应用双抗体夹心ELISA检...球菌后组织和血清中抗原变化_曾子轩.pdf

应，及维持完整神经网络进行病毒扩散，致病性狂犬病病毒的复制能力会低于弱毒株，在间接免疫荧光实验中，突变株 rC HL(GX074P48 78M)的病毒灶小于 rC HL 株，大于 GX074 及 CVS 11株;在多步生长曲线上，突变体病毒 rC HL(GX074P48 78M)的复制能力低于亲本弱毒株 rC HL，高于 GX074 株及 CVS 11 株。这可能与街毒株 GX074 株 P 蛋白 48 78 区域氨基酸协同 M蛋白影响了病毒突变株的复制能力有关。本实验为后续研究广西街毒株 GX074 株 P 蛋白对狂犬病病毒生物学特性的影响及筛选相关基因工程疫苗提供了理论基础。参考文献 1 Dodet，B，D N Durrheim and H ees，abies:underusedvaccines，unnecessary deathsJ Vaccine，2014 32(18):2017 2019 2 Albertini，A A，W uigrok and D Blondel，abies virustranscription and replication J Adv Virus es，2011 79:1 22 3 李忠，扈荣良 狂犬病发病机理的研究进展J 吉林畜牧兽医，2006(12):12 15 4 昝洁 狂犬病病毒基质蛋白诱导细胞凋亡、病毒粒子出芽和微管解聚的功能研究 D 浙江大学，2016:145 5 Schnell，M J，T Mebatsion and K K Conzelmann，Infec-tious rabies viruses from cloned cDNA J EMBO J，1994，13(18):4195 4203 6Ito，N，et al，escue of rabies virus from cloned cDNAand identification of the pathogenicity related gene:glyco-protein gene is associated with virulence for adult mice J J Virol，2001 75(19):9121 9128 7 Inoue，K，et al，An improved method for recovering rabiesvirus from cloned cDNAJ J Virol Methods，2003，107(2):229 236 8Hosokawa Muto，J，et al，Characterization of recombi-nant rabies virus carrying double glycoprotein genesJ Microbiol Immunol，2006，50(3):187 196 9Xue，X，et al，Generation of recombinant rabies VirusCVS 11 expressing eGFP applied to the rapid virus neu-tralization test J Viruses，2014 6(4):1578 1589 10 Takayama Ito，M，et al，egion at amino acids 164 to303 of the rabies virus glycoprotein plays an important rolein pathogenicity for adult mice J J Neurovirol，2004 10(2):131 135应用双抗体夹心 ELISA 检测罗非鱼感染无乳链球菌后组织和血清中抗原变化曾子轩，蒋薇，罗雨昕，陈汉忠*，王冬英*(广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530005)中图分类号:S834 