小檗碱通过抑制肝星状细胞自噬改善小鼠肝纤维化_谭悦浩.pdf

Journal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.1成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 1 期33网络出版地址：https：/ doi：10.3969/j.issn.1674-2257.2023.01.007论著小檗碱通过抑制肝星状细胞自噬改善小鼠肝纤维化*谭悦浩1，李灿2，邓峰美3，张嫔4，刘漪沦4，51.四川护理职业学院（成都 610100）；2.四川大学（成都 610000）；3.成都医学院（成都 610500）；4.雅安市名山区人民医院（雅安 625100）；5.成都医学院临床医学院第一附属医院 四川省老年医学临床医学研究中心（成都 610500）【摘要】目的研究小檗碱（BBR）对肝星状细胞（HSC）自噬与活化的调控及其抗肝纤维化作用。方法分别采用不同质量浓度BBR（0、2、5、10、20、50 mol/L）干预血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB，20 g/L）处理的LX-2细胞 24 h，使用CCK-8法检测细胞活力；采用不同质量浓度BBR（0、2、5、10 mol/L）干预PDGF-BB（20 g/L）处理的LX-2细胞 24 h或 48 h，使用 5-乙炔基-2脱氧尿嘧啶核苷（EdU）方法检测细胞增殖率，细胞划痕实验检测细胞迁移率。实时荧光定量聚合酶链式反应、免疫印迹法检测小檗碱（5 mol/L）对LX-2细胞-SMA，COL1A1 mRNA及蛋白表达的影响；检测Atg5、Becn1、Atg7、LC3、p62的表达。动物实验共 18只小鼠，随机分为 3组，对照组橄榄油（Oil）+磷酸盐缓冲液（PBS）、模型组四氯化碳（CCl4）+PBS和药物干预组（CCl4+BBR），每组 6只小鼠，造模 5周，2 次/周。第 3周开始给与BBR干预，2次/周，连续给药 3周。造模 5周后处死小鼠，检测各组小鼠肝脏组织中的羟脯胺酸水平，苏木素-伊红（HE）和天狼星红染色观察肝脏组织炎性细胞浸润及胶原沉积情况。结果BBR作用LX-2细胞 24 h的半数抑制浓度（IC50）为（31.512.66）mol/L；BBR可呈剂量依赖性地抑制LX-2细胞的增殖及迁移（P 0.05）。BBR（5 mol/L）下调LX-2细胞的-SMA、COL1A1 mRNA和蛋白表达水平，抑制细胞活化（P 0.05）。BBR（5 mol/L）下调LX-2细胞的Atg5 mRNA和蛋白表达水平，上调p62蛋白表达水平及减少LC3-/LC3-比值，抑制细胞自噬（P 0.05）。CCl4+BBR与CCl4+PBS组小鼠肝脏比较，BBR干预后，肝细胞脂肪变性坏死和炎性细胞浸润明显减轻，胶原纤维沉积减少，羟脯胺酸含量减少（P 0.05）。结论BBR在小鼠体内具有抗肝纤维化的作用，在体外可抑制LX-2细胞的增殖、迁移及活化，这可能与BBR抑制HSC 自噬水平有关。【关键词】小檗碱；自噬；肝星状细胞；肝纤维化【中图分类号】R575【文献标志码】ABerberine Relieves Liver Fibrosis in Mice by Inhibiting Autophagy of Hepatic Stellate Cells Tan Yuehao1，Li Can2，Deng Fengmei3，Zhang Pin4，Liu Yilun4，5.1.Sichuan Nursing Vocational College，Chengdu 610100，China；2.Sichuan University，Chengdu 610000，China；3.Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China；4.People s Hospital of Mingshan District，Ya an 625100，China；5.Sichuan Clinical Research Center for Geriatrics，School of Clinical Medicine of Chengdu Medical College The First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China【Abstract】ObjectiveTo study the regulation of berberine（BBR）on autophagy and activation of hepatic stellate cells（HSC）and its anti-fibrosis effect.MethodsLX-2 cells pretreated with platelet-derived growth factor-BB（PDGF-BB，20 g/L）were treated with different concentrations of BBR（0，2，5，10，20，50 mol/L）for 24 h，and the cell viability