小鼠肺功能测定及其在放射性肺损伤中的应用_李杰.pdf

doi:1011659/jjssx10E022152基础研究小鼠肺功能测定及其在放射性肺损伤中的应用李杰，焦露，张静，陈用来，卢敬萱，舒畅，柳随义，郝玉徽(陆军军医大学军事预防医学系防原医学教研室，重庆 400038)摘要 目的使用 FlexiVent 动物肺功能仪测量放射性肺损伤小鼠的各项肺功能参数，为评估放射性肺损伤模型小鼠肺功能变化情况提供数据支撑。方法170 只 C57BL/6 小鼠随机分为对照组和辐照组，对照组再分为 C0W 组和 C24W 组，辐照组小鼠胸部经钴源一次性总剂量为 15 Gy 的 射线照射后随机分为 F8W 组、F16W 组和 F24W 组，测量小鼠体质量和肺功能指标，并对肺组织进行 HE 染色，观察肺组织病理改变。结果与 C0W 组相比，C24W 组小鼠体质量、深吸气量、呼吸系统阻力、呼吸系统顺应性、中央气道阻力和体积压力环面积明显增加(P 0 05)，呼吸系统弹性、组织弹性、静态顺应性显著降低(P 0 05)。与 C0W 组相比，辐照组小鼠体质量无明显差异(P 0 05)，F16W 组小鼠深吸气量、呼吸系统阻力、静态顺应性和小气道阻力变化显著(P 0 05)。HE 染色显示，辐照组小鼠肺泡间隔增厚和炎症细胞聚集。结论通过 FlexiVent 动物肺功能仪测定 C57BL/6 小鼠肺功能指标的参考值，可为呼吸系统疾病研究提供参考依据;其中深吸气量、呼吸系统阻力和静态顺应性等可以作为放射性肺损伤的观察指标。关键词FlexiVent;肺功能;静态顺应性;射线;放射性肺损伤 中图分类号818 文献标识码A 收稿日期2022-10-29Determination of pulmonary function in mice and its application in radiation-induced lung injuryLI Jie，QIAO Lu，ZHANG Jing，CHEN Yong-lai，LU Jing-xuan，SHU Chang，LIU Sui-yi，HAO Yu-hui(Teaching andesearch Section of Preventive Medicine，Department of Military Preventive Medicine，Army Medical University，Chongqing 400038，China)Abstract:ObjectiveThe FlexiVent animal pulmonary function instrument was used to measure various parameters of pulmonary func-tion in mice with radiation-induced lung injury，so as to provide data support for evaluating the changes of pulmonary function in mice modelwith radiation-induced lung injury MethodsA total of 170 C57BL/6 mice were randomly divided into the control group and the irradiationgroup The mice in the control group were further divided into the C0W group and the C24W group The mice in the irradiation group were基金项目国家重点实验室开放课题(SKLZZ201903);重庆市科技攻关计划(2022NSCQ-MSX4675)通信作者郝玉徽，E-mail:yuhui_hao126 com 11 Hao Y，en J，Liu C，et al Zinc protects human kidney cells fromdepleted uranium-induced apoptosis J Basic Clin Pharmacol Toxicol，2014，114(3):271 280 doi:10 1111/bcpt 12167 12Mahmood T，Qureshi IZ，Iqbal MJ Histopathological and biochemicalchanges in rat thyroid following acute exposure to hexavalent chromiumJ Histol Histopathol，2010，25(11):1355 1370 doi:10 14670/hh 