兔源大肠杆菌的分离鉴定_王新新.pdf

今日畜牧兽医1xperimental study on onlineE实验研究兔源大肠杆菌的分离鉴定王新新1,2，任 曼1，孙 浩1（1.塔里木大学动物科学与技术学院 843300；2.新疆阿克苏地区民政局 843000）摘要：大肠杆菌属肠杆菌科肠杆菌属，革兰氏阴性菌，是引起人和动物局部或全身感染的主要病原之一。旨在了解新疆阿拉尔市某兔场疑似大肠杆菌病兔子的病因，本试验采集发病和死亡兔子的粪样、肝样和肠内容物，并对其开展分离培养、形态学观察、生化鉴定和动物感染试验。结果，从中成功分离出 3 株疑似病原菌，并鉴定其为大肠杆菌。通过动物感染试验发现，其中 2 种菌株能引起试验动物死亡，从而确定其为致病性菌株。本试验通过分离培养、形态学观察、生化鉴定、动物感染试验等简便方法诊断兔疑似大肠杆菌病，明确其病原，对兽医工作者和广大学者提供了理论与技术参考。关键词：家兔；大肠杆菌；分离鉴定大肠埃希氏细菌隶属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、埃希氏菌属（Escherichia）、大肠杆菌种（coli），是革兰氏阴性的直杆菌，无芽孢1-3，兼性厌氧，常存在于人和动物的肠道。致病性大肠杆菌常引起幼龄动物严重腹泻和败血症4-6。兔大肠杆菌病（rabbitscolibacillosis）又名黏液性肠炎，以幼龄兔发生流涎、腹泻、排鼠粪样或透明胶胨样粪为主要特征7，在兔养殖业中常见并危害较大的一种疾病。本试验对某兔场的疑似病例开展病原分离鉴定，并对其进行动物试验，从而对兔源大肠埃希氏菌的分离鉴定和兔大肠杆菌病的实验室诊断提供了参考。1 材料与方法1.1 材料1.1.1样品病料来自新疆阿拉尔市某兔场。采集腹泻症状的兔子粪样、病死兔的肠内容物和肝脏。样品均无菌采集，并装入无菌处理的密封袋和冻存管，单独标记，置于-20冰箱保存备用。1.1.2主要试剂普通琼脂（LB）固体培养基、麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、SS 琼脂培养基、葡萄糖发酵管、甘露醇发酵管、麦芽糖发酵管、蔗糖发酵管、乳糖发酵管、卫矛醇发酵管等均购自杭州天和微生物试剂有限公司；革兰氏染色试剂盒鉴定套装，购自北京陆桥技术有限责任公司。1.1.3仪器设备GEX-9272MBE 型电热恒温鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；LDZX-40Bl 型立式自动电热压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂产品；电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司产品；超净工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；HPX-9272MBE 数显不锈钢电热培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品。1.2 试验方法1.2.1分离纯化及生长特性鉴定按照无菌操作方法取兔小肠内容物和粪便样品，用生理盐水稀释后用移液枪滴加到麦康凯培养基上并用涂布棒进行涂布均匀（分别标号为肠内容物、1 号粪便、2 号粪便），在肝组织切面上用涂布棒蘸取肝切面后移于麦康凯培养基上涂布均匀（标号为肝组织）,置 37温箱中培养 24h，观察菌落形态。按照无菌操作方法从麦康凯琼脂平板上挑取单个红色菌落14，接种于伊红美蓝琼脂平板、SS 琼脂平板、普通琼脂固体培养基上，于 37温箱中培养 24h。