was detected by cell counting kit-8（CCK-8）.LX-2 cells pretreated with PDGF-BB（20 g/L）were treated with different concentrations of BBR（0，2，5，10 mol/L）for 24 h or 48 h，and the cell proliferation rate was detected by 5-acetyne-2 deoxyuracil nucleoside（EdU）method and the cell migration rate was detected by scratch test.The effects of BBR（5 mol/L）on mRNA and protein expressions of-SMA and COL1A1 in LX-2 cells were detected by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction（qPCR）and western blotting.The expressions of Atg5，Becn1，Atg7，LC3 and p62 were detected.*基金项目：雅安市科学技术局应用技术研究与开发项目（No：2020yyjskf05）；成都医学院研究生科研创新基金（No：YCX2020-14，No：YCX2020-25）通信作者：刘漪沦Journal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.1成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 1 期34肝纤维化是由于持续的肝脏慢性损伤和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）积累所造成的结果，是多数慢性肝病共同的病理特征1。肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝纤维化形成的关键因素。各种因素导致HSC被激活，分化为肌成纤维细胞样细胞，同时向胞外分泌ECM，在肝纤维化的发展中发挥着至关重要的作用2。自噬是一个“自己吃自己”的过程，受损的细胞器和错误折叠的蛋白质被送入溶酶体进行降解，维持细胞的内稳态3。自噬在生物进化上高度保守，在生命活动中起着重要作用，同时也与许多人类疾病的发生发展有关4。研究5发现，HSC自噬水平的提高是其活化的重要因素，反过来通过抑制活化HSC的自噬，可抑制HSC活化、增殖，成为预防肝纤维化的有效治疗策略。小檗碱（Berberine，BBR）又称黄连素，广泛分布于黄连等各类药用植物中。BBR具有多种药理作用，在改善肥胖6、抗炎7、改善胰岛素抵抗8等方面有着不错的疗效。研究9-10证明，BBR可通过抑制细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，影响多种类型肿瘤细胞的活力，具有显著的抗肿瘤效果。在肝纤维化治疗方面，BBR可通过调节抗氧化系统和脂质过氧化作用，通过核因子B（nuclear factor B，NF-B）诱导细胞活化的HSC凋亡来改善实验性肝纤维化11-12。尽管BBR对肝纤维化有明显疗效，然而其具体的作用机制还未被完全阐明。因此，本研究旨在探索BBR对肝纤维化的作用及其分子机制，为肝纤维化防治提供药物开发的理论基础。1材料与方法1.1实验动物从成都达硕实验动物中心购买 18只 6周龄的雄性C57BL/6小鼠。所有小鼠饲养于成都医学院实验动物中心，每天给予光照 12 h，湿度为 5060，室内温度 1924，保证充足的水和饲料供应。实验操作符合成都医学院委员会标准。1.2主要试剂及仪器DMEM高 糖 培 养 基（BI，以 色 列），胎 牛 血 清（Cellmax，美国），抗COL1A1鼠单克隆抗体（Santa Cruz，美国），抗-SMA鼠单克隆抗体（Millipore，美国），抗p62、LC3B、ATG5兔 多 克 隆 抗 体（CST，美 国），抗GAPDH鼠单克隆抗体（Proteintech，武汉），血小板衍生生长因子-BB（platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB）（Novus，美 国），1 mol/L Tri-Hcl pH=6.8，1.5 mol/L Tri-Hcl pH=8.8，Cy3-荧光二抗、羟脯胺酸检测试剂盒、5-乙炔基-2 脱氧尿嘧啶核苷（5-acetyne-2 deoxyuracil nucleoside，EdU）细胞增殖检测试剂盒（碧云天公司，上海）。1.3实验方法1.3.1LX-2培养及分组LX-2细胞系是由首都医科大学肝病研究所殷继亮教授赠送。LX-2细胞使用PDGF-BB（20 g/L）进行预处理，采用不同质量浓 度BBR的 5个 干 预 组（终 浓 度 分 别 为 2、5、10、20、50 mol/L）和加入不含有BBR的蒸馏水作为对照组。