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esultsCompared with the C0W group，the body weight，inspiratory capacity，respiratory resistance，respiratory compliance，central airway resistance，and pressure-volume loop area in the C24W group were significantlyincreased(P 0 05)，while the respiratory elasticity，tissue elasticity and static compliance were significantly decreased(P 0 05)Compared with the C0W group，there was no significant difference in the body weight of mice in the irradiation group(P 0 05)，but therewere significant changes in the inspiratory capacity，respiratory resistance，static compliance and small airway resistance of mice in the F16Wgroup(P 0 05)HE staining showed that the alveolar septa of the irradiation group thickened and gathered the inflammatory cellsConclusionThe reference values of pulmonary function indexes of C57BL/6 mice measured by FlexiVent animal pulmonary function instru-ment can provide a reference basis for the study of respiratory diseases;among them，the inspiratory capacity，respiratory resistance and staticcompliance can be used as the observation indicators of radiation-induced lung injuryKeywords:FlexiVent;pulmonary function;static compliance;gamma ray;radiation-induced lung injury肺功能检查是临床上常见的检查，常用于健康人群体检和呼吸系统疾病检查，在呼吸系统疾病的早期筛查和诊断中具有重要作用1-2。临床上的肺功能检查是一种无创检查，主要包括通气功能、弥散功能、舒张试验和激发试验等，结合纤支镜检查可以很好地定量测定支气管气道收缩性、肺弹性和呼吸系统阻力等。在动物模型上开展纤支镜检查实验成本高，操作难度大，技术要求高，所以很少运用。目前小鼠呼吸系统疾病模型的肺功能检查主要有无创检查和有创检查。无创检查以整体体积描记法3 为主，该法具有操作简便、适合大样本研究等优点，但其易受环境影响，参数波动范围大。随着传感器等精密仪器的发展，有创的振荡法4-5 定量检测动物肺功能得到了广泛应用，该法操作简便，参数稳定。然而国内外鲜有研究报道小鼠肺功能检查的各项参数值，或仅选取个别参数进行研究，后续研究者不能全面掌握肺功能各项指标对模型的评估。因此，本研究利用 FlexiVent 动物肺功能仪对C57BL/6 小鼠肺功能进行检测，确定各项参数值，为放射性肺损伤以及其他呼吸系统疾病模型提供数据支撑。放射性肺损伤是胸部肺组织受到大剂量放射线照射所致的疾病，常见于肿瘤放射治疗患者与核辐射事故现场大剂量照射人员，临床上主要分为放射性肺炎和放射性肺纤维化两个阶段6-7。放射性肺炎可以通过脱离放射线和激素治疗好转，而放射性肺纤维化的致病机制尚未明确，临床上尚缺乏有效的治疗措施8。研究发现放射性肺损伤过程中一些因子表达异常增高，如 TGF-1、SMAD3、nrf2 和 mi-21 等9。呼吸系统疾病动物模型中也发现了一些肺功能参数的改变4-5。但是这些指标都是某一个时间点的结果，缺乏动态演变的过程。因此，本研究通过测量小鼠肺功能基本参数，选取多个时间点观察辐照小鼠肺功能的变化情况，以期找到放射性肺损伤的早期功能损伤标志，为放射性肺损伤的预防和治疗提供新的思路。