线粒体转录因子A在炎症相关...的发生和进展阶段的双向作用_杨世荣.pdf

530癌 症 2 0 2 2年 第 4 1卷 第 1 1期*通讯作者：邢金良，；黄启超， 杨世荣和何显力对本文贡献相同1 空军军医大学肿瘤生物学国家重点实验室/空军军医大学基础医学院生理与病理生理教研室，空军军医大学，西安 710032，陕西，译作已获得版权所有者许可线粒体转录因子A在炎症相关结直肠癌的发生和进展阶段的双向作用杨世荣1,2，何显力2，赵静1，王大林3，郭珊珊1，高天2，王刚1，金超2，闫泽宇2，王楠2，王永兴4，赵诣林1，邢金良1，黄启超1原创论著中国；2 普外科，空军军医大学唐都医院，西安 710032，陕西，中国；3 肝胆外科，空军军医大学西京医院，西安 710032，陕西，中国；4 呼吸内科，空军军医大学西京医院，西安 710032，陕西，中国原文链接：hfips:/doi.org/10.1002/cac2.12184【摘要】背景与目的 线粒体是细胞增殖和凋亡的关键调节因子。线粒体功能的改变与炎症和肿瘤发生密切相关。线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）是线粒体DNA转录和复制的重要调节因子，本文旨在研究其是否参与炎症相关结直肠癌（colitis-associated cancer，CAC）的发生和进展。方法 通过免疫组织化学法检测炎性肠病（inflammatory bowel diseases，IBD）和CAC组织样本中TFAM的表达情况。用肠上皮细胞（intestinal epithelial cell，IEC）TFAM特异性敲除小鼠（TFAMIEC）和TFAM敲低或过表达的结直肠癌（colorectal cancer，CRC）细胞评估TFAM在肠炎及CAC的发生和进展中的作用。通过分析线粒体呼吸功能和生物发生探讨TFAM的潜在作用机制。结果 TFAM在人活动性IBD中表达下调，与疾病活动度呈负相关。在IEC中IL-6通过调控信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）/miR-23b通路轴下调TFAM表达。此外，TFAM敲除可影响IEC再生，从而加剧葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的小鼠肠炎症状。值得注意的是，TFAM敲除可促进偶氮甲烷/DSS诱导的小鼠CAC的发生，TFAM过表达可抑制模型小鼠肠炎和炎症相关结直肠癌的发生。TFAM在CAC组织中表达上调并促进细胞生长。在CRC细胞中-连环蛋白通过调控c-Myc促进TFAM表达上调。在机制上，TFAM通过增加线粒体的生物发生和活性来促进IEC和CRC细胞增殖。结论 TFAM在CAC的发生和进展的不同阶段发挥不同的作用，为CAC发病机制的研究提供了新数据。【关键词】肠炎；结肠炎症相关结直肠癌；结直肠癌；能量代谢；炎性肠病；肠道稳态；线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）炎性肠病（inflammatory bowel diseases，IBD）包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（Crohns disease，CD），其特征为肠炎反复发作。IBD患者发生结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的风险增加1，UC2和CD3患者发生CRC的风险分别是一般人群的30倍和5.6倍。此外，与531癌 症 2 0 2 2年 第 4 1 卷 第 1 1期散发性CRC患者相比，炎症相关结直肠癌（colitis-associated cancer，CAC）患者更年轻，常伴有多个癌灶，并且在确诊时大多已为晚期4。IBD患者发生CAC的主要因素可能与炎症的严重程度和持续时间相关，但对CAC的发病机制仍知之甚少。在肠道内，维持肠道上皮细胞更新对于保证肠道中共生微生物群和食物消化的有效屏障功能非常重要。然而，IBD患者的肠上皮屏障常常被破坏，这与肠上皮细胞增殖减少和细胞死亡增加有关，进而促进炎症向癌症转变5,6。那么，在炎症条件下抑制细胞增殖以及在肿瘤阶段促进细胞增殖的关键因素是什么呢？线粒体是半自主细胞器，含有自身的线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA），该DNA编码呼吸链的13种必需蛋白质。