1.3.2BBR对LX-2 细 胞 增 殖 的 影 响96孔板中接种适当密度的LX-2细胞，按照“1.3.1”分组，分别加入含有相应质量浓度BBR的新鲜培养基，培养 24 hEighteen male C57BL/6 mice were randomly divided into 3 groups：control group n=6，Oil+phosphate buffer solution（PBS），model group n=6，carbon tetrachloride（CCl4）+PBS，and drug intervention group（n=6，CCl4+BBR），modeled for 5 weeks，twice a week.BBR intervention was started at week 3，twice a week for 3 weeks.After 5 weeks of modeling，the mice were sacrificed.The hydroxyproline content in the liver tissues of each group was detected.The inflammatory cell infiltration and collagen deposition in liver tissues were observed by hematoxylin-eosin（HE）and Sirius red staining.ResultsThe half maximal inhibitory concentration（IC50）of BBR on LX-2 cells for 24 h was（31.512.66）mol/L.BBR inhibited the proliferation and migration of LX-2 cells in a dose-dependent manner（P 0.05）.BBR（5 mol/L）down-regulated mRNA and protein levels of-SMA and COL1A1 in LX-2 cells，and inhibited cell activation（P 0.05）.BBR（5 mol/L）down-regulated mRNA and protein expression of Atg5 in LX-2 cells，up-regulated p62 protein level，reduced LC3-II/LC3-I ratio，and inhibited autophagy（P 0.05）.Comparison of liver between CCl4+BBR group and CCl4+PBS group found that after BBR intervention，steatosis，necrosis and inflammatory cell infiltration of hepatocytes were significantly alleviated，collagen fiber deposition was reduced，hydroxyprolinate content was decreased（P 0.05）.ConclusionFor mice，BBR has an anti-fibrosis effect in vivo and can inhibit the proliferation，migration and activation of LX-2 cells in vitro，which may be related to its inhibition of HSC autophagy level.【Key words】Berberine；Autophagy；Hepatic stellate cells；Liver fibrosisJournal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.1成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 1 期35后，分别加入 10 L CCK-8试剂，在 37 条件下孵育2 h，使用酶标仪在 450 nm波长下测定吸光度值。将LX-2细胞以 2104个/孔的密度接种于 24孔板中，采用不同质量浓度的BBR（2、5、10 mol/L）刺激 24 h后，使用EdU方法检测LX-2细胞增殖率。1.3.3BBR对LX-2细胞迁移的影响将LX-2细胞分为两组，即磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）组、PDGF-BB（20 g/L）组，其中每组包括不同质量浓度BBR的 3个干预组（终浓度分别为 2.5、5、10 mol/L）和加入不含有BBR的蒸馏水作为对照组。6孔板中接种适当密度的LX-2细胞并进行培养，48 h后使用移液枪枪头制造划痕，PBS洗涤，再更换成新鲜的含有 2血清的培养基，继续培养 24 h后，在光学显微镜下进行白光拍照，计算各组划痕区面积。1.3.4小鼠肝纤维化模型建立及药物干预将 18只小鼠按照随机分配分为 3组，即对照组橄榄油（Oil）+PBS、模型组四氯化碳（CCl4）+PBS和药物干预组（CCl4+BBR）。