响应面法优化吸水链霉菌产雷帕霉素发酵培养基_张晓元.pdf

论 著收稿日期：2022-04-20基金项目：山东省重大科技创新工程（编号：2021ZDSYS07），济南市高校院所创新团队项目（编号：2019GXRC038）作者简介：张晓元，硕士，正高级工程师，研究方向：生物技术与药物，E-mail:*通讯作者：刘飞，研究员，研究方向：生化药物，E-mail:响应面法优化吸水链霉菌产雷帕霉素发酵培养基张晓元，张艳艳，孙晓康，刘英梅，张秀华，张林军，陈 勉，刘 飞*（山东省药学科学院 山东省生物药物重点实验室，山东 济南 250101）摘 要：目的 优化吸水链霉菌产雷帕霉素发酵培养基，提高雷帕霉素产量。方法 利用Plackett-Burman试验设计筛选出培养基中影响雷帕霉素发酵产量的显著因素，爬坡试验确定主要因素的最适范围，响应面法确定各显著因素的最优水平。结果 获得最优发酵培养基配方为：葡萄糖 37.60 g/L、甘露醇 30 g/L、黄豆粉 28.37 g/L、硫酸铵 1.25 g/L、磷酸氢二钾 5 g/L、磷酸二氢钾 5 g/L、L-赖氨酸 1.5 g/L、复合氨基酸 1.83 g/L。结论 在最优发酵培养基培养下，雷帕霉素发酵水平由初始182.23 mg/L提高到279.56 mg/L，提高了53.41%。关键词：吸水链霉菌；雷帕霉素；响应面试验；发酵培养基 中图分类号：Q93-335 文献标识码：A 文章编号：1672-979X（2023）01-0001-05DOI：10.3969/j.issn.1672-979X.2023.01.001Optimization of Streptomyces Hygroscopicus Medium for Production of Rapamycin by Response Surface MethodologyZHANG Xiao-yuan,ZHANG Yan-yan,SUN Xiao-kang,LIU Ying-mei,ZHANG Xiu-hua,ZHANG Lin-jun,CHEN Mian,LIU Fei(Key Laboratory of Biopharmaceuticals,Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences,Jinan 250101,China)Abstract：Objective To optimize rapamycin-producing Streptomyces hygroscopicus medium and improve the yield of rapamycin.Methods Plackett Burman experimental design was applied to screen out the significant factors affecting the fermentation yield of rapamycin in fermentation medium.The main factors were tested through the steepest ascent method to get the optimal rangeFinally,the Response Surface Methodology was used to determine the optimal level of each significant factor.Results The optimal formulation of fermentation medium was:glucose 37.60 g/L,mannitol 30 g/L,soybean powder 28.37 g/L,ammonium sulfate 1.25 g/L,dipotassium hydrogen phosphate 5 g/L,potassium dihydrogen phosphate 5 g/L,L-lysine 1.5 g/L and compound amino acid 1.83 g/L.Conclusion Under the optimal fermentation medium,the fermentation level of rapamycin can be increased from 182.23 mg/L to 279.56 mg/L,with an increase of 53.41%.Key words：Streptomyces hygroscopicus;rapamycin;Response Surface Methodology;fermentation medium雷帕霉素作为具有抗真菌作用的天然化合物首次发现于吸水链霉菌中，现阶段作为免疫抑制剂1-3、雷帕霉素涂层支架4-5广泛应用于临床。