生长特性的鉴定依据：大肠杆菌在普通琼脂培养基上生长成光滑、白色或灰白色菌落；在伊红美蓝琼脂培养基上生长成黑色带有金属光泽的菌落；在麦康凯培养基上生长成红色或粉红色菌落；在 SS 琼脂平板上生长不良或不生长3。1.2.2染色镜检按照革兰氏染色试剂盒鉴定套装说明书进行染色，镜检。判定标准：经革兰氏染色的大肠杆菌在光学显微镜下呈红色、两端钝圆、短杆状3。1.2.3生化试验1.2.3.1糖发酵试验选取葡萄糖、乳糖、卫矛醇、蔗糖、甘露醇、麦芽糖六种糖分别在微量反应管中进行糖发酵试验。使用微量反应管时，轻轻用钳子夹断以上无培养基的玻璃管，然后用在酒精灯灼烧的接种针蘸取相对应的已经培养好的纯菌种接种，放在 37恒温箱过夜培养，1824h 观察并记录观察结果。1.2.3.2硫化氢试验蘸取被检细菌的纯培养物，接种于硫化氢微量反应管中，放在 37恒温培养箱中培养 12d 后观察结果。1.2.3.3触酶试验用酒精灯灼烧的接种环将被检菌落放于载玻片 1/3 处，滴加一滴 3%双氧水于菌落上，立即观察是否有气泡产生。1.2.3.4枸橼酸盐利用试验将从兔肠段上取得的被检菌接种于枸橼酸盐培养基，于35恒温培养 14d，每日观察记录。1.2.4动物试验取 1 号粪便、2 号粪便、肠内容物中分离鉴定的大肠杆菌，分别注射 5 只昆明小鼠。1 号粪便中分离鉴定的大肠杆菌分别注射 5 只昆明小鼠（注射剂量均为 0.5mL）。注射后连续观察48h 并记录结果。2 结果2.1 分离培养结果通过分离培养，分别从标号 1 号粪便、2 号粪便和肠内容物的培养基上得到三株疑似菌（分别标记为 1F、2F、C）。1F、2F 上得到的疑似菌在普通琼脂培养基上生长良好，形成光滑、灰白色菌落（图 1），在麦康凯培养基形成红色圆形菌落（图 2），在伊红美兰琼脂平板上长出黑紫色带金属光泽的圆形菌落（图3），SS 琼脂培养基未形成肉眼可见的菌落。2xperimental study on onlineE实验研究图 1 2F LB 培养基 图 2 2F 麦康凯培养基 图 3 1F 伊红美蓝培养基2.2 生化试验结果见表 1 及图 49。表 1 生化试验结果细菌来源糖发酵试验枸橼酸盐利用试验触酶试验硫化氢试验葡萄糖蔗糖卫矛醇乳糖麦芽糖甘露醇1F+-+-2F+-+-C+-+-+-（判定标准：发酵试验：“”产酸产气，“”产酸，“”无变化；枸橼酸盐试验，触酶实验，硫化氢试验：“”阳性，“”阴性。）图 4 1F 图 5 2F 图 6 1FA:蔗糖发酵管;A:葡萄糖发酵管；A：麦芽糖发酵管B:葡萄糖发酵管；B：蔗糖发酵管；B：乳糖发酵管；C：卫矛醇发酵管D：甘露醇发管；图 7 2F 图 8 C 图 9 硫化氢试验A：甘露醇发酵管A：卫矛醇发酵管；A：1FB：乳糖发酵管；B：乳糖发酵管B：2FC：卫矛醇发酵管C：甘露醇发酵管；C：CD：麦芽糖发酵管；2.3 动物试验结果注射 2 号粪便和肠内容物中分离的菌株，5 只昆明小鼠在12h 内死亡 3 只；解剖观察后发现，腹腔有少量积液，肝脏边缘变黑，其它实质脏器眼观无明显病理变化。注射 1 号粪便中分离的菌株，5 只昆明小鼠均未发现引起死亡。3 讨论本试验采集新疆阿拉尔市某兔场疑似大肠杆菌病例的病料，对其进行了细菌培养，形态学观察（革兰染色镜检），生化试验及试验动物感染试验。病料通过预处理后，分别接种到普通琼脂培养基、麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、SS 琼脂培养基。经过培养后，标记为 1 号粪便、2 号粪便和肠内容物的培养基中均培养出类似大肠杆菌的菌落，生长特性均符合要求。分别挑取单个菌落，涂片，革兰氏染色镜检。结果发现，均为革兰氏阴性（红色）、两端钝圆、成双或散装排列的短杆菌，形态特征符合预期要求。