独感染相比,共感染表现出更加严重临床症状。有研究表明,P C V 2单独攻毒时是很难出现典型的病理症状,但是在与其他病原体如猪繁殖与呼吸综合征病毒(P R R S V)2、猪细小病毒(P P V)3、猪肺炎支原体(M y c o p l a s m a lh y o p n e u m o n i a)4,以及其他致病细菌混合感染或使用免疫刺激因子都会诱导严重的PMWS,这表明免疫刺激辅助因素对P C V 2致病性是至关重要的5。细菌脂多糖(l i p o o l y s a c c h a r i d e,L P S)存在于革兰氏阴性菌的外膜,一般在细菌死亡后脱落下来发挥毒性作用,是免疫系统最有效的诱导因子之一6。其与细胞复杂的“模式识别受体”级联识别,主要与T o l l样受体4(T L R 4)-MD 2复合物结合,由L P S结合蛋白(L B P)和C D 1 4共同催化,激活多种细胞内信号通路7。有报道称L P S激活N F-B信号通路,诱导白细胞介素(I L)-1、I L-2、I L-8,干扰素(I F N)-和肿瘤坏死因子(T N F)-8的产生。而N F-B调节多种基因参与免疫和急性期炎症反应和细胞生存。N F-B信号通路的激活以及I F N-的产生均可以促进P C V 2的复制9-1 1。还有研究表明I L-2过表达后也可以促进P C V 2的复制1 2。因此,刺激猪免疫系统会诱导干扰素和白介素产生可能是导致P C V 2在体内复制增加的关键,而理论上L P S可能是通过激活N F-B信号通路,致使免疫系统激活,促进I F N-产生导致P C V 2复制的增加。然而,我们研究发现L P S对P C V 2复制的影响具有双重效果。本文研究L P S对P C V 2复制的影响,发现L P S的确可以显著激活N F-B信号通路,促进I F N-和I L-2的表达,从而促进P C V 2的复制,值得注意的是,研究发现L P S处理前期是抑制P C V 2复制的,DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.02.022深入研究表明L P S抑制P C V 2的吸附,阻止P C V 2进入细胞,而后期随着I F N-的产生,病毒滴度又显著升高。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 病毒和细胞 P C V 2病毒,P K-1 5细胞,华南农业大学国家生猪种业工程技术研究中心猪病防控实验室保存。1.1.2 试剂 L P S(大肠埃希氏菌),上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品;L P S(沙门氏菌),上海善然生物科技有限公司产品;干扰素,武汉云克隆科技股份有限公司产品;高糖DMEM培养基,胎牛血清,赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品;双荧光报告基因试剂盒,上海碧云天生物技术有限公司产品;C C K-8细胞增殖及毒性检测试剂盒,MC E公司产品;病毒总核酸快速抽提试剂盒,广州美基生物科技有限公司产品;S t e a d y P u r e通用型R NA提取试剂盒,E v oM-ML V反转录试剂预混液,湖南艾科瑞生物 工 程 有 限 公 司;E a s t e pq P C R M a s t e r M i x(2 X),普洛麦格(北京)生物技术有限公司产品。1.1.3 主要仪器 荧光定量P C R检测仪,美国应用生物系统公司产品;细胞培养箱,赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品;高速冷冻离心机,德国艾本德公司产品。1.2 方法1.2.1 引物设计与合成 从G e n B a n k数据库中下载各基因序列,并用P r i m e r5生物软件设计,在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列和G e n B a n k序列号见表1。表1 引物序列T a b l e1 P r i m e r s e q u e n c e s项目I t e m基因序列G e n es e q u e n c eG e n B a n k登录号G e n B a n kN o.P C V 2C a pFg a g c a g g g c c a g a a t t c a a cMN 6 5 3 2 1 2.1P C V 2C a pRa a a a c c a c a g t c a g a a c g c cT L R 4Fc a g c t t t c c a g a a c t g c a g gE U 7 1 6 4 1 3.1T L R 4Rt t t g t c t c a a c g g c a a c c a gTN F Fg c c t c t t c t c c t t c c t c c t gJ F 8 3 1 3 6 5.1T N F Rg c a t a c c c a c t c t g c c a t t gI L-2Fc a g c t c t t g t g t t g c a t t g c aF J 5 4 3 1 0 9.1I L-2Ra g c a t c c t g g a