近年研究发现，雷帕霉素还在炎症6-7、抗衰老8-10、肿瘤发生11-13和神经性疾病14等老年性疾病方面具有重要作用。随着人口老龄化日益明显，雷帕霉素食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第1期 1将有可观的市场前景。前期试验经敲除吸水链霉菌Streptomyces rapamycinicus NRRL 5491基因组中疑似链霉菌分化负调节基因nsdA序列获得基因工程菌株Sr-A15。链霉菌体内基因敲除势必会影响相关代谢途径，菌株对发酵培养基营养需求与原始菌株也有差异。响应面法（RSM）是目前用于化学、生物等方面进行工艺优化的统计学方法，利用合理性试验设计，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，分析回归方程来寻求最优的工艺参数。与传统优化方法相比，响应面法所需试验组数相对较少，适用于培养基的快速有效优化16-17。本研究尝试应用响应面法优化吸水链霉菌Sr-A发酵培养基，以期进一步提高菌株合成雷帕霉素的水平。1 材料与仪器1.1 菌株雷帕霉素产生菌吸水链霉菌Streptomyces rapamycinicus Sr-A，本实验室构建并保藏。1.2 培养基斜面培养基：燕麦20 g/L、琼脂粉 20 g/L。种子培养基：葡萄糖 5 g/L，燕麦粉 10 g/L，酵母粉 2 g/L，蛋白胨1.5 g/L，氯化钠 2 g/L，pH 7.0。初始发酵培养基：葡萄糖35 g/L，甘露醇30 g/L，黄豆粉25 g/L，硫酸铵1.25 g/L，磷酸氢二钾 5 g/L，磷酸二氢钾 5 g/L，L-赖氨酸1.5 g/L，复合氨基酸 1.5 g/L。1.3 仪器与试剂LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安）；HD-1360超净工作台（哈尔滨东联）；HPS-250生化培养箱（哈尔滨东联）；LYNX6000高速冷冻离心机（Thermo Scientific）；A1200高效液相色谱仪（美国安捷伦）。酵母粉、蛋白胨（OXOID）；燕麦、黄豆粉、复合氨基酸（天津利发隆化工）；葡萄糖、氯化钠、L-赖氨酸等化学试剂均为国产分析纯。2 方法2.1 培养方法种子活化：将吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus Sr-A接种至斜面培养基上，28 恒温培养15 d。发酵工艺：10 ml无菌20%甘油水（v/w）洗脱斜面制备孢子悬液，吸取500 l接种于种子培养基（50 ml/250 ml三角瓶），28，220 r/min下培养4048 h，按10%接种量接种于发酵培养基中（100 ml/500 ml 三角瓶），28，220 r/min下培养144 h。2.2 雷帕霉素测定方法取发酵液1 ml加入2 ml甲醇，混合均匀，50 震荡水浴120 min。12000 r/min离心10 min，取上清即为雷帕霉素待测液。HPLC条件：安捷伦高效液相色谱仪A1200；色谱柱：Hypersil BDS C18柱（250 mm4.6 mm，5 m）；检测波长：277 nm；流动相：85%甲醇；流速：1.0 ml/min；进柱温：45。2.3 试验设计2.3.1 Placket-Burman（PB）试验设计 根据前期单因素试验结果，选取发酵培养基中8个组分为自变量，以雷帕霉素的发酵产量作为响应值，选用试验次数 n=12的Placket-Burman设计，每个因素取高（+1）、低（-1）2个水平，高水平约为低水平的1.52倍，数据为3次重复试验数据的平均值，PB试验设计见表1、表2。2.3.2 最陡爬坡试验 根据PB试验结果，得出一次拟合方程设计最陡爬坡试验。拟合方程中各变量的系数决定爬坡方向和变化步长，得到响应面试验的起始中心点，即各个显著因素的最佳质量浓度，确定最大响应值的区域。2.3.3 响应面试验设计 采用Box-Behnken法，对PB试验选出的3个主要影响因素和最陡爬坡试验确定的浓度，设计3因素3水平试验进行响应面分析，以获得最佳培养基配比。2.4 数据分析每个处理包含3个平行试验，取值为3个平行试验的均值。PB试验设计及数据分析由Minitab 17.0软件完成，Box-Behnken设计的响应面分析由Design-Expert 10完成。3 结果与分析3.1 PB试验确定发酵的显著因素PB试验设计及结果见表2，利用软件Minitab 17.0对结果进行分析，各因素方差分析结果见表3。