野生菌核侧耳生物学特性及驯化栽培_王军芳.pdf

Research paper 研究论文 22 January 2023,42(1):395-407 菌物学报 Mycosystema ISSN1672-6472 CN11-5180/Q Doi:10.13346/j.mycosystema.220418 资助项目：海南省重点研发专项(ZDYF2020062)；中国热带农业科学院基本业务费(1630052022003,1630012022009)；海南省自然科学基金(321MS0803)This work was supported by the Key Research and Development Project of Hainan Province(ZDYF2020062),the Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund for Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences(1630052022003,1630012022009),and the Natural Science Foundation of Hainan Province(321MS0803).*Corresponding author.E-mail: Received:2023-10-19;Accepted:2023-11-18 Copyright 2023 Institute of Microbiology,CAS.All rights reserved.| Http:/journals- Tel:[phone] 菌物学报 395 马海霞 中国热带农业科学院热带生物技术研究所研究员，硕士研究生导师，海南省“南海名家”青年、海南省“拔尖人才”获得者。主要从事菌物分类与分子系统学、热区菌物资源与利用、食用菌产业化等领域的研究，发现和发表大型真菌新物种 38 个。现任中国菌物学会理事。野生菌核侧耳生物学特性及驯化栽培 王军芳1，宋国月1，高悦1，宋子坤1，马海霞1,2*1 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 海南省热带微生物重点实验室，海南 海口 571101 2 海南热带农业资源研究院 海南省热带农业生物资源保护与利用重点实验室，海南 海口 571101 摘 要：菌核侧耳是一种珍稀药食同源真菌，具有极高的营养价值和药用价值。为了充分保护和利用该类野生真菌资源，本研究对采自海南黎母山自然保护区的一株野生侧耳属子实体进行了菌株分离纯化培养，通过内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列分析，并结合形态学特征，鉴定为菌核侧耳 Pleurotus tuber-regium。以此菌为试验菌株，从碳源、氮源、pH 和温度 4 个方面进行生物学特性研究，从中选出 3 个较优水平进行正交试验。结果表明，在试验范围内，该菌株菌丝生长的最佳碳源为蔗糖，氮源为蛋白胨，pH 7.0，温度 35。驯化出菇试验中，二级种选用玉米粒，25 黑暗培养；出菇栽培的基质为杂木屑52%、玉米芯25%、麦麸20%、石灰2%、石膏1%，50 d 左右出现原基，加大空气湿度至 85%90%，在 28 以上培养 5 d 后子实体成熟。本试验成功对野生菌核侧耳进行了人工出菇栽培，为该菌进一步的研究和开发提供了参考。关键词：侧耳属；生物学特性；药食两用真菌；驯化栽培 引用本文 王军芳，宋国月，高悦，宋子坤，马海霞，2023.野生菌核侧耳生物学特性及驯化栽培.菌物学报，42(1):395-407 Wang JF,Song GY,Gao Y,Song ZK,Ma HX,2023.Biological characteristics and domestic cultivation of wild Pleurotus tuber-regium.Mycosystema,42(1):395-407 王军芳 等/野生菌核侧耳生物学特性及驯化栽培 研究论文 菌物学报 396 Biological characteristics and domestic cultivation of wild Pleurotus tuber-regium WANG Junfang1,SONG Guoyue1,GAO Yue1,SONG Zikun1,MA Haixia1,2*1 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Hainan Key Laboratory of Tropical Microbe Resources,Haikou 571101,Hainan China 2 Hainan Key Laboratory for Protection and Utilization of Tropical Bioresources,Hainan Institute for Tropical Agricultural Resources,Haikou,571101,Hainan China Abstract:Pleurotus tuber-regium,generally used as medicine and edibles in China,has considerably high nutritional and medicinal values.A wild Pleurotus isolate collected from Limushan Natural