g a g a t c a g cI L-8Fg g a a a a g t g g g t g c a g a a g gNM-2 1 3 8 6 7.1I L-8Ra c c c t a t g t c t g a c c a g c a cI F N-Ft c c a c c a c a g c t c t t t c c a tNM-0 0 1 0 0 3 9 2 3.1I F N-Rc t g g a a t t g t g g t g g t t g c aA C T I NFc c a c t g g c a t t g t c a t g g a cE U 6 5 5 6 2 8.1A C T I NRa t c t c c t g c t c g a a g t c c a g1.2.2 P K-1 5细胞培养 从液氮中取出冻存的P K-1 5细胞,3 7迅速水浴回温,离心丢弃冻存液,加入1 0 0g/LF B S高糖DMEM培养基,置于3 7、体积分数为5%C O2培养箱进行培养,待细胞长满后进行传代。细胞传代,首先弃瓶内的培养基,用已灭菌的P B S缓冲液清洗细胞3次,加入2.5g/L胰酶进行消化,待细胞脱落后按照13比例传代,多余细胞可进行后续细胞试验。1.2.3 P C V 2病毒接种 待细胞长至8 0%9 0%时进行P C V 2病毒接种,用2 0g/LF B S高糖DMEM培养基稀释病毒(MO I=1的病毒感染剂量),将病毒液完全均匀覆盖细胞表面,放入3 7、体积分数为5%C O2培养箱进行孵育1h,随后用P B S缓冲液润洗3次,换成新鲜2 0g/LF B S高糖DMEM培养基维持液继续培养。1.2.4 L P S对P K-1 5细胞活力试验 用C C K-8试剂盒进行L P S细胞毒力检测,操作方法严格按照产品说明书进行,将细胞铺到9 6孔板中,待细胞长至9 0%时,使用不同浓度的L P S(5 0、1 0 0、2 0 0、5 0 0、10 0 0、20 0 0n g/m L)进行刺激,孵育2 4h后,加入C C K-8试剂,3 7孵育1h,用酶标仪在4 5 0n m测定吸光度,对结果进行分析。1.2.5 病毒吸附和内化试验 将长至9 0%的细胞放入4预冷3 0m i n,丢弃原有培养基,进行接毒,放入4环境中2h,用提前预冷的P B S培养基进行润洗3遍,清除未吸附的病毒粒子,使用病毒核酸提取试剂盒提取核酸,实时荧光定量P C R检测吸附结果。用不同处理对病毒吸附影响试验,处理1:用5 0 0n g/m L的L P S在3 7孵育细胞1h后,P B S润洗3遍后进行吸附试验;处理2:用5 0n g/m L的L P S与P C V 2病毒孵育1h后,加入细胞中4孵育1h;处理3:用5 0 0n g/m L的L P S与P C V 2病毒孵育1h后,加入细胞中4孵育1h,用实时荧光定量P C R检测病毒拷贝数,分析试验结果。1.2.6 双荧光报告基因检测 构建靶向N F-B和I F N-基因的启动子基因序列连接到p G L 3-b a s i c质粒荧光素酶表达质粒上,成功得到p G L 3-b a s i c-N F-B和p G L 3-b a s i c-I F N-质粒,待P K-1 5细胞密度在6 0%时,将转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染细胞内,2 4h后用5 0 0n g/m LL P S刺激细胞,收集1 2h、2 4h和4 8h的细胞样品,加入裂解液冰浴5m i n,充分离心去细胞上清液备用,配制萤火虫荧光素酶反应工作液和海肾荧光素酶反应液,各取1 0 0L先后加入到2 0L细胞裂解液中,充分振荡混匀,反应5m i n后,分别在5 6 0n m和4 6 5n m波长52张歆明等:细菌脂多糖对猪圆环病毒2型在P K-1 5细胞中复制的影响采集荧光信号,分析试验结果。1.2.7 实时荧光定量P C R检测 将待测细胞培养液吸出,P B S缓冲液润洗2遍,加入适量的细胞裂解液,随后按照动物细胞R NA提取试剂盒操作步骤进行操作,提取细胞R NA,使用E v oM-ML V反转录试剂盒进行反转录(1 0L的体系:5 E v o M-ML V R T M a s t e rM i x2L,总R NA5 0 0n g,无核酸酶水加至1 0L,3 7 1 5m i n,8 5 5s),反转录产物作为定量检测模板,配制定量体系,总体系2 0L(E a s t e pq P C R M a s t e rM i x2 1 0L,D NA模板2L,上游引物0.4L,下游引物0.4L,无核酸酶水7.2L,9 5 2 m i n,4 0个循环,9 5 1 5s,6 05 0s),放入定量P C R仪中进行扩增,分析结果。2 结果2.1 L P S在对P C V 2在P K-1 5细胞复制的影响L P S对P K-1 5细胞毒性试验结果见图1,仅在20 0 0n g/m L时沙门氏菌来源的L P S出现细胞毒性,其他浓度均无明显的细胞毒性。随后用安全浓度为5 0 0n g/m L的来源于大肠埃希氏菌和沙门氏菌的L P S处理细胞,验证不同时间对P C V 2复制情况的影响(图2),从P C V 2的C a p基因的相对表达量来看,接毒后1 2h,L P S均显著抑制了P C V 2的复制,而2 4h和4 8h又显著促进了P C V 2的复制,经3次重复,结果一致。