5文献标识码:B文章编号:1002 5235(2023)01 0007 06doi:10 3969/j issn 1002 5235 2023 01 002摘要:为了建立快速有效的罗非鱼无乳链球菌病早期诊断方法以便服务于及时疫情预警，试验通过双抗体夹心 ELISA 法确定罗非鱼不同组织(血液、脑、肝、头肾和脾)无乳链球菌阴/阳性临界值后，对感染无乳链球收稿日期:2022 04 23基金项目:广西创新驱动发展专项资金项目(桂科 AA17204081 1);国家现代农业产业技术体系广西罗非鱼产业创新团队建设专项资金(nycytxgxcxtd 08 02 01)。作者简介:曾子轩(1993 )，男，硕士，研究生，研究方向为预防兽医学，498331883 qq com 为第一作者;蒋薇(1991 )，女，硕士，研究生，研究方向为预防兽医学，283732412 qq com，与曾子轩对本文具有同等贡献，并列为第一作者。*通讯作者。E-mail:chenhanz211 163 com;dywang gxu educn。菌不同感染剂量(50cfu/mL、100cfu/mL、200cfu/mL 和400cfu/mL)、不同感染时间(12 h、24 h、48 h、72 h、96h、120 h、144 h、168 h)罗非鱼的不同组织样品中的病原抗原进行检测。结果显示，双抗体夹心 ELISA 法确定脑、头肾、肝、脾及血清中抗原的阴/阳临界值分别为:0 192、0 198、0 196、0 173 和 0 163;感染后 12 h处理组脑组织 OD450值均显著高于对照组(P 0 01);除24 h 外感染组头肾组织 OD450值远大于对照组，且差异具有时间依赖性(P 0 01);感染后 24 h 肝组织OD450值达到峰值，96 h 恢复正常值;感染后 12 h，脾脏组织 OD450值显著高于对照组(P 0 05);感染后 12h血清 OD450值极显著高于对照组(P 0 01)，24 h 恢复正常，72 h 96 h 显著升高。研究表明，感染后 12 h，7广西畜牧兽医2023 年 Vol 39(1)脑、头肾、脾及血清均能检出无乳链球菌抗原，表明双抗体夹心 ELISA 法检测敏感性好，适合罗非鱼无乳链球菌病的早期病原检测;脑、脾、头肾、肝、血清等均可作为检测无乳链球菌抗原的样本，但是感染后不同时间、不同组织的细菌含量可能不同，建议同时检测不同组织以确保结果更准确。关键词:罗非鱼;无乳链球菌;双抗体夹心 ELISA;抗原检测罗非鱼无乳链球菌病发病急、传播快、死亡率高，特别是在疾病流行季节，鱼群一旦急性发病可能全军覆没1，2。在生产实践中，由于不能及时、准确诊断无乳链球菌病，给罗非鱼养殖业造成了惨重损失3 7。对于无乳链球菌病，应早发现、早治疗。因此，开发准确、快速的病原检测技术将是未来研究方向。目前，用于无乳链球菌检测的技术主要有常规检测技术和分子生物学检测技术，但这些检测技术一直停留在实验室研发阶段，未见成品上市8。另一方面，国内外针对罗非鱼无乳链球菌病的疫苗尚在实验室研究阶段，市场上未见商品化 疫苗9 11，使得广大养殖户对该病的防治只能依赖严格的生产管理和抗生素治疗。在此背景下，能否对罗非鱼链球菌病疫情进行快速、有效诊断就成为是否能成功遏制疾病流行的关键因素，研发商品化无乳链球菌快速检测试剂盒已成为的迫切需求。因此，本研究采用浸泡感染方式建立了无乳链球菌接触感染罗非鱼模型，用本实验室前期已建立的双抗体夹心 ELISA 方法12 检测感染罗非鱼的血清及主要器官的抗原水平，研究罗非鱼感染无乳链球菌后其体内主要器官组织及血清中病原菌的分布变化规律，将有助于及时、有效的辅助诊断罗非鱼无乳链球菌病，为生产实践上防控罗非鱼链球菌病提供技术支撑。