在肿瘤发生过程中，线粒体在调节细胞增殖和凋亡中发挥关键作用7。最近的一些研究8表明，线粒体的内在动态在炎症信号传导过程中起着至关重要的作用。同样，炎症介质也可能改变线粒体功能。例如，Haberman等9和Reifen等10发现在活动期UC患者体内线粒体和核编码线粒体基因显著减少，在肠炎大鼠模型中也观察到此现象。同时，在CD患者肠上皮细胞（intestinal epithelial cell，IEC）中线粒体超微结构发生显著改变（例如线粒体嵴溶解/不规则），表明线粒体功能受损，这是炎症的早期事件11。我们之前的研究12和其他研究13,14表明，人散发性CRC组织中的线粒体质量和mtDNA含量显著高于正常结肠黏膜。此外，有研究15,16显示，CRC细胞将线粒体氧化磷酸化作为其主要的能量来源。然而，线粒体是否以及如何参与肠炎和CAC的调控尚不清楚。由 核 基 因 编 码 的 线 粒 体 转 录 因 子 A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）在编码电子传递链关键组分的mtDNA的转录17和复制18中发挥重要作用，TFAM是通过氧化磷酸化产生能量的重要转录因子19。TFAM功能失活可导致线粒体增大、嵴异常、能量产生减少和胚胎死亡20。脂肪细胞特异性缺失TFAM可促进线粒体氧化，抑制小鼠肥胖和胰岛素抵抗21。此外，TFAM的截短突变可在微卫星不稳定的CRC中诱导mtDNA缺乏和细胞凋亡抵抗22。然而，在肠炎和CAC中进行TFAM基因中断的研究尚未见报道。本文使用IEC特异TFAM基因敲除小鼠来研究TFAM在肠炎和CAC发生和进展过程中的作用。我们还分析了TFAM在人肠炎和CAC组织中的表达情况，并利用正常人结直肠上皮细胞系和CRC细胞系在体外探讨了TFAM潜在的作用机制。1 材料和方法1.1 试剂人肿瘤坏死因子-（human tumor necrosis factor-，TNF-)（货号：30001A）和白细胞介素-6（nterleukin-6，IL-6；货号：200-06）购自PeproTech公司（Rocky Hill，NJ，USA）。microRNA（miRNA/miR）模拟物和抑制剂由上海GenePhama公司（上海，中国）合成，序列见补充表S1。寡霉素（货号：495455）、偶氮甲烷（azoxymethane，AOM；货号：A5486）和异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC)-葡聚糖（货号：46944）购自Merck公司（St.Louis，MO，USA）。硫酸葡聚糖钠（dextran sulfate sodium，DSS；货号：0216011080）购自MP生物医疗公司（Irvine，CA，USA）。信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）抑制剂Stattic（货号：S7024）、-连环蛋白抑制剂IWR-1（货号：HY-12238）和KYA1797K（货号：HY-101090）、-连环蛋白激动剂SKL2001（货号：HY-101085）和IM-12（货号：HY-12292）购自MedChemExpress（Monmouth Junction，NJ，USA）。青霉素链霉素溶液（货号：P1410）、琼脂糖（货号：9012-36-6）和乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA，货号：E8040）购自北京阳光生物科技有限公司（北京，中国）。Trizol（货号：15596-026）购自Invitrogen公司（Carlsbad，CA，USA）。嘌呤霉素购自DIYIBio公司（上海，中国）。1.2 细胞培养和患者样本收集正常人结直肠上皮细胞系FHC和CRC细胞系SW1116、T84、RKO、SW480、SW620、LoVo、CaCo2和HCT116购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC，Manassas，VA，USA）。正常人结直肠上皮细胞系NCM460购自Incell公司（San Antonio，TX，USA）。