1材料与方法1 1主要实验材料170 只雄性 C57BL/6 小鼠，5 周龄，体质量 18 20 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号:SCXK(湘)2019-0004。基础饲料由陆军军医大学实验动物中心提供，小鼠饲养于清洁级动物房，日光灯模拟昼夜变化。本实验经陆军军医大学实验动物福利伦理委员会批准(AMUWEC20210489)。FlexiVent动物 肺 功 能 检 测 仪10 由 加 拿 大 生 产，带 有 FX2(4 2 mL气缸)模块和 FX4(28 4 mL 气缸)模块，配备大鼠和小鼠 Y 型适配器和接头，本实验使用 FX2 小鼠模块。HE 染色试剂盒(批号:20200911)购自北京索莱宝生物有限公司。1 2构建放射性肺损伤动物模型170 只 C57BL/6 小鼠适应性饲养 1 周后，随机分为对照组(80 只)和辐照组(90 只)，对照组再分为C0W 组(6 周龄，50 只)和 C24W 组(30 周龄，30 只);辐照组再分为 F8W 组、F16W 组和 F24W 组，每组30 只，F8W、F16W 和 F24W 分别表示辐照后 8 周、16 周和 24 周。所有小鼠用 1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，医用胶带标出小鼠肺上下界并固定在硬纸板上。辐照组小鼠胸部(医用胶带标出的肺上下界之间的部位)单次接受钴源 射线照射，照射剂量为 15 Gy11，剂量率为 0 65 Gy/min，总照射时间为 23 min，小鼠胸部以外区域使用 8 cm厚的铅块遮挡保护以防止辐射。对照组小鼠接受模拟照射(0 Gy)。照射后小鼠继续饲养于动物房，自由进食和饮水，对照组分别于模拟照射后 0 周和 24 周检测肺功能;辐照组分别于照射后8 周、16 周和 24 周检测肺功能。1 3气管插管各组小鼠称重编号后使用 1%戊巴比妥钠腹腔注791局解手术学杂志J EG ANAT OPE SUG2023，32(3)http:/www jjssxzz cn射深度麻醉，解剖台上固定四肢，手术刀切开颈部皮肤，长度 1cm 左右，镊子钝性分离皮下组织，充分暴露气管，眼科镊从气管下穿过绷紧气管，剪刀斜向鼠尾部45剪一“V”形缺口，气管插管从缺口处缓慢插入，眼科镊带 1 号线穿过气管，打结固定气管插管，与肺功能仪接口连接后，开始检测肺功能。1 4肺功能检测小鼠编号录入 FlexiVent 软件操作系统，选择 FX2小鼠模块，进行仪器气密性检测，选择测量指标:深吸气量、呼吸系统阻力、呼吸系统弹性、呼吸系统顺应性、中央气道阻力、组织能量衰减、组织弹性、静态顺应性、体积压力环面积和形态常数。将插管好的小鼠连接 Y型适配器后开始检测，每只小鼠重复测量 3 次，取平均值。计算小气道阻力，小气道阻力=呼吸系统阻力 中央气道阻力。深吸气量:从呼气末扩张至肺充盈状态时的气体体积，可用于估算深吸气量;肺充盈状态是指肺部压力达到 30 cmH2O 时肺的体积。呼吸系统阻力:包含了气道、组织、胸壁的阻力，表示气道收缩程度。呼吸系统弹性:胸腔闭合情况下，肺的扩张性，表示组织的僵硬程度。呼吸系统顺应性:表示组织的伸展能力。中央气道阻力:表示大的传导气管的气道阻力，不包括参与气体交换的小气道。组织能量衰减:检测信号的总能量在组织中转化为热量的部分，代表肺泡组织收缩程度。组织弹性:振荡检测使其改变形态时组织回缩到其原始形态的能力，表示肺泡组织僵硬程度。静态顺应性:于胸腔闭合状态下检测，表示呼吸系统内在的弹性特性。体积压力环面积:吸入的气体总量，可用于估算深吸气量。形态常数:描述压力体积曲线的曲率，可用于区分动物年龄。1 5肺功能仪的检测原理FlexiVent 肺 功 能 检 测 仪 采 用 强 迫 振 荡 技 术(forced oscillation technique，FOT)向动物发送一个可控的体积或压力信号，检测动物气道的压力和流速信号12。FOT 利用外置的正弦波发生器产生振动压力传入气管，将压力传导至整个呼吸系统，在受试动物平静呼吸的同时振动波叠加在受试动物呼吸的压力和流量曲线上，通过对其气道压力和流速的连续记录和分析，可求出呼吸总阻抗。不同振荡频率所反映的呼吸阻抗特性有所不同。1 6HE 染色肺组织用 4%多聚甲醛固定 72 h，脱水，石蜡包埋，切片(3 5 m)，梯度酒精水化脱蜡。伊红染色:伊红染液处理5 min，水洗;苏木素染色:苏木素染液处理30 s，自来水背面冲洗，盐酸酒精分化;二甲苯透明后中性树胶封片。显微镜下观察肺组织改变情况并拍照。1 7统计学分析使用 GraphPad Prism 9 0 软件进行数据整理和统计学分析，数据以均数标准差(x s)表示，2 组间比较采用 t 检验;多组间比较采用单因素方差分析。