图1 L P S对P K-1 5细胞活性的影响F i g.1 E f f e c to fL P So nP K-1 5c e l l v i a b i l i t y图2 不同时间点L P S对P C V 2在P K-1 5细胞复制的影响F i g.2 E f f e c t so fL P So nP C V 2r e p l i c a t i o n i nP K-1 5c e l l sa td i f f e r e n t t i m ep o i n t s2.2 L P S抑制P C V 2病毒的吸附P C V 2从侵入细胞到复制出新的子代病毒,至少需要1 8h1 3,在1 2h抑制P C V 2复制可通过抑制第1代P C V 2病毒的吸附和内化来实现。本研究吸附试验表明(图3),L P S可以抑制P C V 2病毒的吸附和内化。影响P C V 2吸附存在两种可能,一是L P S直接与P C V 2病毒粒子相互作用,抑制其与受体结合;或者L P S竞争P C V 2的细胞受体发挥作用,为验证L P S的作用,设计不同处理方式(图4),与P C V 2正常孵育细胞相比,用5 0 0n g/m LL P S孵育细胞后接毒组未出现明显差异,而L P S与P C V 2孵育后接毒明显抑制病毒的吸附,并且随着浓度的增加,抑制效果更加明显。表明L P S可能直接与P C V 2病毒有相互作用,抑制病毒与细胞受体相互作用。2.3 P C V 2C a p蛋白与L P S分子对接用P y m o l软件进行分子对接,从U n i p r o t数据库中查询P C V 2蛋白序列,从P u b C h e m数据库中下载L P S分子结构,用P y m o l软件进行预测绘制两者相互作用图。选取亲和力较高的结果进行对接,提示两者存在相互作用的可能,并且具有多处结合位点(图5)。62动物医学进展 2 0 2 3年 第4 4卷 第2期(总第3 5 6期)图3 L P S对P C V 2吸附的影响F i g.3 E f f e c t so fL P So na d s o r p t i o no fP C V 21.对照组;2.处理1;3.处理2;4.处理31.C o n t r o l g r o u p;2.T e s tg r o u p1;3.T e s tg r o u p2;4.T e s tg r o u p3图4 L P S不同处理对P C V 2吸附的影响F i g.4 E f f e c t so fd i f f e r e n t t r e a t m e n t so fL P So nP C V 2a d s o r p t i o n图5 L P S与P C V 2的C a p蛋白分子对接图F i g.5 M o l e c u l a rd o c k i n gd i a g r a mb e t w e e nL P Sa n dP C V 2C a p2.4 L P S促进T L R 4的表达以及N F-B和I F N-基因的转录 L P S是通过T L R 4识别后,激活N F-B信号通路,促进I F N-产生。L P S刺激P K-1 5细胞后显著促进T L R 4的mR NA的表达,而P C V 2感染并不影响其表达量的变化(图6)。双荧光报告基因试验显示(图7),与对照组相比,在L P S刺激和病毒感染后1 2h和2 4h,N F-B转录水平明显增加,在4 8h促进效果不明显;同时I F N-转录水平在各个时间点均有 明 显 提 高,所 以L P S可 以 激 活N F-B和I F N-基因的转录,表明P C V 2和L P S均能激活N F-B信号通路,促进I F N-的转录。图6 L P S促进T L R 4的mR NA表达F i g.6 L P Sp r o m o t e sT L R 4mR NAe x p r e s s i o n l e v e l2.5 I F N-促进P C V 2的复制为了进一步验证L P S后期促进P C V 2的复制与I F N-产生相关,用猪源的5 0 0n g/m LI F N-加入接毒后的P K-1 5细胞培养液中,结果表明,与对照组相比,P C V 2的复制情况在1 2h没有明显差异,2 4h后逐渐显现I F N-促进P C V 2复制,在4 8h促进效果达到2.5倍之多(图8)。3 讨论P C V 2病毒是目前基因组最小的病毒之一1 4,同时也是进化最成功的病毒之一,能充分利用自身遗传 序 列,推 测 至 少 编 码1 1个 开 放 型 阅 读 框(O R F s),其中只有4个用于蛋白质的表达,分别为C a p蛋白、R e p蛋白、O R F 3蛋白和O R F 4蛋白,这些蛋白在满足自身增殖功能的同时,还可以逃避宿主的先天性免疫反应1 5。P C V 2被认为是免疫抑制病原体,感染后会增加感染其他病原的风险1 6。有研究称P C V 2与革兰氏阴性菌等共同感染可能是促进P C V 2复制的重要因素,至少部分地促进了PMWS的全面发展2。临床上P C V 2常与副猪嗜血杆菌、大肠埃希氏菌和沙门氏菌混合感染,并且表现出更加严重的症状,这其中很大程度上在于L P S引起的免疫 系统的激活 有关1 7。