细胞在RPMI-1640532癌 症 2 0 2 2年 第 4 1卷 第 1 1期培养基（Gibco，Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA）或达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbeccos Modified Eagle，DMEM，Gibco，USA）中培养，添加有10%胎牛血清（Gibco）和1%青霉素/链霉素溶液。细胞培养于37C、5%CO2的湿润环境中。在蛋白质免疫印迹和逆转录定量PCR实验前，将STAT3抑制剂Stattic（20 mol/L）加入NCM460和FHC的细胞培养基中，细胞培养24 h。10例石蜡包埋的正常结肠组织作为正常对照组、88例UC患者新鲜炎症组织、90例CD患者新鲜炎症组织、30例新鲜和7例石蜡包埋的CAC患者组织以及IBD患者对应的静脉血样本均收集自空军军医大学附属唐都医院和西京医院（西安，陕西，中国）。IBD患者的临床特征见补充表S2。所有参与者均签署了书面知情同意书，本研究得到FMMU伦理委员会的批准。1.3 实验动物TFAMflox/flox小鼠具有位于TFAM外显子67侧翼的LoxP位点，由聂勇战教授（空军军医大学西京医院消化科）惠赠。Villin-Cre小鼠由张健教授（空军军医大学基础医学科学院生物化学与分子生物学系）惠赠。通过将TFAMflox/flox小鼠与Villin-Cre小鼠在无特定病原体（specific pathogen-free，SPF）实验动物房（实验动物中心，空军军医大学）中杂交，生成IEC特异性缺乏TFAM的小鼠模型（TFAMIEC）。通过多重PCR和琼脂糖凝胶电泳检测小鼠的基因型。在TAE缓冲液中制备含有0.5 g/mL溴化乙锭的琼脂糖凝胶（2%）。DNA样品在琼脂糖凝胶中以100 V电压分离30 min。TFAM野生型等位基因产生一段396 bp的PCR产物，而TFAM缺失等位基因产生一段438 bp的PCR产物，如文献23中所述。所有动物实验程序均获得空军军医大学动物伦理委员会的批准。1.4 建立CAC和肠炎动物模型按照文献24所述方法建立CAC小鼠模型。简言之，将810周龄的TFAMIEC和野生型（wild-type，WT）同窝出生的C57BL/6J小鼠腹腔注射10 mg/kg AOM，正常饲养2 d。然后，连续5 d给小鼠喂食1.5%DSS，然后再用普通水喂养14 d，以此为一循环，重复3个循环。未经AOM/DSS处理的小鼠作为对照组。注射AOM后1个月或3个月对小鼠实施安乐死，然后纵向切开小鼠结肠。在显微镜（M205，Leica Microsystems公司，Wetzlar，德国）下计数肿瘤结节。为了建立DSS诱导的肠炎小鼠模型，连续5 d给小鼠喂食2.5%DSS，然后再换普通水喂养5 d。按照文献25,26所述方法，每天测量小鼠的体重、大便稠度（0，正常；2，稀便；4，腹泻）和便血（0，潜血阴性；2，潜血阳性；4，血便）情况。在第5 d（DSS处理结束）或第10 d（DSS和正常水处理结束）引颈处死小鼠，然后测量结肠长度。将组织样品冷冻在液氮中或固定在10%福尔马林中以供后续实验。1.5 逆转录定量PCR（reverse transcription-quantitative PCR，RT-qPCR)为了明确CRC细胞中-catenin对TFAM表达的调控作用，分别将20 mol/L IWR1、20 mol/L KYA1797K、30 mol/L SKL2001或5 mol/L IM-12加入细胞培养基中与作用细胞24 h。使用Trizol从小鼠或人结肠组织、正常人结直肠上皮细胞系、CRC细胞系中提取总RNA，然后使用高容量cDNA反转录试剂盒（货号：4368814，Thermo Fisher Scientific公司，Waltham，MA，USA）逆转录为cDNA。使用TB Green Premix Ex TaqTM II（货号：RR820A；Takara Bio公司，Tokyo，Japan）在实时PCR仪（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）上进行RT-qPCR。反应条件为95C 2 min，然后95C 10 s和60C 30 s，进行40个循环。使用2-Ct法计算基因的相对表达水平。以甘油醛磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）和U6 snRNA（仅用于miRNA）作为参考基因。使用的引物序列见补充表S1。1.6 mtDNA拷贝数检测按照文献27所述方法，使用RT-qPCR检测相对mtDNA拷贝数。