1材料与方法1 1菌种、实验鱼及饲养管理无乳链球菌 HN 株由广西大学动物科学技术学院寄生虫实验室鉴定、保存。吉富罗非鱼:每条40 5g，购自广西南宁罗非鱼良种场，每天上午 10点、下午6 点投喂人工配合饲料，水温保持 20 25，全天供氧。1 2实验试剂抗罗非鱼无乳链球菌全菌抗原单克隆抗体3A9、酶标抗体 HP 4C12 由广西大学动物科学技术学院寄生虫实验室制备并保存。HP 羊抗鼠购于北京康为世纪公司。脱脂奶粉、PBS 磷酸盐缓冲液(pH 值 7 2 7 4)粉末、KH2PO4购于北京Solarbio 公司;TMB 购于美国 Sigma 公司;植物大豆蛋白胨、胰蛋白胨、细菌琼脂购于北京陆桥。1 3引物设计参照黎炯13 方法设计 CAMP 引物，由美国金唯智 公 司 合 成，引 物 序 列:上 游(P1):5AAGCGTGTATTCCAGATTTCCT 3，下游(P2):5 CAGATAATCAAGCCCAGCAA 3。1 4细菌复苏培养及复壮14 1细菌复苏培养将实验室保存的无乳链球菌 HN 株无菌接种胰蛋白胨大豆肉汤培养基，置于恒温振荡培养箱 37、200 rpm/min 培养 48h，6 000 rpm/min离心菌液 5 min，弃上清，用麦氏比浊管将菌液浓度调整到 1 5 109cfu/mL。14 2细菌复壮对 5 条(体重约 40g)健康吉富罗非鱼腹腔注射无乳链球菌(1 5 109cfu/mL)，0 01 mL/条，注射后置于 32 未流动的水中观察;在鱼表现拒食、眼凸、皮肤脱鳞、出血、泳姿异常等患病症状时及时采血;将采集的鱼血涂布于含5%兔血的 TSA(Trypcasein Soy Agar，TSA)培养基，倒置于 37 恒温培养箱中培养，观察是否有疑似无乳链球菌菌落形成，并对其进行 PC 鉴定。反应体系和反应扩增参数分别见表 1 和表 2。表 1PC 反应扩增体系试剂体积(L)ddH2O12Taq Marster Mix9P1 引物(50pM)1P2 引物(50pM)1模板2共计25表 2PC 反应扩增参数反应类型循环数温度()时间(S)预变性194300变性退火延伸35944556457260再延伸172600保存Forever4Forever1 5感染实验将 175 条(平均约 40 g/条)罗非鱼随机分为 5组，35 条/组。根据不同感染强度，各实验组分别饲养于含 50 cfu/mL、100 cfu/mL、200 cfu/mL 和8广西畜牧兽医2023 年 Vol 39(1)400 cfu/mL 无乳链球菌的 50L 水族箱(长 60 cm 宽 45 cm 高55 cm)中，正常对照组饲养于不含无乳链球菌的水中，水温保持 32，7 天内不换水，不间断氧气供给。1 6样品采集和处理分别于感染后第 12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h 从每个实验组随机捞取 4 条罗非鱼进行静脉采血、剖杀，采集脑、肝、头肾和脾等组织，采集区域表现眼观病变。鱼血置于 1 5 mL离心管中，常温析出血清后，1 000 g 离心收集血清，20 保存。分别称取(35 1)mg 脑、肝、头肾和脾组织块，每管加入0 5 mL 无菌生理盐水，用灭菌研钵制备组织匀浆，500 g 离心收集匀浆上清，20 保存。1 7双抗体夹心 ELISA 方法17 1样品制备取 10 条健康、无乳链球菌阴性罗非鱼进行条静脉采血、剖杀，采集脑、肝、头肾、脾等组织，血清及组织匀浆上清制备参照 1 4。1 7 2阴/阳性抗原临界值确定应用双抗体夹心 ELISA 方法对血清和组织匀浆上清进行检测，同时设置阳性对照和空白对照，每个样本设两个重复。按照阴/阳临界值=阴性 OD450平均值+3 标准方差求值，大于临界值判为阳性，否则判为阴性。1 7 3双抗体夹心 ELISA 具体操作方法用包被液稀释的单抗 3A9(10 24 g/mL)包被酶标板、洗涤 3 次，5min/次、5%脱脂奶粉封闭 2h，再洗涤后加入稀释样本，同时做复孔，37 反应1h。