尤 其是促进了I F N-和I L-2的表达,可以显著促进P C V 2的复制,深入研究P C V 2病毒可以发现,该病毒有许多异于其他病毒的地方,N F-B信号通路激活是宿主用于清除致病微生物的利刃,但是可以被P C V 2所利用,当该通路受到抑制时,反而抑制了病毒的复制。而且具有抗病毒作用的干扰素(I F N,I F N-,I F N-)及白介素(I L-2)却可以促进病毒的复制1 1,1 8。72张歆明等:细菌脂多糖对猪圆环病毒2型在P K-1 5细胞中复制的影响图7 L P S刺激与P C V 2感染促进N F-B,I F N-基因转录F i g.7 L P Ss t i m u l a t i o na n dP C V 2i n f e c t i o np r o m o t eN F-Ba n dI F N-g e n e t r a n s c r i p t i o n图8 I F N-处理P K-1 5细胞促进P C V 2的复制F i g.8 T r e a t m e n to fP K-1 5c e l l sw i t hI F N-p r o m o t e s t h er e p l i c a t i o no fP C V 2g e n e t r a n s c r i p t i o nL P S作为免疫激活剂,可以激活T L R 4-N F-B信号通路从而促进I F N-产生促进P C V 2在P K-1 5的复制,然而,在本文中发现L P S本身可能与P C V 2蛋白C a p存在相互作用,抑制P C V 2被受体识别,从而达到抑制病毒吸附的效果。而且L P S与P C V 2的C a p蛋白有多处结合位点,为了排除偶然性,用了来自不同细菌的L P S进行试验,重复3次,均发现在1 2h,明显抑制P C V 2的病毒滴度,这与后期的促进现象看似矛盾,却也可以合理的解释:在加入L P S前期,L P S与部分P C V 2病毒粒子相互作用,抑制了部分病毒的吸附作用,而未相互作用的L P S与病毒粒子被相应受体识别,P C V 2完成吸附和内化,释放核酸进行后续的复制,而L P S可以促进T L R 4的表达,并且通过T L R 4激活N F-B等相关信号通路,致使细胞释放多种炎性因子,其中包括I F N-和I L-2等,可 以 促 进P C V 2的 复 制,随 着L P S浓度逐渐降低和失效,后期促进效果明显。另外,L P S与P C V 2的核衣壳蛋白C a p在结构功能预测存在多处结合位点,具体机制还需进一步验证,这一现象也为研发P C V 2抗病毒药物提供思路。本文揭示了L P S对P C V 2复制的影响,提示L P S自身存在抑制P C V 2病毒吸附的功能,这将为开发抗P C V 2病 毒 药 物 提 供 参 考。L P S会 激 活T L R 4-N F-B-I F N-信号通路,促进多种炎性因子的表达,促进P C V 2的复制,提示P C V 2与细菌或其他病毒共感染可能会促进病毒的复制,放大免疫反应,进一步加重临床症状;在构建P C V 2发病模型时,加入L P S作为免疫刺激剂时,要注意引入的顺序和时间。参考文献:1 L V Q,WAN G T,D E N GJ,e ta l.G e n o m i ca n a l y s i so fp o r c i n ec i r c o v i r u s t y p e2f r o ms o u t h e r nC h i n aJ.V e tM e dS c i,2 0 2 0,6(4):8 7 5-8 8 9.2 OUYAN G T,Z HAN G X,L I U X,e ta l.C o-i n f e c t i o no fs w i n ew i t hp o r c i n e c i r c o v i r u s t y p e 2a n do t h e r s w i n ev i r u s e sJ.V i r u-s e s,2 0 1 9,1 1(2).d o i:1 0.3 3 9 0/v 1 1 0 2 0 1 8 5.3 L A GAN T P,S TA I N E S A,GO R D ON A,e ta l.C o-i n f e c t i o ns t a t u so f n o v e l p a r v o v i r u s s(P P V2 t o 4)w i t hp o r c i n e c i r c o v i r-u s2 i np o r c i n er e s p i r a t o r yd i s e a s ec o m p l e xa n dp o r c i n ec i r c o-v i r u s-a s s o c i a t e dd i s e a s ef r o m1 9 9 7t o2 0 1 2J.T r a n s bE m e r gD i s,2 0 2 1,6 8(4):1 9 7 9-1 9 9 4.4 OH T,S UHJ,P A R KKH,e t a l.Ac o m p a r i s o no f p a t h o g e n i c i-t ya n dv i r u l e n c eo ft h r e ep o r c i n ec i r c o v i r u st y p e2(P C V 2)g e n o t y p e s(a,b,a n dd)i