使用QIAamp DNA Mini试剂盒（货号：51306；Qiagen公司，Hilden，Germany）从FHC和RKO细胞中提取基因组DNA。mtDNA中线粒体NADH脱氢酶1（mitochondrial NADH dehydrogenase 1，MT-ND1）基因与单拷贝核基因人球蛋白（human globulin，HGB)的比率由标准曲线测定。使用的引物序列见补充表S1。1.7 蛋白质免疫印记（western blotting，WB）和免疫组化（immunohistochemistry，IHC）533癌 症 2 0 2 2年 第 4 1 卷 第 1 1期WB和IHC按照文献28所述方法进行。用从小鼠结肠组织、正常人结直肠上皮FHC和NCM460细胞、CRC细胞系（如SW480、HCT116、RKO）中提取蛋白质进行WB。然后使用ECL试剂盒（Thermo Fisher Scientific公司）显影。由2名病理科医生对人正常、炎症结肠组织和CAC组织的IHC染色进行独立盲检，在显微镜下对每张载玻片选取5个视野（200）判断染色强度（0，无；1，淡黄色；2，黄色；3，棕色）和阳性细胞比例（0，09%；1，10%25%；2，26%50%；3，51%75%；4，76%100%）。IHC得分（范围从0到12）=阳性细胞的百分比染色强度。将TFAM表达水平划分为低表达（03分）、中度表达（47分）和高表达（812分）。研究中所使用的抗体见补充表S3。1.8 组织学分析按 照 文 献 2 9 所 述 方 法 进 行 苏 木 精 和 伊 红（hematoxylin and eosin，H&E）染色。使用文献30描述的3个独立参数进行小鼠肠炎的组织学评分：损伤程度（0，无；1，仅黏膜；2，黏膜下层；3，透壁）、隐窝损伤（0，无；1，基底1/3受损；2，基底2/3受损；3，几乎整个上皮受损）和白细胞浸润严重程度（0，无；1，轻度；2，中度；3，严重）。1.9 肠道通透性检测按照文献31,32所述方法，通过检测血液中FITC-葡聚糖和D-乳酸的含量来评估肠道通透性。通过灌胃对小鼠给予FITC-葡聚糖（0.4 mg/g 体重），4 h后将小鼠处死。使用激发波长为485 nm和发射波长为535 nm的荧光酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司）测量血清FITC-葡聚糖浓度。根据产品说明书，使用D-乳酸检测分析试剂盒（货号：GMS70095.3，Shanghai Genmed公司，上海，中国）检测血清D-乳酸浓度。使用标准曲线得出的斜率和截距计算D-乳酸浓度。1.10 靶基因的敲低和过表达TFAM及其转录因子c-Myc敲低和过表达的慢病毒载体由上海吉玛制药技术有限公司（货号：D01001、D02001，上海，中国）构建。通过用慢病毒表达载体和包装质粒共转染297T细胞收集慢病毒。将正常人结直肠上皮细胞或CRC细胞（5 104/孔）接种到6孔板中，在37oC、5%CO2孵育过夜。然后用无血清培养基将慢病毒加入到每个孔中（感染复数为10），孵育过夜。用嘌呤霉素（5 g/mL）筛选转染成功的细胞克隆。WB测定慢病毒转染细胞中TFAM和c-Myc的表达水平。1.11 细胞增殖测定和细胞周期分析按照文献33所述方法，使用Cell-Light 5ethynyl-2-deoxyuridine(EdU)Apollo567 In Vitro Kit（货号：C10310，Ribobio公司，广州，广东，中国）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色试剂盒（货号：BB-4104，上海贝博生物科技公司）测定细胞增殖。在适当的情况下，使用2 g/mL寡霉素抑制线粒体F0F1-ATPase。EdU测定，2 105细胞与EdU共孵育2 h，然后用4%多聚甲醛固定。用Hoechst（货号：C1022，碧瑶生物技术研究所，中国上海）进行核染色。使用荧光显微镜（Olympus Corporation，Tokyo，Japan）观察和对图像拍照。细胞周期分析，收集1 106个细胞，与PI染色溶液在4C下孵育30 min，然后使用流式细胞仪（Beckman Coulter公司，CA，USA）检测细胞周期。