洗涤后加入 1 3 200 稀释的二抗 HP 4C12，37 反应1h。洗涤后加入 TMB H2O2显色液，37 避光显色时间。加入 2 mol/L H2SO4终止反应，酶标仪读取 OD450值。17 4感染罗非鱼血清、组织中细菌抗原检测血清、组织中抗原检测:将罗非鱼血清及组织匀浆上清均以 1 2 比例进行稀释，应用双抗体夹心ELISA 方法进行检测。1 8数据统计采用 Graph Pad v6 0 统计软件对实验数据进行统计分析。其中，多时间点数据选用双因素方差分析(Two Way ANOVA)，采用 LSD t 检测法对组间差异进行检验，数据均用平均值 标准误(?X S E)来表示。P 0 05 即定义为差异具有统计学意义，其中 0 01 P 0 05 表示组间差异显著(在图表中用*标示)，0 001 P 0 01、0 000 1 P 0 001、P 0 000 01 均表示组间差异极显著(分别用、标示)。2结果2 1细菌复苏培养及复壮情况细菌接种胰蛋白胨大豆肉汤培养基，震荡培养48h 后，培养基变混浊;罗非鱼在感染后第 3 d，皮肤变黑、鳞片脱落、腮附近皮肤出血(见图 1)。感染鱼的血液平板培养 48 h 后出现白色、湿润、光滑、凸起菌落(见图 2);该菌落经 PC 扩增后在500 bp 附近出现特异性目的条带，与预期扩增片段(479 bp)大小相符，表明罗非鱼的相关临床症状是由无乳链球菌感染引起(见图 3)。图 1罗非鱼腹腔注射无乳链球菌后外观症状图 2感染鱼血液分离培养得到无乳链球菌菌落图 3感染鱼血液分离培养的细菌 PC 鉴定1 5 感染鱼血液分离菌;6 阳性对照菌;7 空白对照。2 2双抗体夹心 ELISA 法检测临界值确定用双抗体夹心 ELISA 法检测 10 条阴性鱼脑、头肾、肝、脾、血清样本，测定 OD450值(见表 3)，根据公式:阳/阴临界值(Positive/negative，P/N)=阴性 OD450平均值+3 标准方差，计算结果确定脑P/N 为 0 192，头肾 P/N 为 0 198，肝脏 P/N 为9广西畜牧兽医2023 年 Vol 39(1)0 196，脾脏 P/N 为 0 173，血清 P/N 为 0 163。当样本 OD450大于临界值时，即可判定为样本中无乳链球菌检出阳性，否则，判为阴性。表 3阴性鱼组织、血清样本的 OD450测定结果样品号脑头肾肝脾血清10 1090 1010 1090 1400 09420 1210 1490 1490 1300 12930 1250 1590 1510 1030 12240 1300 1240 1300 1500 10050 1490 1490 1660 1190 12960 1660 1340 1590 1240 09070 1590 1010 1210 1040 13580 1130 1090 1310 1460 12290 1010 1460 1210 1290 115100 1310 1570 1010 1340 089平均值0 130 40 132 90 133 80 127 90 112 5标准差0 020 40 021 50 020 60 015 10 016 723感染罗非鱼血清、组织中无乳链球菌抗原检测结果脑组织检测结果见图 4，从图中可看出，感染后 12 h，感染组与空白对照组 OD450值有极显著差异(P 0 01)，说明脑组织中出现大量无乳链球菌菌体。感染24 168 h，感染组 OD450值与空白组相近，无明显差异(P 0 05)。头肾组织检测结果见图 5，从图中可看出，感染后 12 96h，除 24 hpi(hourpostinfection，hpi)外，感染组 OD450值均远远大于空白对照组(P 0 01)，且差异具有时间和剂量依赖性;96 hpi 时达到菌体检出峰值后迅速降低。