模型组和药物干预组的小鼠经腹腔注射CCl4，用于建立肝纤维化小鼠模型，单次注射剂量为4 mL/kg，2 次/周，共 5周，对照组给予等剂量Oil。在造模第 3周时，药物干预组的小鼠经腹腔注射BBR溶液，给药剂量为 100 mg/kg，2 次/周，连续 3周。1.3.5肝脏组织羟脯胺酸检测将小鼠肝纤维化造模结束后，处死小鼠，取各组小鼠 0.2 g的新鲜肝脏组织，将组织剪碎，加入组织提取液，放置于 110 烘箱中裂解过夜，室温，12 000 r/min，离心半径 13.5 cm，离心 20 min，取上清待测。羟脯胺酸检测的步骤按照试剂盒说明书进行操作。1.3.6 蛋 白质印迹技术检测蛋白表达LX-2细胞接种于 6孔板中，分成 3组，即对照组（PBS）、模型组（PDGF-BB+PBS）和 药 物 干 预 组PDGF-BB+BBR（5 mol/L），处理 24 h后，收集细胞，提取总蛋白。加入一定量的上样缓冲液于蛋白混合，进行SDS-PAGE电泳，湿转方法以恒定电流 200 mA转膜 1.5 h，5脱脂牛奶室温封闭 1 h。一抗（-SMA 12 000；COL1A1 1300；p62 11 000；ATG5 11 000；LC3 11 000；GAPDH 15 000），4 孵育过夜。次日，三羟甲基氨基 甲烷缓冲盐吐温溶液（tris buffered saline tween，TBST）洗涤，二抗（山羊抗兔、抗小鼠均 13 000稀释）室温孵育 2 h，TBST 洗膜，加入增强型化学发光（enhanced chemiluminescent，ECL）反应，最后化学发光成像仪 曝光13。1.3.7细胞免疫荧光检测蛋白表达LX-2细胞以2104个细胞/孔接种于预先放置好细胞爬片的 24孔板中，分组方式同“1.3.6”。倒掉上清，PBS洗涤，4多聚甲醛固定 30 min，PBS洗涤，0.5 TritonX-100室温进行细胞通透 15 min，PBS洗涤。5山羊血清室温固定 1 h，一抗（LC3 1300），4 孵育过夜，洗掉一抗，加Cy3标记的山羊抗兔的荧光二抗（1500），37 避 光 孵 育 1 h，加 4，6-二 脒 基-2-苯 基 吲 哚（4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染 核 5 min，甘油封片13。1.3.8 实时荧光定量聚合酶链式反应检测mRNA 表达LX-2细胞处理方式同“1.3.6”。引物序列：-SMA：上游 5-CTACGTGGGTGACGAAGCAC-3，下游5-CCATGTCGTCCCAGTTGGTG-3；COL1A1：上游 5-GCGAGAGCATGACCGATGGATTC-3，下游5-GCCTTCTTGAGGTTGCCAGTCTG-3；Atg5：上游 5-AGCAACTCTGGATGGGATTGC-3，下游 5-GCCACAGGACGAAACAGCTT-3；Becn1：上游5-GGAGCTGCCGTTATACTGTTCTGG-3，下游5-TGCCTCCTGTGTCTTCAATCTTGC-3；Atg7：上游 5-GCAAGCCCGCAGAGATGTGGA-3，下游 5-GCAGCAATGACGGCAGGAAGC-3；GAPDH：上游 5-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3，下游5-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3。实时荧光定量聚合酶链式反应的条件为：95 预变性 30 s，95 变性 10 s，62 退火延伸 30 s，循环 35次。以GAPDH为内参，采用 2Ct法计算各组基因相对表达量13。1.4统计学方法采用GraphPad Prism 7统计软件进行数据处理，定量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，检验水准除特别说明外均设定为 0.05。2结果2.1BBR 对 HSC 增殖的影响不同质量浓度BBR处理的LX-2细胞分别与对照组（BBR质量浓度为 0 mol/L）比较，随着BBR干预质量浓度的升高，LX-2细胞在BBR干预质量浓度为 5、10、20、50 mol/L时，细胞活力明显受到抑制（81.2704.488）、（68.0705.201）、（59.1303.547）、（47.8003.804）（P0.05）。BBR干预质量浓度为 2 mol/L时，与对照组（BBR质量浓度为 0 mol/L）组间比较，差异无Journal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.1成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 1 期36力，同时EdU实验结果显示，BBR质量浓度为 5 mol/L或 10 mol/L时，均能抑制PDGF-BB处理的LX-2细胞增殖（61.1307.350）、（44.6707.100）（P0.05），呈现浓度依赖性（图 1）。统计学意义（98.7001.400）（P0.05）。