1.12 检测线粒体呼吸链复合酶活性、耗氧率（oxygen consumption rate，OCR）和线粒体三磷酸腺苷（mitochondrial adenosine triphosphate，ATP）含量按照产品说明书，使用检测试剂盒（货号：BC0510、BC3240、BC0945和BC1445，北京阳光生物科技有限公司），通过单波长分光光度法测定细胞提取物中复合酶（I、III、IV和V）的活性。收集5 106个细胞，使用裂解缓冲液进行裂解匀浆。在4C下进行两步离心（600 g 离心10 min；11000 g 离心15 min）后，收集沉淀物进行超声破碎，然后加入相应的底物进行酶促反应。使用分光光度计（Thermo Fisher Scientific公司）检测代谢产物在不同波长（I：340 nm；III：550 nm；IV：550 nm；V：660 nm）下的吸光度值。根据产品说明书，使用782氧气计（Strathkelvin Instruments，Motherwell，UK）测量OCR。以0.5秒的采样间隔记录信号。按照以往研究34所述的方法检测线粒体ATP含量。使用ATPlite分析系统（PerkinElmer公司，Waltham，MA，USA）测定ATP含量。在使用荧光素之前记录基础发光，然后将20 mol/L荧光素加入细胞中再记录线粒体发光35。1.13 慢病毒直肠滴注534癌 症 2 0 2 2年 第 4 1卷 第 1 1期按照文献36所述方法，进行慢病毒的直肠内滴注以增加结肠上皮中靶基因的表达水平。将小鼠麻醉后进行50%乙醇的直肠灌肠，来增加慢病毒在肠内的转导率。然后，在小鼠直肠内滴注100 L的含有107 IU表达小鼠TFAM（mouse TFAM，mTFAM）或空载体（empty vector，EV）的慢病毒溶液。将小鼠倒置30 s防止漏液。为了保证慢病毒在IEC中的转导效率，每2 d进行一次慢病毒处理。1.14 裸鼠异种移植模型用于建立异种移植模型（每组6只）的6周龄的BALB/c裸鼠购自空军军医大学实验动物中心。将TFAM敲低或过表达的人RKO细胞注射到小鼠背部（5 106个细胞/只小鼠）。通过绘制时间肿瘤体积曲线来评估异种移植物的生长情况。当最大的肿瘤体积达到约1000 mm3时，将小鼠实施安乐死。肿瘤体积（mm3）=宽2（mm2）长（mm）/2。1.15 IECs的分离按照文献36所述方法从小鼠结肠中分离出IECs。将小鼠麻醉后实施安乐死，立即解剖结肠并切成小块（直径为12 mm）。将结肠组织置于在用汉克平衡盐溶液（Hanks Balanced Salt Solution，HBSS）稀释的5 mmol/L EDTA中，在37C下振荡孵育30 min。收集上清液后3000 g 离心10 min，取沉淀，用冰冷的磷酸盐缓冲盐水（phosphate buffer saline，PBS）洗涤，用于测定TFAM表达水平。1.16 公共数据库为了分析TFAM与c-Myc表达之间的关系，在基因组数据共享中心（Genomic Data Commons，GDC）的癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中下载了结直肠癌样本（n=519）的RNA-seq的数据（https:/gdc-portal.nci.nih.gov）。使用edge R包（http:/www.r-project.org）中的calcNormFactors函数，采用M值切尾均值（trimmed mean of M-values，TMM）算法将数据归一化。1.17 数据分析使用IBM SPSS Statistics 22.0软件（Armonk，NY，USA）进行统计学分析。认为双侧P 0.05差异具有统计学意义。数据表示为平均值标准差（standard deviation，SD）。在检查数据的正态分布和等方差后，使用Students t检验或Mann-Whitney U检验来分析两组之间的差异。使用斯皮尔曼相关分析来分析测量变量之间的相关性。在DSS处理后15 d或AOM/DSS处理后3个月绘制Kaplan-Meier生存曲线。使用对数秩检验比较生存数据。2 结果2.1 敲除TFAM促进AOM/DSS诱导的小鼠CAC的发生为了研究TFAM在CAC中的潜在作用，我们建立了TFAMIEC小鼠模型，并通过琼脂糖凝胶电泳和WB证实了TFAM在IEC中表达缺失（补充图S1）。接下来，通过注射促结肠诱变剂AOM和水中添加DSS来诱导小鼠发生CAC。TFAMIEC小鼠在AOM/DSS处理1个月后被安乐死，肉眼可见出现肠息肉；而WT小鼠中很少出现肠息肉。