由P值判定，培养基中各因素对Sr-A发酵产雷帕霉2 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第1期素重要性排序为ACGBEFHD，其中葡萄糖、黄豆粉、L-赖氨酸的P值分别为0.013，0.030，0.048，均小于0.05，表明葡萄糖、黄豆粉、L-赖氨酸对雷帕霉素发酵的影响显著。由相关系数可以判定葡萄糖、黄豆粉、L-赖氨酸对发酵产雷帕霉素的影响均成正效应。这些效应关系由回归模拟方程表示为Y=201.81+22.11A-10.92B+16.21C-1.04D+6.67E-2.56F+13.55G-2.53H，R2=0.9552，表明方程式拟合较好。表1 PB设计因素、水平及编码编码因素水平/gL-1-1+1A葡萄糖3040B甘露醇2535C黄豆粉2030D(NH4)2SO411.5EK2HPO446FKH2PO446GL-赖氨酸12H复合氨基酸12表2 PB设计及响应值水平序号ABCDEFGH雷帕霉素产量/mgL-1111-11-1-1-11198.052111-111-11153.1531-111-11-1-1148.154-1-1111-111222.5051-11-1-1-111266.656-11-1-1-1111211.1071-1-1-1111-1191.40811-111-11-1218.409-1-1-1111-11214.2510-111-11-1-1-1246.6511-1111-111-1169.0512-1-1-1-1-1-1-1-1182.35表3 PB设计显著因素分析因素相关系数tP重要性A22.115.300.0131B-10.92-2.620.0794C16.213.890.0302D-1.04-0.250.8198E6.671.600.2085F-2.56-0.610.5836G13.553.250.0483H-2.53-0.610.58873.2 最陡爬坡试验根据PB设计筛选出显著因素及相关系数设计爬坡方向和变化步长（见表4）。结果表明，试验2的培养基雷帕霉素产量最高，即葡萄糖浓度为 40 g/L、黄豆粉28.5 g/L、复合氨基酸1.8 g/L 时，雷帕霉素发酵产量达到最大值，因此以试验2的培养基配方作为响应面设计中心点。表4 最陡爬坡试验设计及结果序号葡萄糖/gL-1黄豆粉/gL-1复合氨基酸/gL-1雷帕霉素产量/mgL-1135251.5212.4124028.51.8261.72345322.1243.3745035.52.4183.65555392.7166.3566042.53.0127.73 3.3 响应面试验分析Box-Behnken试验因素代码和水平见表5，响应面分析试验设计共15个试验点，结果见表6。由表6可见，以雷帕霉素发酵产量为响应值，采用Design-Expert 10分析，回归模型的方差分析见表7。表5 Box-Behnken因素编码及水平设计编码因素水平/gL-1-10+1X1葡萄糖354045X2黄豆粉2528.532X3L-赖氨酸1.51.82.1表6 响应面试验设计与结果试验号X1X2X3雷帕霉素产量/mgL-11-1-10224.5521-10199.603-110219.564110174.655-10-1229.54610-1189.627-101243.168101199.6090-1-1207.831001-1149.70110-11185.7012011209.5813000262.4014000270.8615000281.89食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第1期 3方差分析结果表明，该模型的P值0.0003，表明模型是显著的，所建立的回归方程和曲面有较好的拟合，而失拟项的P值为0.9043，失拟不显著；模型的决定系数R2=0.9872，表明模型达到较好的拟合程度，可信性高。经分析软件回归拟合得到该模型的回归方程：Y=271.72-19.17X1-8.02X2+7.67X3-4.99X1X2-0.91X1X3+20.50X2X3-19.92X12-47.20X22-36.31X32回归使用3-D Surface绘制响应面三维曲线，见图1，可直观表现各因素对响应值的影响趋势，响应面的最高点在模型的设计范围之内，表明变量设计合理，可进行后续分析求得响应值最高点。利用软件预测响应值最大值，模型各因素组合为葡萄糖 37.60 g/L、黄豆粉 28.37 g/L、复合氨基酸 1.83 g/L时，雷帕霉素发酵产量预测最大值为 276.85 mg/L。