计算得到BBR对PDGF-BB处理的LX-2 细胞作用 24 h的IC50约为（31.5102.660）mol/L。BBR质量浓度为 5、10、20、50 mol/L均能抑制PDGF-BB处理的LX-2细胞活图 3BBR对LX-2细胞活化的影响注：AB：-SMA和COL1A1 mRNA表达结果；C：-SMA和COL1A1蛋白表达结果；DE：蛋白表达统计分析结果；*P0.05，*P0.01，*P0.001。2.3BBR 对 HSC 活化的影响PBS或PDGF-BB或BBR干预LX-2 细胞 24 h，PDGF-BB+PBS组相较于PBS组，LX-2细胞中-SMA、COL1A1的mRNA（2.7300.423）、（1.5760.162）和蛋白（4.1620.433）、（3.4200.300）表达明显升高（P0.05）。PDGF-BB+BBR组 相 较 于PDGF-BB+PBS组，LX-2细胞的-SMA、COL1A1 的mRNA（1.8970.273）、（1.2020.200）和蛋白（2.8910.267）、（2.1400.382）表达明显降低（P0.05）（图 3）。2.2BBR 对 HSC 迁移的影响BBR干预PDGF-BB处理的LX-2细胞 48 h，随着BBR干预质量浓度的升高，LX-2细胞在BBR干预质量浓度为 5、10 mol/L时，LX-2细胞迁移能力受到抑制，迁移距离明显少于对照组（BBR质量浓度为 0 mol/L）（0.6500.040）、（0.5800.050）（P0.05）。BBR干预质量浓度为 2 mol/L时，与对照组组间比较，差异无统计学意义（0.7900.050）（P0.05）（图 2）。图 1BBR对LX-2细胞增殖的影响注：A：CCK-8法检测细胞增殖；B：EdU检测细胞增殖；C：EdU阳性细胞率统计分析；*P0.05，*P0.01，*P0.001。150100500025102050BBR/(mol/L)ABBBR/(mol/L)EdUhoechst重合02510BBR/(mol/L)15010050025100EdU阳性细胞率C*2.4BBR 对 HSC 自噬的影响PBS或 PDGF-BB或 BBR干预LX-2细胞 24 h，PDGF-BB+PBS组相较于PBS组，LX-2细胞的Atg5 mRNA（2.9260.437）和 蛋 白（2.1260.276）图 2BBR对LX-2细胞迁移的影响注：A：细胞划痕实验结果；B：细胞迁移率统计分析；*P0.01，*P0.001。BBR/(mol/L)A025100 h48 h0.80.60.40.21.00细胞迁移率BBR/(mol/L)02510B*-SMA mRNA相对表达43210PBSPDGF-BB+PBSPDGF-BB+BBRABCOL 1A1 mRNA相对表达2 0.1.51.00.50.0COL1A1-SMAGAPDHCOL 1A1 蛋白相对表达43210DE-SMA 蛋白相对表达543210C*PBSPDGF-BB+PBSPDGF-BB+BBRPBSPDGF-BB+PBSPDGF-BB+BBRPBSPDGF-BB+PBSPDGF-BB+BBRPBSPDGF-BB+PBSPDGF-BB+BBRJournal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.1成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 1 期37明 显 升 高（P0.05），Becn1（3.9400.642）和Atg7（2.3040.410）的mRNA表达明显升高（P0.05），p62（0.6870.252）蛋白积累减少，LC3-/LC3-（1.5000.345）蛋 白 表 达 的 比 值 明 显 升 高，LC3（36.5004.200）斑点增多（P0.05）；PDGF-BB+BBR组 相较于PDGF-BB+PBS组，LX-2细胞中Atg5 mRNA（1.8800.120）和蛋白（1.7650.238）表达明显降低，而Becn1（3.4800.633）和Atg7（2.4120.591）mRNA表达差异无统计学意义（P0.05），p62（1.0500.234）蛋 白 表 达 升 高，LC3-/LC3-（1.5310.213）蛋白表达的比值明显降低，LC3（21.5003.200）斑点减少（P0.05）（图 4）。2.5BBR 对肝纤维化的影响苏木素-伊红染色（HE）和天狼星红染色结果显示，Oil+PBS组中肝小叶和汇管区结构正常，肝细胞形态及大小正常，未出现肝细胞脂肪变性坏死，胶原纤维沉积以及炎性细胞浸润。而CCl4+PBS组（8.2402.840）中 肝 小 叶 结 构 紊 乱，汇 管 区 有 炎性细胞浸润，并伴有大量胶原纤维沉积。CCl4+BBR组（5.5102.270）小鼠肝脏病理变化明显改善，胶原纤维沉积相比较于CCl4+PBS组有所减少（P0.05）。ELISA方法检测肝脏中羟脯胺酸含量，发现CCl4+BBR组（386.80046.720）小鼠肝脏中羟脯胺酸含量相较于 CCl4+PBS组（537.40041.430）减少（P0.05）（图 5）。