AOM/DSS处理3个月后，TFAMIEC和WT小鼠均出现肠息肉。然而，与WT小鼠相比，TFAMIEC小鼠出现的肠息肉数量更多、体积更大。在对照组中，WT或TFAMIEC小鼠在1个月和3个月时均未出现明显的肠息肉（图1AC）。此外，组织学分析结果显示，与WT小鼠相比，TFAMIEC小鼠的肿瘤表现出更严重的发育异常（图1DE）。值得注意的是，与WT对照组相比，TFAM的特异性敲除显著缩短了AOM/DSS诱导的CAC小鼠模型的总生存期（图1F）。以上结果表明，特异性敲除TFAM可促进AOM/DSS诱导的小鼠CAC的发生。2.2 敲除TFAM加剧DSS诱导的小鼠肠炎症状并抑制IEC再生炎症在肿瘤发生中发挥重要作用，推测TFAMIEC小鼠更易发生CAC可能与肠炎症状加剧相关。为此，我们用2.5%DSS处理TFAMIEC和WT小鼠来建立肠炎小鼠模型。然后根据小鼠的体重减轻、大便稠度、便血情况和结肠长度评估肠炎症状的程度。如图2AD所示，未经DSS处理，TFAMIEC和WT小鼠均未出现明显的肠炎症状。然而，在DSS处理之后，TFAMIEC小鼠的肠炎症状比WT小鼠严重得多。结肠的组织学分析结果显示，在DSS处理前（第0 d），TFAMIEC和WT小鼠的结肠黏膜均正常，在DSS处理结束时（第5 d），TFAMIEC和WT小鼠的结肠隐窝和肠上皮完整性均被完全破坏。相比之下，WT小鼠的结肠黏膜在第10 d出现重新上皮化，而TFAMIEC小鼠的结肠黏膜仍显示出严重的肠炎症状，表现出损伤程度更严重、炎症细胞浸润、隐窝数量减少和组织学评分535癌 症 2 0 2 2年 第 4 1 卷 第 1 1期图 1 敲除TFAM促进AOM/DSS诱导的小鼠CAC的发生Fig.1 TFAM knockout increases the susceptibility of mice to AOM/DSS-induced CAC.A:Representative images of colon tissues from WT and TFAMIEC mice treated with AOM/DSS as indicated.(B)Polyp numbers and(C)polyp size in WT and TFAMIEC mice treated with AOM/DSS for 3 months.D:Representative hematoxylin and eosin-stained colon sections from WT and TFAMIEC mice treated with AOM/DSS.E:Percentage of low-/high-grade dysplasia of polyps inWT and TFAMIEC mice treated with AOM/DSS for 3 months.F:Kaplan-Meier survival analysis of WT and TFAMIEC mice treated with AOM/DSS for 3 months.Error bars represent mean SD.Data were analyzed using Mann-Whitney U test(B and C).*P 0.05,*P 0.01.Abbreviations:TFAM,mitochondrial transcription factor;AOM,azoxymethane;DSS,dextran sulfate sodium;CAC,colitis-associated cancer;WT,wild-type;TFAMIEC,knockdown of TFAM particularly in intestinal epithelial cells;LGD,low-grade dysplasia;HGD,high-grade dysplasia;SD,standard deviation.更高（图2E、F)。通过肠道通透性实验评估第10 d肠上皮完整性的恢复情况，实验结果显示，与WT小鼠相比，TFAMIEC小鼠血液中的FITC-葡聚糖和D-乳酸浓度显著增加（图2G、H），表明肠上皮完整性较差，溶质和病原体的进入不受控制。与WT小鼠相比，DSS处理的TFAMIEC小鼠的结肠黏膜中促炎细胞因子（IL-1、IL-6、IL-11和TNF-）的表达均升高（图2I）。最后，通过连续喂食致死剂量DSS（3.5%）进一步评估TFAM对肠炎症状的影响，TFAMIEC小鼠存活时间明显短于野生型小鼠（如图2J）。