表7 回归模型的方差分析来源自由度AdjSSAdjMSF值P值显著性模型918630.14 2070.02 42.850.0003*X112939.14 2939.14 60.830.0006*X21515.04515.0410.660.0223*X31470.48470.489.740.0262*X1X2199.6099.602.060.2105X1X313.313.310.0690.8039X2X311681.41 1681.41 34.800.0020*X1211465.81 1465.81 30.340.0027*X2218226.60 8226.60 170.27 0.0001*X3214868.56 4868.56 100.770.0002*误差5241.5748.31失拟项350.5416.850.180.9043纯误差2191.0395.52合计1418871.71注：R2=0.9872，R2Adj=0.9642；*差异极显著（P0.01）；*差异显著（P0.05）3.4 优化培养基的验证为验证响应面设计可靠性，采用优化后的培养基进行雷帕霉素的发酵试验，重复3次。同时以原始培养基发酵结果为对照，结果表明，基因工程菌株Sr-A在最优条件下雷帕霉素产量为279.5613.28 mg/L，与预测的效价相当，比优化前的182.2310.83 mg/L提高了53.41%。4 讨论本研究应用Plackett-Burman试验快速有效地从8个影响因素中确定葡萄糖、黄豆粉和L-赖氨酸为影响吸水链霉菌发酵产雷帕霉素的主要因素；在此基础上，通过最陡爬坡试验确定了中心试验点，逼近最大响应面区域；最后采用Box-Behnken试验设计确定了3种主要影响因素对雷帕霉素产量值影响的二次回归方程，确定吸水链霉菌Sr-A摇瓶最佳发酵培养基组成：葡萄糖 37.60 g/L、甘露醇30 g/L、黄豆粉 28.37 g/L、硫酸铵1.25 g/L、磷酸氢二钾 5 g/L、磷酸二氢钾 5 g/L、赖氨酸1.5 g/L、复合氨基酸 1.83 g/L。在此条件下，雷帕霉素发酵产量达到279.5613.28 mg/L，比原始培养基产量提高了53.41%，表明响应面法在培养基优化方面具有较高的指导作用。通过培养基优化促进雷帕霉素合成，文献报道摇瓶发酵最高产量为2205.7 mg/L18，与本研究发酵产量相当。雷帕霉素结构复杂，生物合成涉及多个基因簇及众多调控元件，在培养基优化基础上，通过复合诱变、原生质体融合重组育种等多位点随机全局性改造菌株，并开发设计出高通量筛选技术，是快速提高雷帕霉素产量的有效方法之一。另外，随着吸水链霉菌全基因组不断解析，结合组学数据分析，构建出基因组尺度代谢网络模型，利用合成生物学技术重建代谢通路，优化合成途径，从系统角度改造吸水链霉菌菌株，提高雷帕霉素合成能力，将是未来发展的研究热点。A.黄豆粉和葡萄糖之间的交互影响；B.复合氨基酸和黄豆粉之间的交互影响；C.复合氨基酸和葡萄糖之间的交互影响图1 各因素对雷帕霉素产量交互影响的三维曲面图4 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第1期参考文献1 李敏娜.新型免疫抑制剂雷帕霉素的研究进展J.河北化工,2011,34(8):21-22,24.2 杨婧,张小东,杨辉,等.肾移植术后应用雷帕霉素转换方案的临床观察J.中国医院药学杂志,2018,38(6):650-653.3 刘现忠,王轩.雷帕霉素抗排斥作用机制及其在肝移植中的应用J.免疫学杂志,2014,30(1):79-83.4 Dai Y,Wang L,Fu L,et al.The efficacy and safety of domestic and imported rapamycin drug-eluting stents and paclitaxel drug-coated balloons in the treatment of coronary bifurcation lesionsJ.Am J Transl Res,2021,13(8):9421-9428.5 Juwana Y B,Rasoul S,Ottervanger J P,et al.Efficacy and safety of rapamycin as compared to paclitaxel-eluting stents:a meta-analysisJ.J Invasive Cardiol,2010,22(7):312-316.6 Towner R A,Gulej R,Zalles M,et al.Rapamycin restores brain vasculature,metabolism,and 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