P 0 05表示差异有统计学意义。2结果2 1各组小鼠体质量比较C24W 组小鼠体质量为(30 19 3 23)g，C0W 组小鼠体质量为(22 36 2 66)g，组间比较差异有统计学意义(P 0 01)。F8W 组小鼠体质量为(24 21 3 86)g，F16W 组体质量为(23 63 1 90)g，F24W 组体质量为(22 22 3 07)g。与 C24W 组相比，各辐照组体质量明显减轻，差异有统计学意义(P 005);C0W组与各辐照组体质量比较差异无统计学意义(P 005)。2 2各组小鼠肺功能指标比较与 C0W 组相比，C24W 组小鼠的深吸气量、呼吸系统阻力、呼吸系统顺应性、中央气道阻力和体积压力环面积明显增加(P 0 05)，而呼吸系统弹性、组织弹性和静态顺应性显著降低(P 0 05);C0W 组和C24W 组小鼠组织能量衰减、形态常数和小气道阻力比较差异无统计学意义(P 0 05)。与 C0W 组相比，F8W 组仅呼吸系统顺应性增加(P 0 05)，F16W 组呼吸系统阻力、呼吸系统顺应性、组织能量衰减和小气道阻力等反映气道阻力的指标显著增加(P 0 05)，F24W 组小鼠呼吸系统阻力、呼吸系统顺应性、组织能量衰减和中央气道阻力明显增大(P 0 05)。与 F8W 组相比，F16W 组和 F24W 组深吸气量减少(P 0 05)，呼吸系统阻力显著增加(P 0 05)，同时，F16W 组组织能量衰减、小气道阻力明显增大(P 0 05)。与 F16W 组相比，F24W 组仅中央气道阻力明显增加(P 0 05)，见表1。2 3辐照加重小鼠肺组织损伤C24W 组小鼠肺泡出现少许塌陷，炎症细胞浸润，肺泡间隔稍增厚，与 C0W 相比无显著变化。随着饲养周期的延长，辐照组小鼠肺泡出现大量的炎症细胞浸润和血细胞渗出，肺泡大量塌陷变形，F16W 组小鼠肺组织蜂窝状改变，肺泡间隔出现致密的胶原纤维;F24W 组小鼠出现肺泡闭锁改变。各辐照组肺泡间隔厚度较 C0W 组增加(P 0 05)，见图 1。891局解手术学杂志J EG ANAT OPE SUG2023，32(3)http:/www jjssxzz cn表 1小鼠肺功能参数变化(x s)检测指标C0W 组(n=50)C24W 组(n=30)F8W 组(n=30)F16W 组(n=30)F24W 组(n=30)深吸气量(mL)072 0 191 10 069*085 020063 022*#063 014*#呼吸系统阻力(cmH2O s mL1)078 0 331 07 050*075 033104 041*#106 032*#呼吸系统弹性(cmH2O/mL)29 66 53626 18 657*2612 6092837 3782633 374*呼吸系统顺应性(mL/cmH2O)003 0 010 04 001*004 001*004 001*004 001*中央气道阻力(cmH2O s mL1)030 0 260 51 017*033 022026 020046 028组织能量衰减(cmH2O/mL)470 0 69479 109465 131*602 177*#572 178*组织弹性(cmH2O/mL)27 67 54521 91 585*2344 6272891 6752798 5 88静态顺应性(mL/cmH2O)007 0 010 06 001*007 002005 002*#006 002*体积压力环面积(mL cmH2O)177 0 422 23 044*202 052143 048*#164 036形态常数011 0 01011 001011 001009 002*#010 002小气道阻力(cmH2O s mL1)045 0 08043 011042 015071 042*#061 021*:与 C0W 组相比，P 0 05;#:与 F8W 组相比，P 0 05;:与 F16W 组相比，P 0 05a:小鼠肺组织切片 HE 染色结果;b:肺泡间隔厚度半定量结果*:与 C0W 组相比，P 0 05图 1小鼠肺组织 HE 染色结果3讨论多频振荡技术检测肺功能已经广泛用于急性肺损伤、慢性阻塞性肺疾病和哮喘等呼吸系统疾病中，对肺组织损伤的评估起到了很好的辅助作用13-15。呼吸系统阻力包含了各级支气管和周围肺组织的阻力，也包括胸壁回缩对呼吸产生的阻力，其广泛运用于气道管腔狭窄、扭曲变形和痰痂形成等疾病检测中。本研究发现，辐照后 8 周的小鼠呼吸系统阻力与 C0W 组小鼠相比变化不明显，辐照后 16 周和 24 周的小鼠呼吸系统阻力较 C0W 组小鼠显著增加。有研究表明，小鼠胸部局部辐照后 2 周，肺泡间隔中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等炎症细胞浸润，肺泡结构变化不大9。