通过形态学观察的单个菌落进行纯化增菌后，对其开展了生化试验，从生化试验结果来看，肠内容物糖发酵试验结果与其他两组试验结果有较大区别，1 号粪便与 2 号粪便糖发酵试验结果中葡萄糖、卫矛醇、乳糖都是产酸产气，而肠内容物试验结果只有葡萄糖产酸产气，卫矛醇既不产酸也不产气其他两个不产气，乳糖只产酸不产气，蔗糖试验结果只有 1 号粪便产酸产气其他两组不产酸产气，麦芽糖和甘露醇三组都是只产酸不产气。枸橼酸盐利用试验三组都无颜色变化。硫化氢试验中三组都无颜色变化。各种生化特性均符合于大肠肝菌，从而确定此 3 株细菌为大肠杆菌。再进一步对昆明小鼠进行感染试验发现，2 号粪便和肠内容物中分离的菌株具有致死性，而 1 号粪便分离的菌株未引起试验动物死亡。从而确定，2 号粪便和肠内容物中分离出的菌株具有致病特性。4 结论本试验采集疑似大肠杆菌病的兔子病料，对其开展细菌分离培养，染色镜检和生化试验。最终，从中分离出 3 株疑似菌。经过生长特性、形态学观察和生化特性鉴定后，确定其为大肠杆菌。通过感染试验发现，其中 2 种菌株具有致病特性。参考文献1 陈天寿.微生物培养基的制造与应用 M.北京:中国农业科学技术出版社,1995：303-445.2 姚火春.兽医微生物学实验指导(第二版)M.北京:中国农业出版社,2003:15-22.3 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册)M.北京：科学出版社,2004:244-258.4 温建新,单虎.家兔致病性大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验 J.中国畜牧医,2008(6):75-77.5 张俊丰，黄东璋，陈琳，等.鸡肠道大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析 J.中国畜牧兽医，2013（11）：179-184.6 高维波.大肠杆菌病的危害及防制对策 J.山东畜牧兽医,2011,32(4):31-32.7 崔玉东，侯喜林，赵淑兰，等.兔大肠杆菌性腹泻的诊断及防治 J.中国兽医杂志，1997(12)11-12.8 Eva Moreno,Guillem Prats,Irene Planells,Ana M.Planes,Teresa Prez,Antonia Andreu.Caracterizacin de Esche-richia coli de los grupos filogenticos A y B1 causantes de infec-cin extraintestinalJ.Enfermedades Infecciosas y Microbiologia Clinica,2006,24(8).9 坤清芳,耿毅,余泽辉,等.兔源大肠杆菌对喹诺酮（后转第 12 页）12xperimental study on onlineE实验研究轻度腹泻：两次就基本可以恢复，4 次停药。病情较重：配合其他药物，2 次明显减轻，3d 恢复。对比：同一批次同样大小的羊，腹泻状况持续很久，用了大量抗生素，有伤亡。5.3.3育肥期羊腹泻的治疗症状：腹泻。治疗：10mL 本制剂，10mL 水，注射器灌服，每日 2 次。效果：2 次后明显减轻，开始少量进食。轻度腹泻：2 次基本可以恢复，4 次停药。重症：配合其他药物，2 次明显减轻，3d 恢复。5.3.4育肥期羊腹泻、拉干、剩料调理育肥期羊共六圈（4，7，8，9，11，12），每圈 5070 只，喂食时发现7号圈连续两次有剩料状况，40mL本制剂，100kg水，整体喂水 2 次，不再有剩料状况，部分腹泻，拉干的羊粪便恢复正常。同样状况 9 号羊圈也采取了相同措施，效果基本相同。