图 5BBR对小鼠肝纤维化的影响注：A：小鼠肝脏石蜡切片H&E和天狼星红染色；B：肝脏胶原沉积面积统计分析结果；C：ELISA方法检测小鼠肝脏组织中羟脯氨酸含量；*P0.001。Oil+PBSCCl+PBS4CCl+BBR4HE天狼星红染色A胶原沉积面积/（）m/HPF2151050Oil+PBSCCl+PBS4CCl+BBR4B羟脯氨酸含量（）/g/g8006004002000Oil+PBSCCl+PBS4CCl+BBR4C*图 4BBR对LX-2细胞自噬的影响注：AC：Atg5、Becn1、Atg7 mRNA表达结果；D：p62、Atg5、LC3-/蛋白表达结果；EG：蛋白表达统计分析结果；H：细胞免疫荧光实验；I：LC3斑点数量统计分析结果；*P0.05，*P0.01，*P0.001。Atg5 mRNA相对表达43210ABecn1 mRNA相对表达5B43210CAtg7 mRNA相对表达43210Dp62Atg5LC3-LC3-GAPDHAtg5/GAPDH3210ELc3-/LC3-2.01.51.00.50.0Fp62/GAPDH1.51.00.50.0G对照PDGF-BBPBSPBSBBRL 3C 阳性斑点数/个H50403020100I*PBSPDGF-BB+PBSPDGF-BB+BBRPBSPDGF-BB+PBSPDGF-BB+BBRPBSPDGF-BB+PBSPDGF-BB+BBRPBSPDGF-BB+PBSPDGF-BB+BBRPBSPDGF-BB+PBSPDGF-BB+BBRPBSPDGF-BB+PBSPDGF-BB+BBRPBSPDGF-BB+PBSPDGF-BB+BBRPBSPDGF-BB+PBSPDGF-BB+BBRJournal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.1成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 1 期383讨论肝纤维化是以ECM的过度分泌和沉积，同时其降解受阻为主要特征1。研究2证实，HSC在肝纤维化的形成中起着至关重要的作用。HSC是肌成纤维细胞的前体细胞，当肝脏受到各种因素刺激和损伤，静息态的HSC被激活，进而转化为肌成纤维细胞并过度增殖，产生大量ECM并沉积在肝脏中，从而导致肝纤维化发生。BBR通常被用于治疗腹泻。多项研究11，12，14表明，BBR能够改善小鼠的肝纤维化，机制上可能是通过促进HSC衰老、凋亡或铁死亡以改善肝纤维化，并且BBR也可调节脂质代谢和肠道菌群，逆转肝纤维化15，但BBR对HSC自噬方面的分子作用机制未得到阐明。有研究16-17采用LX-2细胞作为肝纤维化体外研究的细胞模型。因此，体外实验采用BBR对LX-2细胞进行干预，结果发现，BBR（5 mol/L）通过下调HSC活化的标志分子-SMA和COL1A1 mRNA以及蛋白的表达，可抑制PDGF-BB诱导的LX-2细胞活化，且BBR呈剂量依赖性抑制LX-2细胞增殖和迁移，这些结果验证了既往研究18。然而，LX-2细胞是一种活化、永生化的人HSC系，在生物特性上与提取的原代HSC还存在一定差异，因此需结合原代HSC进行进一步的实验验证。同时，体内实验结果发现，CCl4+PBS组小鼠相比较于Oil+PBS组，肝脏中炎性细胞浸润、胶原沉积及羟脯胺酸含量明显增多，而经过BBR干预后的肝纤维化小鼠肝脏中炎性细胞浸润、胶原沉积及羟脯胺酸含量明显减少（P0.05）。这些结果提示，BBR抗小鼠肝纤维化可能是通过抑制HSC的活化、增殖、迁移来抑制其进一步发展。自噬在调节细胞代谢和能量稳态中起着重要作用，自噬水平的改变与细胞的生存密切相关19。研究5证实，静息态HSC自噬水平很低，因此HSC中自噬水平的异常升高，是HSC激活的重要原因。自噬可能通过溶酶体降解途径，降解HSC中的脂滴，促进新陈代谢，影响HSC存活。研究18发现，Atg5是HSCs自噬、活化的关键分子，通过敲降Atg5能够降低HSC的自噬水平，促进脂滴的积累。通过体外细胞实验发现，BBR（5 mol/L）改 变LX-2细 胞 中p62和LC3表 达，Atg5 mRNA及蛋白水平下调，而不影响Becn1、Atg7 mRNA表达水平，提示BBR介导的HSC自噬抑制可能依赖于Atg5。这些结果显示，BBR是通过下调细胞自噬水平来抑制HSC活化、增殖以及迁移，从而达到抗肝纤维化效果。体外动物实验与细胞实验结果一致，这表明BBR通过调节自噬来改善肝纤维化。综上所述，本研究结果提示，BBR具有良好的抗肝纤维化效果，其机制可能是通过抑制HSC自噬抑制细胞的活化、增殖以及迁移，为肝纤维化防治提供了药物开发的理论基础和科学依据，但其抗肝纤维化的作用机制有待更进一步深入的研究。参考文献1 Asrani S K，Devarbhavi H，Eaton J，et al.Burden of liver diseases in the worldJ.J Hepatol，2019，70（1）：151-171.2 Higashi T，Friedman S L，Hoshida Y.Hepatic stellate cells as key target in liver fibrosisJ.Adv Drug 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