Reserve of Hainan Tropical Rainforest National Park was purified and identified as P.tuber-regium by molecular analysis based on ITS sequences and morphological characteristics.The biological characteristics and domestic cultivation of the isolate were studied.The cross-hatch method was used to study the effects of different carbon and nitrogen sources,pH,and temperature on the mycelial growth rate under solid cultivation.The orthogonal tests were conducted on three optimal factors from four single factor experiments.The results showed that the optimal carbon and nitrogen sources for the mycelial growth of P.tuber-regium were sucrose and peptone respectively,under conditions of pH 7.0 at 35 C.The spawn was the culture on corn grain substrate incubated at 25 C under dark condition.The culture formula was 52%angiosperm wood chips,25%corncob,20%bran,2%lime,and 1%gypsum.Primordium formed in 50 d of incubation and mature fruiting body in 55 days under the temperature of 2832 C,and humidity of 85%90%.The present study is successful in domestic cultivation of P.tuber-regium,and supplies the primary data for future industrialized production of the fungus.Keywords:Pleurotus;biological characteristics;medicinal and edible fungi;domestic cultivation 菌核侧耳 Pleurotus tuber-regium(Fr.)Singer，又叫茯苓侧耳，俗称南阳茯苓、虎奶菇，隶属于担子菌门 Basidiomycota、蘑菇纲 Agaricomycetes、蘑菇目 Agaricales、侧耳科 Pleurotaceae、侧耳属Pleurotus(图力古尔和李玉 2001；李翠新和何德 2007)，菌核侧耳是一种高温型真菌，主要生长在热带、亚热带地区(陈喜蓉等 2019)。在我国主要分布在低纬度的云南和海南，国外在马来西亚、肯尼亚、尼日利亚和澳大利亚均有分布(阮瑞国 2002)。菌核侧耳由菌核和子实体两部分组成，菌核生于地下，球状，内部白色，外部暗色。子实体从菌核长出，单生或丛生，菌盖漏斗形或杯形，菌肉皮革质，表面光滑，常有小鳞片，灰褐色；菌褶延生，不等长；菌柄常中生，圆柱形；担孢子椭圆形，无色，光滑，81034 m(李玉和图力古尔 2014)。菌核侧耳的菌核与子实体均可食用(戴玉成等 2010)，具有很高的营养价值和药用价值(Wu et al.2019)，含丰富的蛋白质、氨基酸和多糖，可以预防哮喘、冠心病及糖尿病，是一种新型的保健品(江枝和等 2000；戴玉成和杨祝良 2008)。菌核侧耳具有多种药用价值，近些年多数学者侧重于其药理作用的研究(张鹏 2013)。但野生菌核侧耳对环境要求高，产菇率低，虽然我国对于菌核侧耳的研究已经有很长的历史，人工栽培的技术日益成熟(王爽等 2019)，但仍未见其大规模的工厂化生产。本研究通过对采自海南省的野生菌核侧耳进行生物学特性和驯化栽培的研究，以期为该菌的进一步Research paper 22 January 2023,42(1):395-407 Mycosystema ISSN1672-6472 CN11-5180/Q 菌物学报 397开发利用提供参考依据。1 材料与方法材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试菌株 野生菌核侧耳子实体采自海南省琼中县黎母山自然保护区，通过组织分离获得纯培养，菌种现保存于中国热带农业科学院热带生物技术研究所。1.1.2 供试培养基 PDA 综合培养基：马铃薯 200 g，葡萄糖20 g，琼脂 20 g，蛋白胨 2 g，硫酸镁 1.5 g，磷酸二氢钾 3 g，蒸馏水定容至 1 000 mL，pH 自然；用于野外菌种分离、菌丝活化和扩繁、温度单因素试验。碳源培养基：琼脂 20 g，蛋白胨 2 g，硫酸镁 1.5 g，磷酸二氢钾 3 g，碳源 20 g，1.0 L水。氮源培养基：琼脂 20 g，葡萄糖 20 g，硫酸镁 1.5 g，磷酸二氢钾 3 g，氮源 2 g，1.0 L 水。