536癌 症 2 0 2 2年 第 4 1卷 第 1 1期图 2 敲除TFAM加剧DSS诱导的小鼠肠炎症状并抑制IEC再生Fig.2 TFAM knockout promotes DSS-induced intestinal inflammation and impairs IEC turnover in mice.A-C:Weight loss,stool consistency,and rectal bleeding score in WT and TFAMIEC mice following 2.5%DSS or H2O treatment.D:Gross morphology and length of the colons fromWT and TFAMIEC mice treated with 2.5%DSS or H2O(day 10).E:Representative hematoxylin and eosin-stained images of colon tissues from WT and TFAMIEC mice treated with 2.5%DSS at different time points.F:Histological score of colitis tissues from WT and TFAMIEC mice treated with 2.5%DSS or H2O on day 10.G and H:Serum FITC-dextran and D-lactate concentrations in WT and TFAMIEC mice treated with 2.5%DSS or H2O on day 10.I:Relative mRNA expression of pro-inflammatory cytokines(IL-1,IL-6,IL-11,and TNF-)in colonic mucosa from WT and TFAMIEC mice treated with 2.5%DSS or H2O treatment on day 10.J:Kaplan-Meier survival analysis of WT and TFAMIEC mice treated with 3.5%DSS or H2O.Error bars represent mean SD.Data were analyzed using Mann-Whitney U test.*P 0.05,*P 0.01.Abbreviations:TFAM,mitochondrial transcription factor;DSS,dextran sulfate sodium;IEC,intestinal epithelial cell;WT,wild-type;FITC,fluorescein isothiocyanate;IL,interleukin;TNF,tumor necrosis factor;SD,standard deviation.537癌 症 2 0 2 2年 第 4 1 卷 第 1 1期2.3 TFAM在活动性IBD中表达下调并且与疾病活动度呈负相关通过IHC分析IBD患者和健康对照者的结肠活检组织中TFAM表达水平。与健康对照组相比，TFAM在活动性CD和UC患者的IEC中的表达水平显著下调，但在非活动性UC和CD患者的IEC中的表达水平没有显著变化（图3A、B）。通过检测可反映炎症活动性和严重程度的两个主要标志物IL-6和C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）的水平，进一步分析IBD的疾病活动度与TFAM表达之间的相关性。实验结果显示，TFAM表达低的IBD患者的血清CRP水平远高于TFAM表达高的患者（图3C、D）。这些结果表明，TFAM的表达在活动性IBD中受到抑制，并且与疾病活动度呈负相关。2.4 在IEC中IL-6通过STAT3/miR-23b通路轴下调TFAM表达为了探求TFAM在炎症中的潜在作用机制，用结肠炎主要促炎细胞因子处理正常结肠上皮NCM460和FHC细胞。IL-6处理后TFAM表达显著下调（图4A），但TNF-处理后TFAM表达不变（图4B）。Janus激酶（janus kinase，JAK）/STAT3信号通路是结肠炎中的重要信号中枢，可介导IL-6发挥功能，因此，我们进一步检测了磷酸化STAT3（phosphorylated STAT3，p-STAT3）的表达水平。