肝脏组织检测结果见图 6，从图中可看出，感染后 24 h 肝组织内无乳链球菌达到峰值，OD450值显著差异一直持续至感染后 96 h，说明 24 hpi 72hpi 之间肝脏聚集大量无乳链球菌菌体，之后迅速降低，120 h、144 h 感染组 OD450值与空白组相近，168 h 后稍有回升。脾脏组织检测结果见图 7，从图中可看出，除了感染后 120 h，从感染后 12 h 至 168 h，脾脏组织都聚集大量的无乳链球菌，感染组 OD450值与空白对照组有显著差异(P 0 05)(感染 72hpi 差异不显著)。血清检测结果见图 8，从图中可看出，感染后12h，感染组与空白对照组 OD450值有极显著差异(P 0 01)，且差异呈现剂量依赖性，说明感染后12 h，无乳链球菌能迅速进入血液。而在感染后24h，迅速降低，感染组 OD450值与空白组相近，72 96hpi 开始回升，与空白对照组相比差异显著，之后又下降，直至感染后 168 h 又再一次回升。图 4罗非鱼浸泡感染无乳链球菌后脑组织抗原水平的变化同时间点与 0 组比较:*示 P 005，示 P 0 01，示 P 0001，示 P 00001，下同。图 5罗非鱼浸泡感染无乳链球菌后头肾组织抗原水平的变化图 6罗非鱼浸泡感染无乳链球菌后肝组织抗原水平的变化图 7罗非鱼浸泡感染无乳链球菌后脾脏组织抗原水平的变化01广西畜牧兽医2023 年 Vol 39(1)图 8罗非鱼浸泡感染无乳链球菌后血清中抗原水平的变化3讨论目前，无乳链球菌检测方法主要包括常规检测技术和分子生物学检测技术，其中环介导恒温扩增法应用前景较大，且较普通 PC 更为快速准确，但是 DNA 抽提费时较长8。血清学诊断是常见的疾病诊断方法之一，主要是基于抗原和抗体发生肉眼可见或仪器可检测的特异性反应结果判定。这类方法敏感性高，在很短的时间内可获得较为准确的结果，在兽医领域已得到广泛应用，在很多鱼类疾病诊断中也有相关产品。无乳链球菌血清检测技术主要是酶联免疫吸附试验(ELISA)，其可作为疾病的早期诊断工具。祝璟琳等13 以罗非鱼无乳链球菌为抗原制备兔无乳链球菌多克隆抗体，建立了间接 ELISA 快速检测无乳链球菌的方法，并对 2007 年 2013 年自然分离的 44 株无乳链球菌进行检测，检测结果与PC 检测结果 100%相符，灵敏度为 103cfu/孔。张新艳15 借助杂交瘤技术，制备了针对罗非鱼无乳链球菌 SIP(Surface immunogenic protein，SIP)融合蛋白的特异性单克隆抗体，成功建立双抗体夹心ELISA 方法并用于检测罗非鱼无乳链球菌病，结果与 PC 检测结果符合率高达 98 33%。本研究应用本实验室制备的 3A9 抗体建立的双抗体夹心 ELISA 法对不同感染剂量(50 cfu/mL、100 cfu/mL、200 cfu/mL、400 cfu/mL)感染后不同时间采集的血液、脑、肝、头肾、脾等样本进行抗原含量测定。结果发现:罗非鱼在感染无乳链球菌后，即便感染浓度仅仅为 50 cfu/mL，在感染 12 h后脑、头肾、脾和血清均能检出高水平的特异性抗原，其中以脑组织最为突出，一方面表明该 ELISA方法具有较高灵敏度，可用于早期检测;另一方面表明罗非鱼在感染无乳链球菌后首先通过血液循环，侵袭鱼的脑部，这一结果与黄锦炉16 研究结果相吻合，提示血脑屏障对该细菌缺乏足够的抵抗能力，细菌可以借此逃避宿主的免疫清除进入到其他组织器官造成危害。而 Eldar17 也发现该细菌在感染罗非鱼早期具有一定的嗜神经性。因此，结合这些文献和本实验的结果，以及一些在生产实践中观察到罗非鱼的异常行为，我们认为，罗非鱼在感染无乳链球菌早期会呈现一定的神经症状，这为罗非鱼感染无乳链球菌的早期经验判断提供了一定的理论依据。