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肠道致病菌的分离与鉴定
一、 实验目的
（1）掌握肠道致病菌的分离、鉴定的主要步骤
（2）掌握平板划线分离法
（3）掌握玻片凝集试验的操作方法以及实际意义
二、 实验材料
（1）实验仪器：试管、玻片、酒精灯、接种针、接种环、试管架、（2）实验试剂：生理盐水、细菌培养基、伤寒诊断血清、伊红美蓝培养基（）、克氏双糖铁培养基（）、葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、甘露醇发酵管、尿素培养基、蛋白胨水、半固体培养基
三、 实验流程
（1）肠道致病菌的分离
① 待测标本的制作：把接种环放置于点燃的酒精灯火焰处对其进行灭菌，用已灭菌的接种环在细菌培养基中取少量待测细菌于盛有5生理盐水的试管中，混匀。
② 细菌的分离接种：用接种环取适量配置好的细菌悬液，在酒精灯附近进行划线分离法接种细菌于培养基。将培养基置于37℃培养18~24小时。
（2）肠道致病菌的纯化
① 单菌落接种：从已培养待测细菌的培养基上用已灭菌的接种针挑取某单个菌落接种到培养基上，一部分直接深入培养基中底部，一部分直接涂抹于斜面处，置于37℃培养18~24小时。
② 待测细菌的初步判断：取出已纯化培养待测细菌的培养基，观察现象，初步断定该细菌是致病菌或是非致病菌。
（3）肠道致病菌的鉴定
① 生化鉴定：分别取葡萄糖、乳糖、甘露醇发酵管各一只（注意管内的小倒管则应充满液体，不含气泡），用已灭菌的接种针取已培养的培养基上的培养物接种于各发酵管，将各发酵管于37℃培养18~24小时。取出并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌）
② 动力检查：用已灭菌的接种针取培养基上的培养物分别接种于蛋白胨水、尿素培养基、半固体培养基中，将各个培养基于37℃培养18~24小时。取出后将靛基质（吲哚）加入到蛋白胨水培养基中，并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌）
③ 血清学鉴定：取洁净玻片一张，将其用蜡笔分为两格，两边各取生理盐水一滴，再用已灭菌的接种环分别取培养基上的培养物加入两格中，与生理盐水混匀不摊开。（注意每次使用接种环前都应用酒精灯火焰进行灭菌）然后在第二格中滴入一滴伤寒诊断血清，混匀不摊开，轻轻摇动玻片，经1~2观察两格中有无凝集现象。
注：本实验涉及细菌接种都应在无菌条件下进行，由于条件有限，因而可在燃烧的酒精灯附近进行实验操作。
四、 实验结果与分析
（1） 培养基现象与分析：
① 培养基下部呈现黑色现象，上部培养基仍为红色，培养基斜面有细菌明显蔓延生长。
② 分析：培养基下部出现黑色现象，说明该细菌能够分解培养基中的物质并产出硫化氢气体，由于培养基中含铁，因而硫化氢能够与其结合成硫化铁，出现黑色现象；而上部因重力含铁量较少，产生的硫化氢气体又部分挥发，只有少部分能够与少量铁结合，故产生的现象不明显，上部仍呈现红色。
（2）生化鉴定现象与分析：
① 葡萄糖发酵管：管内培养基指示剂由紫色变成黄色，其内可见细菌有明显生长现象，无气泡产生。
分析：培养基指示剂由紫色变成黄色，说明该细菌能够分解葡萄糖并产酸但不产气，使得指示剂内化学物质发生颜色改变。
② 乳糖发酵管：管内培养基指示剂颜色不发生改变，仍为紫色，有明显细菌生长现象，无气泡产生。
分析：培养基指示剂不发生颜色改变，说明该细菌能分解乳糖但不能产酸也不产气，使得管内指示剂无明显现象。
③ 甘露醇发酵管：管内培养基指示剂由紫色变成黄色，其内可见细菌有明显生长现象，无气泡产生。
分析：培养基指示剂由紫色变成黄色，说明该细菌能够分解甘露醇并产酸但不产气，使得指示剂内化学物质发生颜色改变。
（3）动力检查现象与分析：
① 尿素培养基：管内培养基指示剂颜色无明显变化，但有明显气泡产生，有明显细菌生长现象。
分析：管内培养基指示剂无明显颜色改变，说明该细菌不能分解尿素，但培养基中其他物质成分可以使细菌分解产气，因而产生气泡。
② 蛋白胨水：管内指示剂颜色无明显变化，有明显细菌生长现象，无气泡产生。加入靛基质（吲哚）试剂后不出现玫瑰红色。
分析：加入靛基质指示剂后不呈现玫瑰红色，说明该细菌不能分解培养基中的色氨酸产生靛基质，因而靛基质指示剂不能与之发生化学反应，出现颜色变化。
③ 半固体培养基：管内指示剂颜色无明显变化，有明显细菌沿穿刺线扩散生长现象，无气泡产生。
分析：细菌能够沿穿刺线生长，说明该细菌有鞭毛，能运动，有助于鉴别细菌种类。
（4）血清学鉴定现象与分析：
① 现象：通过玻片两边对比，在加有伤寒杆菌诊断血清的第二个格子中周围液体清澈，有明显凝集现象；另一格液体表面浑浊，无凝集现象。
② 分析：第二格中加入伤寒杆菌诊断血清出现凝集现象，说明接种细菌应为伤寒杆菌，二者特异性结合产生抗原抗体复合物，因而呈现凝集现象；而第一格中未加入伤寒杆菌诊断血清，接种细菌无相应抗体，不能产生抗原抗体复合物，所以不呈现凝集现象。
综上：

葡萄糖
甘露醇
乳糖
靛基质
硫化氢
尿素分解
动力
现象
＋
＋
－
－
＋＋＋
－
＋
由此判断：该细菌应为乙型副伤寒杆菌。
五、 实验总结
本次实验所需材料较多，实验流程较复杂，需要动手操作的步骤较频繁，因而在实验过程中需要多加注意操作方法。
① 在实验进行前应熟悉掌握实验的操作步骤及流程，了解实验操作的方法，以便实验的顺利进行。
② 实验应在无菌操作下进行，如可在燃烧的酒精灯附近进行细菌接种（注意酒精灯安全，切勿灼烧自己或是实验仪器，防止事故的发生）。
③ 细菌的培养应在适宜的环境下进行，避免外界环境影响细菌的生长繁殖（由于实验室已配备培养箱，故出现问题不大，由于实验室操作者较多，须做好相应的标记）。
④ 从中挑选单菌落接种时注意不要挑选其他菌落进行接种，防止多种细菌共同出现，影响实验结果。
⑤ 实验过程中注意操作安全，切勿使细菌沾染自己，如不慎出现细菌沾染，应及时用清水洗净。