5.3.5羊（新购出栏）全程对比试验两个饲养户从内蒙新购同一批羊 1400 只，数量一分为二，每家 700 只，分别饲养 140d，出栏。其中一家用本制剂进行保健，一家常规饲养，比较数据见下表 1。表 1 羊（新购出栏）全程对比试验对比添加本制剂用户常规饲养用户差距羊出栏时平均体重56.7kg51.1kg5.6kg羊死淘只数0 只40 只-40 只5.4 案例 4：仔猪腹泻的治疗症状：仔猪腹泻。治疗：2mL 本制剂/头，注射器灌服，一天一次，连用 3d。效果：轻度腹泻：2 次基本可以恢复，3 次停药；重症：配合其他药物，2 次明显减轻，3d 恢复。6 矿源富里酸制剂与其他药物的配合增效本制剂与治疗药物配合使用时，可达到配伍增效的效果。6.1 与大肠杆菌药物配合使用本制剂消炎止痛，修复受损肠黏膜，可显著减轻大肠杆菌、沙门氏菌引起的全身感染或败血症对机体造成的伤害，加快病情恢复。6.2 与肌腺胃炎药物配合使用本制剂消炎止痛，修复受损胃黏膜，可迅速提高畜禽采食量，减少致病因素对机体造成的伤害，加快病情恢复。6.3 与抗病毒药配合使用本制剂能增强机体免疫力，辅助抗病毒，协同增效，加快病情恢复。7 推荐用量混饮本制剂每千克兑水 15002500kg。8 注意事项8.1本品为弱酸性制剂，不宜与碱性药物配伍使用。8.2本品内含中药提取物，有少许沉淀不影响药效。9 讨论肠胃炎是指由各种因素引起肠胃黏膜发生炎症性改变，根据病程分为急性和慢性两种。引起肠胃炎因素有很多，如病毒性疾病感染、细菌性感染、霉菌毒素感染及环境因素等。如家禽目前流行的腺胃炎、肌胃炎，细菌性肠炎、病毒性肠炎、霉菌毒素引起的胃肠道感染等；猪病毒性腹泻如流行性腹泻、传染性胃肠炎等，细菌感染引起的仔猪黄、白痢，霉菌毒素引起的胃肠道炎症等。畜禽肠胃炎的临床表现一般可见精神沉郁、食欲废绝、体温升高、脉搏快而弱、口干口臭、腹痛腹泻、粪便恶臭、舌苔黄白色或青白色等。目前，畜禽肠胃炎已经成为制约养殖业发展的重要疾病。肠胃炎一般采取西药进行治疗，但西药治疗刺激性大，易反复，不能标本兼治。本制剂主要由矿源富里酸、鼠尾草、仙鹤草、地锦草、杨树花等组成。其中，矿源富里酸为本公司自己制备，止痛消炎，收敛消肿；鼠尾草清热解毒、抗菌、驱瘟除疫；仙鹤草收敛止血、消炎、止痢、解毒；地锦草清热解毒、凉血止血；杨树花清热解毒、化湿止痢，常用于细菌性痢疾、肠炎。全方配伍具有清热解毒，止痛消炎，收敛消肿，修复黏膜的功效。经过临床试验验证，本制剂对腹泻及肠胃黏膜脱落均有很好的防治作用，可用于家禽、家畜和反刍动物的肠炎肠毒及胃炎早期的预防及治疗。此外，本制剂还具有促消化，提高饲料利用率的功效，且绿色无抗，安全有效，对机体无任何毒副作用，畜禽可长期使用，完全迎合畜牧行业减抗、限抗的大趋势，可为畜禽肠胃炎的防治提供一种无抗防治方案的参考。药物耐药性及质粒介导的耐药基因检测 J.中国预防兽医学报,2016,38(12):944-948.10 王云峰,王英厚,崔尚金.黑龙江省家兔大肠埃希氏菌污染情况的调查 J.中国预防兽医学报,2000(1):62-64.11 段书月,刘书梅,王国栋.肉鸡大肠杆菌的分离鉴定 J.畜牧兽医杂志,2008(01):11-13.12 王晓丽,王永明,孟薇薇,等.兔大肠杆菌的分离鉴定J.中国养兔,2015(01):8-9,11.13 G.Wroski,K.Budziska,B.Szejniuk,A.Jurek.In-fluence of temperature on survival of Escherichia coli O157:H7 in stored cattle slurry with respect to environmental biosafetyJ.Polish 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