本研究中小鼠辐照后 8 周的呼吸系统阻力、中央气道阻力和静态顺应性与 C0W 组相比无明显变化，也验证了这一结果。进一步分析发现 F8W 组呼吸系统顺应性较 C0W 组小鼠增大，呼吸系统顺应性越大，表示呼吸运动时需要更大的压力来扩张肺组织，一定程度反映肺组织的损伤情况，可以作为放射性肺损伤的早期检测指标。小气道损伤是一个能够较好地反映放射性肺损伤的指标，通过计算呼吸系统阻力和中央气道阻力的差值可以得到小气道阻力的具体数值，从而分析细支气管痉挛和肺泡分泌物变化情况。静态顺应性降低可见于肺水肿、肺实质变性、肺纤维化和肺不张等疾病16-17，也见于一些肺外组织的生理性或病理性改变，如气胸、胸腔积液、脊柱侧弯和腹型肥胖等18-20。本研究中 C24W 组小鼠体质量较 C0W 组明显增加，肺组织生理性增大致深吸气量和体积压力环面积增加，呼吸系统阻力的增加和组织弹性降低等可能与组织的衰老退行性变有关。我们通过对模拟辐照小鼠的肺功能检测结果进行分析发现，形态常数保持稳定，说明其与小鼠体质量的关系不大;给予小鼠同样的气体体积压力，与 C0W 组相比，F16W 组小鼠的形态常数减小，肺组织的收缩能力减弱，病理染色结果证实 F16W 组小鼠肺组织蜂窝状改变，肺泡间隔致密的胶原纤维形成，肺组织僵硬，所以肺功能形态常数变小。同理，衰老是肺功能降低的一个重要生理因素，可以通过测定模拟辐照小鼠不同年龄段的肺功能建立小鼠年龄与形态常数的关系函数，然后通过小鼠的形态常数推算其年龄大小。本研究中各辐照组小鼠的体质量与 C0W 组小鼠991局解手术学杂志J EG ANAT OPE SUG2023，32(3)http:/www jjssxzz cn无明显差异，且较 C24W 组小鼠轻，所以辐照组小鼠选择 C0W 组小鼠的肺功能指标作为基线参考。F16W组小鼠呼吸系统阻力和小气道阻力明显增加，深吸气量、静态顺应性、体积压力环面积和形态常数显著降低;结合肺组织病理染色结果，F16W 组小鼠肺组织纤维化已经形成。因此深吸气量、静态顺应性和小气道阻力等肺功能指标可作为小鼠辐照后 16 周左右的观察指标。F24W 组小鼠的肺功能出现了新的特征，中央气道阻力显著增大，表明小鼠的肺损伤已经从周围肺泡组织蔓延到气管，而这一结果在病理染色中得到了证实。因此，对辐照后 24 周左右的小鼠进行肺损伤评估，中央气道阻力是可参考的指标。小鼠胸部放射线照射会导致肺组织损伤，持续发展会导致肺泡间隔增厚，肺泡闭锁，进而导致吸气性呼吸困难。本研究对 C57BL/6 小鼠的肺功能参数进行了基本的测定，并在放射性肺损伤小鼠模型中进行了初步应用，得到了令人满意的效果。然而针对哮喘等呼气性呼吸困难疾病的指标参数还有待后续检测。总之，本研究通过选取多个时间点观察辐照小鼠肺功能的变化情况，找到了一些肺功能损伤标志，为放射性肺损伤的预防和治疗提供了新的思路。参考文献 1朱能洋，韩志海，陈旭昕，等 慢性阻塞性肺疾病 患 者肺功能MMEF/FVC 与 FeNO、血清标志物的相关性及意义 J 解放军医学院学报，2022，43(4):371 376 doi:10 3969/j issn 2095 52272022 04001 2叶艳平，赵航，张萍 无症状健康体检者肺通气功能异常检出率及其小气道功能障碍相关危险因素分析 J 中华健康管理学杂志，2022，16(6):389 394 doi:10 3760/cma j cn115624 20220119 00050 3李树民，张敏，王朋，等 小鼠无创性肺功能的测定及其意义J 中国实验动物学报，2018，26(5):548 553 doi:10 3969/jissn 1005 4847 2018 05 002 4陈剑波，张丽娟，邱念念，等 吉祥草水提物对小鼠慢性阻塞性肺疾病的作用和机制J 贵州医科大学学报，2020，45(12):1412 1416 doi:10 19367/j cnki 2096 8388202012 009 5Ayaub EA，Kolb PS，Mohammed-Ali Z，et al GP78 and CHOP modu-late macrophage apoptosis and the development of bleomycin-inducedpulmonary fibrosisJ J Pathol，2016，239(4):411 425 doi:101002/path4738 6 Li Y，Shen Z，Jiang X，et al Mouse mesenchymal stem cell-derivedexosomal mi-466f-3p reverses EMT process through 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