1.2 分子生物学鉴定 对野生子实体菌盖的菌肉组织块和分离所获得的菌丝体利用十六烷基三甲基溴化铵法(cetyl trimethyl ammonium bronide,CTAB)(胡薇等 2009；杨琴等 2020)进行基因组 DNA 提取，选取通用引物 ITS5 和 ITS4 对其内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)片段进行 PCR 扩增(White et al.1990)。PCR 产物送到北京六合华大基因科技有限公司(广州)进行测序，将测序结果在NCBI数据库中进行BLAST对比分析(方志荣等 2022)。1.3 生物学特性研究 1.3.1 菌种活化 将低温保存的野生菌核侧耳菌株接种到9 cm 培养皿 PDA 综合培养基上，25 恒温培养至菌丝长满至约 8 cm 时，用内径 9 mm 打孔器在菌落边缘同一半径打孔备用。1.3.2 碳源单因素试验 以零添加碳源为空白对照，分别以麦芽糖、甘露糖、乳糖、淀粉、蔗糖、果糖和葡萄糖为供试碳源制作培养基，灭菌后将 15 mL 不同碳源培养基分别倒入 9 cm 培养皿，待凝固后接种备用菌种块，置于 25 恒温培养箱进行黑暗培养，每个处理 8 个重复。自接种 24 h 开始，每 24 h观察并记录菌落形态、颜色及菌丝长势，利用十字交叉法测量并记录菌落生长，直到菌落生长直径达到 8 cm。1.3.3 氮源单因素试验 以零添加氮源为空白对照，分别以酵母、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠、氯化铵、尿素和蛋白胨为供试氮源制作培养基。实验方法同 1.3.2。1.3.4 pH 单因素试验 用 1 mol/L NaOH 和 1 mol/L HCl 将灭菌后的 PDA 综合培养基 pH 调为 5、6、7、8 和 9 共5 个梯度，制成 pH 培养基。测量仪器为 pHSJ-3F实验室 pH 计。实验方法同 1.3.2。1.3.5 温度单因素试验 无菌条件下，将灭菌后的 PDA 综合培养基15 mL 倒入 9 cm 培养皿，待接种后分别置于 15、20、25、30、35 和 40 恒温培养箱中进行黑暗培养，每个处理 8 个重复。实验方法同 1.3.2。1.3.6 正交实验 从单因素实验中选出 3 组最佳碳源、氮源、pH 和温度的组合(史维丽等 2021)，按照 L9(43)进行 4 因素 3 水平正交试验，每个处理重复 6 次。实验方法同 1.3.2。1.3.7 驯化栽培 原种制作：选择无霉变、颗粒饱满的玉米粒，水中浸泡 24 h 后，在开水中煮 30 min，当煮至玉米粒掰开无白心时，捞出去除多余水分，加入1%石膏装入 200 mL 罐头瓶。置于 121 高压灭菌锅灭菌 2 h，无菌冷却至 30 以下接种，放入25 恒温培养箱中黑暗培养。栽培袋制作：栽培配方选用杂木屑 52%、玉米芯 25%、麦麸 20%、石灰 2%、石膏 1%，含水量调至 65%，装入 18 cm36 cm 聚丙烯菌 王军芳 等/野生菌核侧耳生物学特性及驯化栽培 研究论文 菌物学报 398 袋中，每袋装干料约 0.5 kg。放入高压灭菌锅121 灭菌 2 h，无菌冷却至 30 以下接种。接种后放入培养室中黑暗培养。2 结果与分析结果与分析 2.1 鉴定 2.1.1 形态学鉴定 野生子实体具浓郁菌香。幼期时半球状，边缘微上卷，子实体有翘起的鳞片。成熟展开后菌肉皮革质，中央下凹，漏斗状或杯状，菌盖灰褐色，直径 1020 cm，表面常有小鳞片。菌褶延生、密集。菌柄中生，圆柱状，表面有小鳞片或小绒毛。孢子椭圆形，无色、透明，大小为(7.510.0)(2.54.3)m。从形态学初步判定为菌核侧耳。2.1.2 分子生物学鉴定 通过 DNA 的提取，以 ITS4 和 ITS5 作为引物，对 DNA 进行扩增测序，将获得的野生菌核侧耳的 ITS 序列提交至 GenBank。在 NCBI 线上数据库进行 BLAST 同源性比对，该菌株 ITS 序列与 P.tuber-regium(MK894134)的相似度为99.13%，与 P.tuber-regium(KX018292)相似度为98.69%，与 P.tuber-regium(KP866679)相似度为99.11%，结合形态学特征，确定该菌为菌核侧耳。2.2 生物学特性 2.2.1 碳源对菌丝生长速度及形态的影响 在不同碳源培养基上菌核侧耳菌丝均能生长，但生长速度差异较大，长势和菌丝的浓密程度也截然不同(图 1A，图 2，表 1)。生长速度由大到小排序依次为蔗糖麦芽糖淀粉对照甘 图 1 不同单因子条件对菌核侧耳菌丝生长速度的影响 A：不同碳源的影响.B：不同氮源的影响.C：不同 pH 的影响.D：不同温度的影响 Fig.1 Effects of different single factor conditions on the mycelial growth rate of Pleurotus tuber-regium.A:Effects of different carbon sources.B:Effects of different nitrogen sources.C:Effects of different pH.D:Effect of different temperatures.Research paper 22 January 2023,42(1):395-407 Mycosystema ISSN1672-6472 CN11-5180/Q 菌物学报 399 图 2 不同条件对菌核侧耳菌丝生长情况的影响 Fig.2 Effects of different conditions on mycelial growth of Pleurotus tuber-regium.