np i g ss i n g u l a r l yi n o c u l a t e d w i t hP C V 2a n dd u a l l y i n o c u l a t e dw i t hM y c o p l a s m ah y o p n e u m o n i a ea n dP C V 2J.P a t h o g e n s,2 0 2 1,1 0(8).5 R AK I B U Z Z AMANA,R AMAMOO R THYS.C o m p a r a t i v e i m-m u n o p a t h o g e n e s i sa n db i o l o g yo fr e c e n t l yd i s c o v e r e dp o r c i n ec i r c o v i r u s e sJ.T r a n s bE m e r gD i s,2 0 2 1,6 8(6):2 9 5 7-2 9 6 8.6 L IQ,T ANY,C HE NS,e t a l.I r i s i na l l e v i a t e sL P S-i n d u c e d l i v e ri n j u r ya n d i n f l a mm a t i o nt h r o u g hi n h i b i t i o no fN L R P 3i n f l a m-m a s o m ea n dN F-k a p p a Bs i g n a l i n gJ.JR e c e p tS i g n a lT r a n s-d u c tR e s,2 0 2 1,4 1(3):2 9 4-3 0 3.7 B AO M,HO F S I NKN,P L O S C HT.L P Sv e r s u sP o l y I:Cm o d-e l:c o m p a r i s o no f l o n g-t e r me f f e c t s o f b a c t e r i a l a n dv i r a lm a t e r-n a l i mm u n ea c t i v a t i o no n t h eo f f s p r i n gJ.AmJP h y s i o lR e g u lI n t e g rC o m pP h y s i o l,2 0 2 2,3 2 2(2):R 9 9-R 1 1 1.8 L A I JL,L I UYH,L I UC,e t a l.I n d i r u b i n i n h i b i t sL P S-i n d u c e di n f l a mm a t i o nv i aT L R 4a b r o g a t i o nm e d i a t e db y t h eN F-k Ba n dMA P Ks i g n a l i n gp a t h w a y sJ.I n f l a mm a t i o n,2 0 1 7,4 0(1):1-82动物医学进展 2 0 2 3年 第4 4卷 第2期(总第3 5 6期)1 2.9 HUAN GB,Z HAN GL,L U M,e ta l.P C V 2i n f e c t i o na c t i v a t e st h e c GA S/S T I N Gs i g n a l i n gp a t h w a y t op r o m o t e I F N-b e t ap r o-d u c t i o na n dv i r a l r e p l i c a t i o ni nP K-1 5c e l l sJ.V e tM i c r o b i o l,2 0 1 8,2 2 7:3 4-4 0.1 0 WAN GS,R E NX,L IJ,e ta l.NA P 1 L 4i n h i b i t sp o r c i n ec i r c o-v i r u s t y p e2r e p l i c a t i o nv i aI F N-b e t as i g n a l i n gp a t h w a yJ.V e tM i c r o b i o l,2 0 2 0,2 4 6:1 0 8 6 9 2.1 1 HUAN GB,L IJ,Z HAN GX,e ta l.R I G-1a n dMD A-5s i g n a-l i n gp a t h w a y sc o n t r i b u t et oI F N-b e t ap r o d u c t i o na n dv i r a lr e p l i c a t i o ni np o r c i n ec i r c o v i r u sv i r u st y p e2-i n f e c t e dP K-1 5c e l l si nv i t r oJ.V e tM i c r o b i o l,2 0 1 7,2 1 1:3 6-4 2.1 2 Z HAN GX,Z HAOY,MAC,e t a l.P K 1 5c e l l l i n e s t a b l yo v e r-e x p r e s s i n gI L 2e n h a n c e sP C V 2r e p l i c a