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细菌鉴定中常用的生理生化反应

生72 伍国羽 2007012357
组别 周四班 2-1-1
实验同组人：王甦
实验时间 2010年4月23日

实验目的
1) 了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常用的生理生化反应的测定方法；
2) 通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况，了解细菌碳、氮代谢类型的多样性；
3) 了解细菌在培养基中的生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义；
4) 学习各种接种技术。

实验原理
各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物存在差别。细菌的这种代谢特点可供鉴别细菌之用。用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应。

实验仪器,材料和用具
实验仪器：恒温培养箱。
微生物材料：大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、产气杆菌和未知菌种的平板各1个。
试剂：甲基红试剂、V.P.试剂、吲哚试剂
实验用具：试管：每个试验４根试管(３根接种，1根对照) 。接种环、接种针、酒精灯、试管架、记号笔。

实验步骤
1. 配置培养基
1） 葡萄糖/乳糖发酵培养基（用于葡萄糖发酵实验）
蛋白胨 10g
NaCl 2.5g
水 500ml
制法：
① 将上述成分混合于蒸馏水中加热溶解，调整pH至7.4—7.6。
② 加葡萄糖/乳糖5g，加热溶解后加入0.5ml的1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，混匀。
③ 配好的培养基分装到试管中，每支5ml。内倒置配排净空气的杜氏小管，0.06MPa、30min灭菌。

2） 葡萄糖蛋白胨水培养基（用于甲基红和伏-普实验）
蛋白胨 2.5g
葡萄糖 2.5g
磷酸氢二钾 2.5g
蒸馏水 500ml
制法：
① 将上述成分混合于蒸馏水中加热溶解，调整pH至7.2，以滤纸过滤。
② 配好的培养基分装到试管中，每支5ml。0.06MPa 、30min灭菌备用。

3） 蛋白胨水培养基（用于吲哚实验）
蛋白胨 10g
NaCl 2.5g
蒸馏水 500ml
制法：
① 将上述成分混合于蒸馏水中加热溶解，调整 pH至7.4-7.6。
② 配好的培养基分装到试管中，每支5ml。0.06MPa、30min灭菌。

4） 柠檬酸铁氨培养基（用于硫化氢实验）
蛋白胨 10g
NaCl 2.5g
柠檬酸铁铵 0.25g
硫代硫酸钠 0.25g
琼脂 3g
蒸馏水 500ml
制法：
① 先用水将琼脂和蛋白胨溶化，冷却到60℃加入其他成分，溶化后加水至所需量。
② 调整pH至7.4-7.6。
③ 配好的培养基分装到试管中，每支5ml。0.06MPa、30min灭菌。

5） 明胶培养基（用于明胶液化实验）
牛肉膏 2.5g
蛋白胨 5g
NaCl 2.5g
明胶 100g
蒸馏水 500ml
制法：
① 将上述成分混合于蒸馏水中加热溶解，调整pH至7.0。
② 配好的培养基分装到试管中，每支5ml。0.06MPa、30min灭菌。

6） 柠檬酸盐培养基（用于柠檬酸盐利用实验）
NaCl 2.5g
MgSO4 0.3g
NH4H2PO4 0.5g
K2HPO4 0.5g
柠檬酸钠 1g
琼脂 10g
1％溴麝香草酚蓝酒精液 0.5g
水 500ml
制法：
① 将上述成分混合于蒸馏水中加热溶解(除溴麝香草酚蓝) ，调整pH至6.8，以脱脂棉过滤。
② 加入溴麝香草酚蓝混匀，配好的培养基分装到试管中，每支5ml。0.1Mpa，20min灭菌后制成斜面。

2. 接种菌种
各试管按表1接种。
表1.实验试管接种表
试管编号
实验内容
1
2
3
葡萄糖发酵
大肠杆菌
未知菌S2
变形杆菌
乳糖发酵
变形杆菌
甲基红实验
产气杆菌
V.P.实验
产气杆菌
吲哚实验
产气杆菌
硫化氢实验
变形杆菌
明胶液化实验
枯草芽孢杆菌
柠檬酸盐实验
产气杆菌

淀粉平板按下图1接种。
图1 淀粉水解实验接菌图
3. 练习划线法涂平板
4. 观察结果并照相

实验结果与讨论
图2. 乳糖发酵结果图。从左至右分别为：大肠杆菌，未知菌S2，变形杆菌，对照组。
图1. 葡萄糖发酵结果图。从左至右分别为：大肠杆菌，未知菌S2，变形杆菌，对照组。
1） 实验结果图
图4. V.P. 实验结果图。从左至右分别为：大肠杆菌，未知菌S2，产气杆菌，对照组。
图3. 甲基红实验结果图。从左至右分别为：大肠杆菌，未知菌S2，产气杆菌，对照组。