露糖果糖葡萄糖乳糖。其中，在蔗糖和淀粉培养基上气生菌丝较多，在葡萄糖和乳糖培养基上相对较少。在蔗糖培养基上生长最快，生长速度为(10.600.200)mm/d，菌丝较浓密(图 2)；其次为麦芽糖(10.000.265)和淀粉(9.660.209)mm/d，但麦芽糖为碳源培养基上菌丝较稀疏；而乳糖、葡萄糖、果糖和甘露醇为碳源培养基时菌丝生长速度低于空白对照组。综合考虑菌丝生长速度、长势及数据分析，选取蔗糖作为野生菌核侧耳菌丝生长的最适碳源。2.2.2 氮源对菌丝生长速度及形态的影响 在不同氮源条件下，野生菌核侧耳菌丝均可生长，但生长速度及长势不同，由大到小依次为蛋白胨酵母尿素氯化铵硝酸铵硝酸钾对照硝酸钠。其中，在蛋白胨培养基上生长最快，速 度 为(10.070.287)mm/d；其 次 为 酵 母(8.270.416)mm/d(图 1B，表 1)；而添加硝酸钠的培养基菌丝生长缓慢，且生长直径小于对照组(3.570.642)mm/d。酵母和蛋白胨培养基上的菌丝较致密，呈绒毛状，而其他氮源培养基上的菌丝稀疏，不容易观察到且边缘不整齐(图 2)。综合考虑菌丝生长速度、浓密程度及长势，选取蛋白胨作为该菌丝生长的最适氮源，也说明相较于无机氮源菌核侧耳更容易利用有机氮源。2.2.3 pH 对菌丝生长速度及形态的影响 不同pH条件的培养基上野生菌核侧耳菌丝均能生长，生长情况见表 1、图 1C 和图 2。菌丝生长速度由大到小依次是 pH 7.0pH 9.0pH 8.0 pH 5.0pH 6.0。其中，pH 为 8.0 时菌丝浓密程度高于 pH 7.0，菌落边缘整齐，呈白色，在 pH 为 7.0、9.0 时生长速度较快，分别是(14.830.702)mm/d 王军芳 等/野生菌核侧耳生物学特性及驯化栽培 研究论文 菌物学报 400 表 1 不同单因子条件对野生菌核侧耳菌丝生长的影响 Table 1 Effects of different single factor conditions on mycelial growth of wild Pleurotus tuber-regium 培养条件 Condition 因子 Factor 菌丝生长速度 Mycelial growth rate(mm/d)菌丝形态 Mycelial morphology 显著性 Significance 长势 Growth vigor 0.05 0.01 碳源 Carbon source 空白对照(CK)9.230.300 白色，絮状 White,flocculent ab AB+淀粉 Starch 9.660.209 白色，絮状 White,flocculent ab AB+甘露糖 Mannose 8.670.321 白色，絮状 White,flocculent b B+果糖 Fructose 8.170.306 白色，絮状 White,flocculent c C+麦芽糖 Maltose 10.000.265 白色，絮状 White,flocculent ab AB+葡萄糖 Glucose 6.600.361 白色，绒毛状 White,villous c C+乳糖 Lactose 5.530.057 白色，绒毛状 White,villous d D+蔗糖 Sucrose 10.600.200 白色，絮状 White,flocculent a A+氮源 Nitrogen source 空白对照(CK)3.570.642 白色，絮状 White,flocculent d D+酵母 Yeast 8.270.416 白色，絮状 White,flocculent b B+尿素 Urea 6.900.173 白色，絮状 White,flocculent c C+NaNO3 2.100.173 白色，絮状 White,flocculent e E+蛋白胨 Peptone 10.070.287 白色，絮状 White,flocculent a A+KNO3 4.430.321 白色，絮状 White,flocculent d D+pH 5.0 13.230.057 白色，絮状 White,flocculent b B+6.0 13.040.513 白色，絮状 White,flocculent b B+7.0 14.830.702 白色，絮状 White,flocculent a A+8.0 13.301.825 白色，絮状 White,flocculent b B+9.0 13.400.529 白色，絮状 White,flocculent b B+温度 Temperature(C)15 0.000.000 几乎不生长 Almost no growth d D 20 1.931.030 白色 White c C+25 8.000.200 白色，绒毛状 White,villous b B+30 13.070.230 白色，绒毛状 White,villous a A+35 13.300.458 白色，绒毛状 White,villous a A+40 0.000.000 不生长 No growth d D 表示菌丝不生长；+表示菌丝极稀疏；+表示菌丝稀疏；+表示菌丝较致密；+表示菌丝致密.同列不同大写字母表示显著性差异(P0.01)，小写字母表示显著性差异(P0.05).