一种用于贴壁培养细胞感染病...测的简易光镜-电镜联用技术_冯红丽.pdf

第 卷 第 期 年 月电 子 显 微 学 报 ，文章编号：（）一种用于贴壁培养细胞感染病毒检测的简易光镜电镜联用技术冯红丽，彭宇宁，宋敬东（中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，传染病预防控制国家重点实验室，北京；湖南师范大学物理与电子科学学院，湖南 长沙）摘 要 目的：建立一种简单易行的适用于病毒检测的光镜电镜联用技术。方法：使用 腔室玻片培养细胞并接种不同类型病毒，通过光学显微镜选取目标病变细胞或通过荧光蛋白、免疫细胞化学标记、免疫荧光标记、量子点标记确定目标细胞并在腔室玻片上标记其部位。随后将腔室玻片改造为包埋模具，最后钻取目标细胞及其包埋树脂，并对目标细胞进行靶向性超薄切片及透射电子显微镜观察。结果：光镜下选取的目标细胞在透射电子显微镜下可顺利定位并进行观察。结论：建立了一种基于腔室玻片包埋模具的可用于病毒检测的光镜电镜联用技术。关键词 透射电子显微镜；光镜电镜联用技术；病毒；检测中图分类号：；文献标识码：收稿日期：；修订日期：基金项目：国家生物安全实物核心资源库支撑关键技术研究（）作者简介：冯红丽（），女（汉族），甘肃人，助理研究员：通讯作者：宋敬东（），男（汉族），山东人，研究员：通过光镜电镜联用技术（，）能够将光学显微镜观察的目标再次在电镜下观察到，从而实现在光镜分辨率（约 ）和电镜分辨率（约 ）不同水平对同一目标在细胞水平和亚细胞超微结构水平乃至分子水平的研究。结合光学显微镜大视野和电子显微镜高分辨的优势，成为十分有效并广泛应用的研究手段。病毒作为一类最小的微生物（大小 ），目前尚无法使用光学显微镜直接观察到其形态细节，而仅能通过电子显微镜实现对其形态、结构细节的观察。透射电子显微镜（，）技术是最为常用的病毒形态检测技术之一，并在重要致病病毒的发现和生物反恐中发挥过重要作用。检测病毒感染的培养细胞时，通常收获细胞并离心成团后进行超薄切片制样，当在病毒感染的细胞数量极少的情况下进行 检测时，检测到病毒感染的细胞则无异于大海捞针，难度极大，失败率高。为提高超薄切片检测的靶向性，科研人员建立了顶扣包埋、胶囊支撑环、定位切片等多种方法。本研究创造性地将用于细胞培养的腔室玻片改造为细胞原位包埋模具，建立了一种简易的病毒检测 方法，适用于多种标记类型的病毒感染细胞，包括病变细胞、荧光蛋白表达细胞、免疫细胞化学标记、免疫荧光标记及量子点标记的病毒感染细胞，并可轻易实现 对目标细胞的靶向性检测。材料与方法 细胞培养与病毒感染 人胚肾细胞（）和狗肾细胞（）（美国 公司）培养于含有 胎牛血清（）的 培养基，在 、含 培养箱内培养。细胞传代于腔室玻片中（美国 公司，），生长至约 丰度时更换为无血清培养基，并分别将人 型腺病毒（，美国 公司）和表达绿色荧光蛋白的人 型腺病毒（，本课题组构建）接种于 细胞（），将流感病毒 （）（国家流感中心惠赠）接种于含 和 的 细胞（）。病毒的免疫标记 当 感染 细胞 后，分别进行免疫荧光和免疫细胞化学标记。以 甲醛（第 期冯红丽等：一种用于贴壁培养细胞感染病毒检测的简易光镜电镜联用技术 缓冲液，）固定细胞 后，以 穿透细胞 ，随后以 封闭 。再以羊抗腺病毒六邻体蛋白抗体（即一抗）（美国 公司，货号，稀释）孵育细胞（，）。