6
5
4
2
3
1
图9. 淀粉平板实验结果图。1：对照组；2：变形杆菌；3：产气杆菌；4：枯草芽孢杆菌；5：大肠杆菌；6：未知菌。
图8. 柠檬酸盐实验结果图。从左至右分别为：大肠杆菌，未知菌S2，产气杆菌，对照组。

图7. 明胶液化实验结果图。从上至下分别为：本组同学所做的对照组，大肠杆菌，未知菌S2，枯草芽孢杆菌，其他组同学所做对照组。
图6. 硫化氢实验结果图。从左至右分别为：大肠杆菌，未知菌S2，变形杆菌，对照组。
图5. 吲哚实验结果图。从左至右分别为：大肠杆菌，未知菌S2，产气杆菌，对照组。

图10. 单菌落划线平板结果图。

2） 结果分析列表如下所示：
试管编号
实验内容
1
2
3
对照组
葡萄糖发酵
黄色，有气泡，说明可有氧分解葡萄糖
浅黄色，无气泡，说明可无氧分解葡萄糖
黄色，无气泡，说明可无氧分解葡萄糖
紫色，无气泡，不可利用葡萄糖
乳糖发酵
黄色，有气泡，说明可有氧分解乳糖
紫色，无气泡，说明不能分解乳糖
紫色，无气泡，不可利用乳糖
紫色，无气泡，不可利用乳糖
甲基红实验
浅红，酸性产物
橙红，酸性产物
橙黄，弱酸性产物
黄色，非酸性产物
V.P.实验
无色，可以利用葡萄糖
浅黄色，可以利用葡萄糖
红色化合物产生，可分解葡萄糖成丙酮酸
黄色
吲哚实验
粉色，可分解色氨酸
微量粉色，与对照组同，不可分解色氨酸
粉色，可分解色氨酸
微量粉色，不可分解色氨酸
硫化氢实验
不变色，不可利用含硫氨基酸
不变色，不可利用含硫氨基酸
有黑色物质产生，可利用含硫氨基酸
不变色，不可利用含硫氨基酸
明胶液化实验
液态
液态
液态
液态
柠檬酸盐实验
黄绿色，可利用柠檬酸钠
黄蓝色，可利用柠檬酸钠
蓝色，可利用柠檬酸钠
深绿色，不可利用柠檬酸钠

3） 淀粉水解实验
能产生淀粉酶的菌种：枯草芽孢杆菌，未知菌；
不能产生淀粉酶的菌种：大肠杆菌，变形杆菌，产气杆菌。

4） 实验中的思考与讨论
本次实验结果较好，除明胶液化实验外，符合理论预期。
明胶液化实验中我们组中的所有明胶培养基都是液体状态。整个大班只找到一组同学有一个半固体的对照组培养基。培养基出了问题。
在P.V.实验中，由于错误理解了课本上“加入KOH5~10滴，然后再加入等量的奈酚溶液”这句稍有歧义的话，在加入了KOH之后，加入了与试管中液体等量的奈酚溶液。最终的实验结果在黄色的液面以上出现了大段暗黑色液体柱，影响了最后观察实验结果。

思考题
1) 在吲哚试验和硫化氢产生试验中细菌各分解哪种氨基酸?
吲哚实验中细菌分解蛋白胨中的色氨酸；硫化氢实验中细菌分解含硫氨基酸，包括胱氨酸和半胱氨酸等。

2) 假设某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现怎样的结果?
培养基中指示剂由紫变黄，杜氏小管中有气泡。

3) 通过哪些生理生化反应可以区分大肠杆菌和变形杆菌?
根据我们的实验结果，可在以下几个实验中区分大肠杆菌和变形杆菌：
葡萄糖发酵实验：大肠杆菌组有气泡产生，变形杆菌组没有气泡产生；
乳糖发酵实验：大肠杆菌组有气泡产生，培养基颜色由紫变黄，变形杆菌组无气泡产生，培养基颜色仍为黄色。
查阅文献，可知：
明胶液化实验：大肠杆菌呈阴性反应，变形菌呈阳性反应。

4) 已知该未知菌最佳生长温度为32℃，使用伯杰氏细菌鉴定手册，根据以前的gram
染色结果和本实验结果能判断出是什么菌吗？如果需要进一步鉴定，还需要设计哪些实验？
已知未知菌：革兰氏阴性菌，短杆状，厌氧，可分解葡萄糖产生酸性产物，不能利用乳糖，不能分解色氨酸，不能利用含硫培养基，能利用柠檬酸钠。
通过查阅伯杰氏细菌鉴定手册，仅能鉴定出为气单胞菌属，由于鉴定手册的资料内容有限，没有更进一步的细菌类型符合实验结果，故应需查阅更收录菌种详尽的书籍。

参考文献
[1]陈金春，陈国强. 微生物学实验指导. 北京：清华大学出版社，2005
[2]Michael T. Madigan, John M. Martinko. Biology of microorganism. Eleventh edition. America: Pearson Prentice Hall, 2006