下同 Indicates that the mycelium does not grow;+Indicates that the mycelium is extremely sparse;+Indicates that the mycelium is sparse;+Indicates that the mycelium is comparatively dense;+Indicates that the mycelium is dense.The different capital letters in the same column indicate significant differences(P0.01),and lowercase letters indicate significant differences(P30 25 20 15=40，其中，30 和 35 时菌丝生长速度较快，分别是(13.070.230)mm/d 和(13.30 0.458)mm/d，其次是 25 (8.000.200)mm/d(表 1，图 1D)。35 时菌丝最致密且边缘较整齐，30 是较致密且边缘整齐(图 2)。综合菌丝长势，生长速度来看，最适合菌核侧耳菌丝生长的温度为 35。2.2.5 正交试验结果分析 根据单因素实验结果选取最佳碳源、氮源、pH 和温度进行 4 因子 3 水平正交试验(表 2)。4 个因子的极差分别为 0.40、3.17、0.51 和 1.77，因此 4 个因子对菌核侧耳菌丝生长的影响从大到小依次是氮源温度pH碳源，其中氮源的极差最大，表示氮源是影响菌核侧耳菌丝生长的主要因素。碳源均值从大到小依次为 X1X3X2，氮源均值从大到小为 X1X2X3，pH 均值从大到 小为 X2X1X3，温 度均值从 大到小为X1X2X3，综合以上结果考虑得出最佳组合为a1b1c2d1，即碳源为蔗糖、氮源为蛋白胨、pH 为7.0、温度为 35 时菌丝生长速度最快、长势和菌丝形态最好(图 2)，与单因子实验的结果一致。对正交试验结果进行方差分析(表 3)，结果表明碳源、氮源、pH、温度这 4 个因子对菌核侧耳菌丝生长具有极显著影响(P温度pH碳源。碳源较其他 3 个因素对菌丝生长影响最小，鲁铁和图力古尔(2013)对白蜡多年卧孔菌、程国辉等(2018)对菌核多孔菌和汪阳等(2019)对裂拟迷孔菌的生物学特性研究中，碳源的影响也是最小，这些菌类在菌丝生长时，在多种因素共同作用下可能对影响较小的因素有更大的适应性。本试验初步探索了野生菌核侧耳的生长条件，成功栽培出子实体，产出的菌菇香味浓郁。据报道，菌核侧耳含有多糖类、蛋白质、氨基酸、脂肪酸及酚类化合物等多种活性成分(邓成华等 2000a；陶泳真等 2009；刘阿娟等 2014)。其中，多糖类物质具有抗肝癌细胞、抗炎、调节免疫力和降血糖血压等功效(Maxwell et al.1997；巫光宏等 2007；Palmeira et al.2008)，多糖衍生物能很好地抗 HSV-2 病毒活性(邓成华等 2000b)。酚类物质具有较强的抗氧化作用(Teissedre&Waterhouse 2000)。另外，菌核侧耳还具有化痰、平喘及抑菌的功效等(陈济琛等 2005；林陈强等 2007；杨兰 2007；方熹君等 2009)，后续试验将进一步对其栽培配方、药理活性等进行筛选，以期将该菌在热带地区夏季进行推广，虽然我国热带地区腐生真菌物种丰富(李玉等 2016；吴芳等 2020；戴玉成等 2021)，但商业化栽培的种类与温带地区比相对较少，因此，本研究也为热带地区高温季节适宜栽培食药用菌的选择提供了借鉴。REFERENCES Bao T,Li Y,2001.The species resources and ecological distribution of Pleurotus in China.Edible Fungi of China,20(5):8-10(in Chinese)Chen JC,Lin RB,Zheng YB,Cai HS,Lin CQ,Lin XJ,2005.Screening of C-sources and N-sources for mycelial growth of Pleurotus tuber-regium and its antimicrobial effect.Journal of Fujian Agriculture and Forestry University(Natural Science Edition),34(3):373-375(in Chinese)Chen XR,Ke Z,Lin FN,Zhong JF,Wu B,Yang JP,2019.Study on antioxidant activity of Pleurotus tuber-regiom in Hainan.Tropical Forestry,47(4):4-6(in Chinese)Chen ZM,Peng JP,Lu CX,Li BQ,Lin JY,Qiu CJ,Zheng YD,2013.Biological characteristics of Pleurotus centralis X.D.Yu,Z.M.Chen,Y.J.Yao,sp.nov.ined.Fujian Journal of Agricultural Sciences,28(6):561-565(in Chinese)Cheng GH,An XY,Wang X,Zhang B,Li Y,2018.Cultural characteristics and domestic 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