t i o nJ.V i r u sG e n e s,2 0 2 1,5 7(1):1 1 1-1 1 6.1 3 Z HA ISL,L USS,WE IW K,e t a l.R e s e r v o i r so f p o r c i n e c i r-c o v i r u s e s:A m i n i r e v i e wJ.F r o n tV e tS c i,2 0 1 9,6:3 1 9.1 4 WAN GY,NO L LL,L U N,e t a l.G e n e t i cd i v e r s i t ya n dp r e v a-l e n c eo f p o r c i n e c i r c o v i r u s t y p e 3(P C V 3)a n d t y p e 2(P C V 2)i nt h e M i d w e s to ft h e U S A d u r i n g2 0 1 6-2 0 1 8J.T r a n s bE m e r gD i s,2 0 2 0,6 7(3):1 2 8 4-1 2 9 4.1 5 R AK I B U Z Z AMAN A,R AMAMOO R THY S.C o m p a r a t i v ei mm u n o p a t h o g e n e s i sa n db i o l o g yo fr e c e n t l yd i s c o v e r e dp o r-c i n ec i r c o v i r u s e sJ.T r a n s bE m e r gD i s,2 0 2 1,6 8(6):2 9 5 7-2 9 6 8.1 6 D uQ,WU X,WAN GT,e ta l.P o r c i n ec i r c o v i r u st y p e2s u p-p r e s s e sI L-1 2 p 4 0i n d u c t i o nv i ac a p s i d/g C 1 q R-m e d i a t e d m i-c r o R NA sa n ds i g n a l i n g sJ.JI mm u n o l,2 0 1 8,2 0 1(2):5 3 3-5 4 7.1 7 S AA D EG,D E B L AN CC,B OUGONJ,e ta l.C o i n f e c t i o n sa n dt h e i rm o l e c u l a rc o n s e q u e n c e s i nt h ep o r c i n er e s p i r a t o r yt r a c tJ.V e tR e s,2 0 2 0,5 1(1):8 0.1 8 HUAN GB,Z HAN GL,L U M,e t a l.P C V 2 i n f e c t i o na c t i v a t e st h ec GA S/S T I N G s i g n a l i n gp a t h w a yt op r o m o t eI F N-b e t ap r o d u c t i o na n dv i r a l r e p l i c a t i o n i nP K-1 5c e l l sJ.V e tM i c r o-b i o l,2 0 1 8,2 2 7:3 4-4 0.E f f e c t so fB a c t e r i a lL i p o p o l y s a c c h a r i d eo nR e p l i c a t i o no fP o r c i n eC i r c o v i r u sT y p e2i nP K-1 5C e l l sZ HANGX i n-m i n g1,2,XUG e1,2,Z HE NGQ i n-s h e n g3,L I UX i n-h u i1,2,Z HANGP e n g-f e i1,2,WANGS h u a n g-y u n1,2,Z HANGL e-y i1,2,L I UY a n-l i n g1,2,S ONGC h a n g-x u1,2(1.N a t i o n a lE n g i n e e r i n gR e s e a r c hC e n t e r f o rS w i n eB r e e d i n gI n d u s t r y,S o u t hC h i n aA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,G u a n g z h o u,G u a n g d o n g,5 1 0 0 0 0,C h i n a;2.G u a n g d o n gP r o v i n c i a lL a b o r a t o r yo fL i n g n a nM o d e r nA g r i c u l t u r a lS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y,G u a n g z h o u,G u a n g d o n g,5 1 0 0 0 0,C h i n a;3.C o l l e g eo fF o o dS