对于免疫荧光标记，一抗标记完成后以 标记的兔抗羊（即二抗）（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号，稀释）继续进行标记，二抗标记完成后以 溶液（美国 公司，货号）对细胞核染色。对于免疫细胞化学标记，一抗标记完成后以 标记的兔抗羊（即二抗）（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号，稀释）继续进行标记，最后按照二氨基联苯胺（，）试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号）说明书进行显色。当 （）感染 细胞 后，以上述相同方法固定和标记细胞。一抗为兔抗 单抗（，货号，稀释），二抗为量子点（，）标记的山羊抗兔（武汉珈源量子点技术开发有限公司，货号，稀释），最后以 溶液对细胞核进行染色。不进行免疫标记的 病毒感染的 细胞样本，待细胞刚刚出现少量病变后，以 甲醛 戊二醛（二钾胂酸钠缓冲液，）固定细胞 后备用。目标细胞的光镜定位与标记 完成免疫标记或直接固定后的样本，去除腔室玻片上的塑料支架，保留底部玻片及玻片上的胶条，并调整液面与胶条上缘齐平，然后盖上载玻片封住胶条槽内的液体并反转，使细胞位于上方，并置于倒置荧光显微镜（日本 公司，型号）下进行观察、拍照。用细记号笔标记目标细胞位置，包括病变细胞、染色阳性细胞、绿色荧光蛋白阳性细胞、荧光阳性细胞、量子点荧光阳性细胞。透射电镜超薄切片样本的制作 在光镜下完成目标细胞位置标记后，反转腔室玻片使载玻片向上，移除载玻片，在胶条形成的凹槽内加入 甲醛 戊二醛固定样本 。然后所有样本按照常规超薄切片制样流程进行四氧化锇固定、梯度乙醇脱水、树脂浸透等样本处理，最后用低粘度环氧树脂（美国 公司，货号）包埋样本，并以回收的腔室玻片封盖树脂，按照产品说明进行聚合。目标细胞的暴露与超薄切片制作 树脂聚合后揭除封盖的上方玻片，细胞在下方位置将之放在倒置相差显微镜下观察包埋前标记细胞的位置，并在无细胞侧的树脂表面对应位置用细记号笔进行标记，之后将树脂块从腔室玻片上剥离。用 号针头（直径约 ）制作桶状钻头，一端打磨呈锯齿状，另一端安装在钻磨机上（德国 公司，型号 ）并将钻磨机固定于钻台架上（德国 公司，型号 ），使用桶状钻头对准标记部位钻取目标细胞，获取包埋有目标细胞的柱状树脂块，最后用 强力胶水将钻取的包埋有目标细胞的树脂块细胞面朝上粘附在树脂底座上，对照光镜拍摄的目标细胞图像，在体视镜下修切掉目标区域外的细胞和树脂，然后在超薄切片机上（德国徕卡公司，型号）进行超薄切片，切片厚度 ，将超薄切片捞于覆膜的单孔铜网中心位置、晾干，然后进行醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色，晾干后进行透射电镜观察、拍照。电镜观察及拍照 在透射电子显微镜（美国 公司，型号）加速电压 下，通过 相机（美国 公司，型号）在低放大倍数下与光镜拍摄的照片进行匹配，并对同一个目标细胞进行拍照记录。结果 目标细胞的定位、原位包埋与获取 将腔室玻片上的盖子、塑料支架去除后，可将其改造为包埋模具（图 ），包埋后形成的树脂块大小约为 （图），可在显微镜下清晰观察到目标细胞，并可钻取目标细胞，从而将包埋有目标细胞的树脂块粘着在树脂底座上（图），便于后续超薄切片操作。