结果显示，IL-6处理后p-STAT3表达水平显著升高。并且，IL-6对TFAM表达的抑制作用可被STAT3抑制剂Stattic阻断（图4A），表明TFAM是IL-6/STAT3信号的下游靶点。接下来，我们探求是否有miRNA参与了TFAM表达下调的调控过程。在人细胞中，已知有7种miRNA可抑制TFAM的表达，其中只有miR-23b在NCM460和FHC细胞中被IL-6显著上调（图4C），并且上调作用可被STAT3抑制剂Stattic阻断（图4D）。此外，使用miR-23b模拟物和抑制剂在正常结肠上皮细胞中也证实了miR-23b对TFAM表达的影响（图4E）。在来自IBD患者的肠道组织样本中，我们进一步分析了TFAM表达与调节性IL-6/p-STAT3/miR-23b通路轴之间的关联。如图4F所示，TFAM的表达与结肠IL-6水平呈负相关。这与TFAM的水平与p-STAT3和miR-23b的表达水平也呈负相关的结果相一致（图4G、H和补充表S4）。2.5 TFAM过表达抑制小鼠肠炎和炎症相关结直肠癌的发生为了进一步确定TFAM对肠炎和炎症相关结直肠癌发生的影响，通过直肠内滴注表达TFAM的慢病毒恢复TFAM表达（补充图S2A）。TFAMIEC和WT小鼠结肠上皮中TFAM表达恢复可显著减轻DSS诱导的结肠炎，体重减轻、稀便或水样便、便血和结肠长度缩短等肠炎症状减轻（图5AD）。跨上皮渗透性检测实验结果显示，TFAM表达恢复促进了DSS处理后肠上皮完整性的恢复（图5E）。这与TFAM恢复的小鼠肠炎症状减轻，如隐窝数量增加和组织学评分改善所示的结果一致（图5F、G）。此外，TFAM表达恢复抑制了AOM/DSS诱导的小鼠CAC的发生，WT和TFAMIEC小鼠的息肉的数量和体积减少（图5HJ）。组织学分析结果显示，与对照组的肿瘤相比，TFAM表达恢复的小鼠的肿瘤表现出较轻的发育不良（补充图S2B、C）。值得注意的是，在AOM/DSS诱导的CAC小鼠模型中，肠上皮TFAM表达恢复显著延长了小鼠的总生存期（补充图S2D）。2.6 TFAM在人CAC组织中表达上调并在裸鼠体内促进肿瘤生长我们评估了TFAM在人CAC中的作用。TFAM蛋白质在CAC组织中的表达水平显著高于癌旁组织（图6A）。RT-qPCR分析证实了这一结果（图6B），表明TFAM主要在转录水平上调。建立裸鼠异种移植模型来研究TFAM在体内调控肿瘤生长的机制。用含有TFAM短发夹RNA（short hairpin RNA，shTFAM）或对照质粒（short hairpin control plasmid，shCtrl）的慢病毒转染RKO细胞，然后移植到裸鼠体内。与对照组相比，敲低TFAM显著抑制了肿瘤生长（图6CE）。过表达TFAM作用效果相反（图6FH）。这与细胞增殖标志物Ki-67表达水平在敲低TFAM的肿瘤中下调，而在过表达TFAM的肿瘤中上调的结果相一致（图6I）。2.7 在CRC细胞中-连环蛋白通过调控c-Myc促进TFAM表达上调 CAC是IEC中突变积累的结果。在肿瘤中，-连环蛋白是突变基因的常见的下游靶点，例如肿瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、V-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）和结肠腺瘤样息肉538癌 症 2 0 2 2年 第 4 1卷 第 1 1期图 3 TFAM在活动性IBD中表达下调并且与疾病活动度呈负相关Fig.3 The expression of TFAM is decreased in active IBD and negatively associated with disease activity.A:Representative IHC staining images of TFAM in colon tissues from healthy controls or patients with active/inactive UC or CD.B:IHC score of TFAM in human colon tissues as indicated.C:Serum levels of CRP in UC or CD patients with low,moderate,and high expression of TFAM