脑和血清中的抗原水平在感染后 24 h 会迅速下降到对照组水平，之后脑组织和血清中仅偶尔能检测到抗原，表明抗原依然存在但是数量较少;但肝脏作为重要免疫器官在感染 24 h 后检出高水平的特异性抗原，表明在感染后 24 h 病原可能随着血液循环进入肝脏增殖，并开始对免疫系统造成损害，这是否可作为解释抗原为何在血、脑中降低有待进一步研究。其他组织则在 96 h 左右抗原水平开始下降，这很可能是细胞免疫开始恢复并介导体液免疫，对病原进行清除。在本实验室前期研究对感染后各周的抗体水平和体液免疫情况进行了分析，证实健康鱼群在感染后 3 周抗体水平逐渐升高，暗示了在感染后很可能存在固有免疫先受到抑制再逐渐恢复的变化过程;而肠炎组的抗体水平在感染后 1 周即出现显著的升高，提示肠道的炎症反应能诱导固有免疫应答以介导体液免疫的发生，可能弥补了无乳链球菌早期感染对免疫系统的抑制，但具体机制有待深入研究。本研究首先通过模拟自然感染条件的“浸泡感染法”成功构建了罗非鱼的无乳链球菌人工感染模型。以该实验动物模型为评估系统，建立的基于罗非鱼无乳链球菌全菌抗原单克隆抗体(3A9)的特异性双抗体夹心 ELISA 检测方法，能检测罗非鱼组织中低浓度无乳链球菌抗原，该方法可用于早期疾病诊断，可同时选取多种组织进行检测，有助于提高诊断的准确性，具有较高的应用价值。该方法能在鱼体感染后 12 h，从脑、头肾、肝、脾及血清等多种组织均检出抗原，表明其检测特异性强、敏感性好、抗原检测取材简单，适用于罗非鱼无乳链球菌病的早期病原检测和诊断。研究结果提示:在开展早期诊断时，血清是较好的检测样品，活体取样即可，且容易检测到抗原;但是生产上无法确认感染时间，且早期固有免疫作用导致抗原数量下降较快，建议同时检测其他组织来辅助血清检测，以提高检测的准确度。(下转第 17 页)11广西畜牧兽医2023 年 Vol 39(1)影响机制 J 北方牧业，2014，(22):14 7 朱正成 爆破声对蛋鸡产蛋性能的影响及损失评估计算方法探讨 J 畜禽业，2016(04):32 34 8 谢强，王文策，朱勇文，等 不同光照条件对家禽生长影响及其应用研究进展 J 饲料工业，2018，39(13):55 59 9 王家忠 噪音对家禽的影响 J 当代畜禽养殖业，2015(05):17 10 张峰 声音刺激对艾维茵肉鸡的影响及其与运输应激的交互作用 D 东北农业大学，2012 11 赵春霞，邵红，杨焕民 环境温度对母猪及蛋鸡生产性能的影响 J 新疆农垦科技，2004(01):27 28 12 徐文娟，陶志云，朱春红，等 氨气对蛋鸭产蛋性能、蛋品质及产蛋相关基因影响分析J 中国家禽，2020，42(12):75 80 13 王琼，张代喜，傅德智，等 不同养殖方式对北京油鸡产蛋性能和蛋品质的影响J 中国家禽，2014，36(01):12 15+21 14 于江明 LED 灯不同光照强度对层叠笼养蛋鸡生产性能以及福利影响 D 黑龙江八一农垦大学，2016(本栏责任编辑胡庭俊)(上接第 11 页)参考文献 1 张新艳，樊海平，钟全福，等 罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定及致病性研究J 水产学报，2008(05):772 779 2 李波，陈明，李莉萍，等 广西罗非鱼链球菌病病原的生化鉴定及药敏试验 J 中国畜牧兽医，2008(10):93 95 3 CHEN M，LI L P，WANG，et al PC detection and PF-GE genotype analyses of streptococcal clinical isolates fromtilapia in China J Vet Microbiol，2012，159(3 4):526530 4 郭玉娟，张德锋，樊海平，等 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