病变细胞定位及 观察 在相差显微镜可见光下可见 流感病毒感染 细胞后产生的病变部位细胞皱缩变圆、细胞间隙增大（图），该部位经过靶向性超薄切片后，在 下容易找到（图），并在病变细胞表面可见大量病毒颗粒的纵切面（图）及横断面（图）表达绿色荧光蛋白的 感染细胞的定位及 观察 在荧光显微镜视野内可见一个被 电子显微学报 第 卷图 将腔室玻片改造为细胞原位包埋模具。，腔室玻片的构造；改造腔室玻片为包埋模具；包埋形成的树脂块；光镜下定位目标细胞；，钻取树脂块上目标细胞；目标细胞树脂块细胞面向上粘在树脂底座上。，；，；图 感染流感病毒的病变 细胞 观察。光镜下病变细胞区域；电镜下同一病变细胞区域；病变细胞表面大量纵切面的流感病毒颗粒（箭头示）；病变细胞表面大量横断面的流感病毒颗粒（箭头示）。；（）；（）第 期冯红丽等：一种用于贴壁培养细胞感染病毒检测的简易光镜电镜联用技术 感染并表达绿色荧光蛋白的细胞（图），光镜视野下由于没有产生明显的细胞病变，在众多的细胞中无法判断被病毒感染的细胞（图），将荧光像与可见光像融合后可轻易定位病毒感染的细胞（图）。该细胞经过靶向性超薄切片后，在 下容易找到，可见细胞内有大量腺病毒颗粒（图）。图 感染的 细胞 观察。荧光显微镜下表达绿色荧光蛋白的目标细胞；光镜下的目标细胞；目标细胞荧光与可见光融合图像；下目标细胞的核内可见大量腺病毒颗粒。；免疫细胞化学 标记腺病毒感染目标细胞的定位及 观察 通过免疫细胞化学标记后可以在众多细胞中定位被 感染的 细胞（图），靶向性超薄切片后在 下可观察到同一个细胞（图），且该细胞核内可见大量病毒颗粒（图，）。免疫荧光标记腺病毒感染目标细胞的定位及 观察 通过免疫荧光标记后可定位被 感染的 细胞（图），并可将目标细胞和未被感染细胞区分（图，）。靶向性超薄切片后在 下可观察到同一个目标细胞内有大量病毒颗粒（图）。量子点标记 流感病毒感染细胞的定位及 观察 量子点标记的免疫荧光能够定位 流感病毒感染的目标细胞（图），并能与其它未被病毒感染的细胞进行区分（图，）。下可见感染病毒的目标细胞表面出芽状态的病毒颗粒及完整病毒颗粒，且病毒颗粒表面被量子点标记（图）。量子点可被激发，发射的荧光在荧光显微镜下可被观测到，其又类似胶体金颗粒在 下具有高电子密度而易被识别，因而是 技术的良好标记物之一。讨论 尽管目前分子生物学技术、免疫学技术、核酸技术等已成为病毒检测的主要手段，但 在未知病毒、重大疫情、生物反恐等应急检测时仍是一线技术之一。如发热伴血小板减少综合征病毒、流感病毒、的发现、中国首例猴痘病毒的病原体鉴定 均发挥了重要作用，。当在应急情况下分离培养病毒时，往往不能等到细胞完全病变病毒含量最高时才进行 超薄切片检测，通常刚刚出现病变即病变细胞较少时便需紧急进行 检测。有的病毒并不导致细胞病变效应（），此种情况下就需要使用急性期血清或病毒抗体对细胞标记以评估病毒复制状况，并进行电镜检测。电子显微学报 第 卷图 免疫细胞化学 标记 感染的 靶细胞 观察。可见光定位 标记的靶细胞；电镜下同一个目标细胞；，目标细胞的核内大量腺病毒颗粒。；，为解决上述问题，本研究创造性地将用于细胞培养的腔室玻片改造为细胞原位包埋的模具，易于实现对少量目标细胞的靶向性超薄切片和对同一个靶细胞的光镜和 观察。该方法具有如下优点：（）目标细胞易于观察及进行位置标记：腔室玻片垫圈形成的凹槽和其内液体用玻片覆盖，整个结构的厚度仅约 ，可在倒置荧光显微镜或相差显微镜下随意变换位置进行观察及用记号笔进行标记。（）树脂块易与玻片剥离：底座玻片受力时可有较大幅度的弯曲，且树脂与底座玻片不兼容，故而树脂块及细胞易与底座玻片剥离，且玻片上不余留任何细胞。从而避免其它包埋模具如 孔板、孔板等需使用强力或使用液氮骤然降温而使树脂块与模具剥离的方式，此种情况下树脂往往因破裂而无法保证完整，且无法控制树脂的碎裂部位及方式。（）易于准确获取目标细胞：通过直径约 的钻头钻取目标细胞，使得钻取的树脂块上非靶细胞少，从而易于通过修块暴露目标细胞。另外，树 脂块面积为 ，还可多点取样。本研究后续技术改进表明，树脂块在约 的热台上可稍软化，用锋利刀片切割暴露目标细胞，可代替电钻，进一步降低该技术的难度和对电钻等器具的依赖。（）简化超薄切片操作：包埋细胞的树脂块尺寸为 （长宽厚），且上下两个面十分平滑，在显微镜下细胞清晰可辨，故易于定位目标细胞。树脂块表面十分平整，可直接对刀、切片，而不必用切片刀修整。本研究后续技术改进表明，使用树脂包埋时，控制好树脂液面及聚合时保持树脂表面水平，可省去最后使用底座玻片作为盖子盖住树脂，聚合后的树脂块表面平整，可直接用于后续显微镜观察及切片。（）本技术对多种方式标记的目标细胞具有一定的普适性：本研究表明，可通过多种技术对病毒感染的目标细胞进行标记（如病变细胞、标记、免疫荧光标记、免疫细胞化学标记、免疫荧光量子点标记等），且标记后的目标细胞均可实现定位切片和在 下进行再次观察。第 期冯红丽等：一种用于贴壁培养细胞感染病毒检测的简易光镜电镜联用技术 图 免疫荧光 标记 感染的 靶细胞 观察。荧光显微镜下 标记的目标细胞；目标细胞与 标记细胞核融合图像；可见光下的目标细胞；电镜下目标细胞的核内可见大量腺病毒颗粒。；图 量子点荧光标记 流感病毒感染的 细胞 观察。荧光显微镜下荧光标记的目标细胞；可见光下的同一目标细胞；目标细胞荧光与 标记细胞核融合图像；下目标细胞表面可见被量子点标记的病毒颗粒。；电子显微学报 第 卷 ；鉴于上述技术优势，本研究建立的 技术对模式病毒感染的少量细胞（即无包膜病毒腺病毒和包膜病毒流感病毒感染的细胞）和多种方式标记的靶细胞成功进行了靶向性电镜检测。综上所述，本研究建立了一种简单易行的用于贴壁培养细胞感染病毒的光镜电镜联用检测技术。参考文献：，：，：，：！，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：陈德蕙，杨怡 在可能的生物恐怖袭击中病毒的电镜诊断 电子显微学报，（）：陈德蕙，张贺秋，王国华 电镜在病毒感染诊断中的应用 电子显微学报，（）：洪涛，王健伟，宋敬东 医学病毒图谱 北京：科学出版社，：，：，（）：洪涛，方肇寅，周静仪，等 电子显微镜观察病毒感染细胞包埋技术的改进 微生物学报，（）：宋颖，屈建国，洪涛，等 基于石蜡切片定位的超薄切片技术的建立 中国卫生检验杂志，（）：宋敬东，屈建国，洪涛，等 病变细胞定位超薄切片方法的建立 中华实验和临床病毒学杂志，（）：，（），（）：，（）：，（）：第 期冯红丽等：一种用于贴壁培养细胞感染病毒检测的简易光镜电镜联用技术 ，（，；，）：（）：（），：；