微塑料富集环境抗生素抗性基因的研究进展_陈瑶.pdf

93综述NO.02 2023塑料科技 Plastics Science and Technology微塑料富集环境抗生素抗性基因的研究进展陈 瑶1,2,夏子渊1,2,苟 敏1,2*,孙照勇1,2,汤岳琴1,2（1.四川大学建筑与环境学院，四川 成都 610065；2.四川省环境保护有机废弃物资源化利用重点实验室，四川 成都 610065）摘要：微塑料已经在各种环境介质中被广泛检出，并且可能促进环境中抗生素抗性基因（ARGs）的富集与传播。文章从研究方法、富集效果、富集机制方面综述微塑料富集ARGs的研究进展，发现微塑料对多个环境中ARGs富集现象较明显，同时环境类型、微塑料暴露特征（种类、尺寸、暴露时间、与抗生素的联合作用）等因素对ARGs富集效果具有明显影响。微塑料从不同途径促进垂直基因转移与水平基因转移，实现ARGs富集。未来的研究应深入探讨微塑料对ARGs的富集机制，扩大环境研究范围，以进一步评估微塑料对ARGs的富集作用所引发的环境生态风险。关键词：微塑料；抗生素抗性基因；富集效果；富集机制中图分类号：X52；X832 文献标识码：A 文章编号：1005-3360（2023）02-0093-06 DOI：10.15925/ki.issn1005-3360.2023.02.019Research Progress on Enrichment of Antibiotic Resistance Genes in Environment by MicroplasticsCHEN Yao1,2,XIA Zi-yuan1,2,GOU Min1,2*,SUN Zhao-yong1,2,TANG Yue-qin1,2(1.College of Architecture&Environment,Sichuan University,Chengdu 610065,China;2.Sichuan Provincial Key Laboratory of Environmental Protection Organic Waste Resource Utilization,Chengdu 610065,China)Abstract:Microplastics have been widely detected in a variety of environmental media.Microplastics may promote the enrichment and spread of antibiotic resistance genes(ARGs)in the environment.The research progress of ARGs enrichment by microplastics was reviewed from the aspects of research methods,enrichment effect and enrichment mechanism.It is found that microplastics has obvious enrichment of ARGs in multiple environments.At the same time,environmental types,microplastics exposure characteristics(type,size,exposure time,combined with antibiotics)and other factors have significant effects on the enrichment of ARGs.Microplastics promote vertical gene transfer and horizontal gene transfer from different ways to achieve ARGs enrichment.Future research should further explore the enrichment mechanism of microplastics on ARGs and expand the scope of environmental research to further evaluate the environmental and ecological risks caused by the enrichment of ARGs by microplastics.Key words:Microplastics;Antibiotic resistance genes;Enrichment effect;Enrichment mechanism微塑料(MPs)一般指尺寸小于5 mm的塑料颗粒和碎片1-3。根据来源，环境中的MPs可以分为初级MPs（工业产品排放）与次级MPs（较大塑料的分解）两种类型4。目前，MPs已广泛分布在各种环境介质中，包括海水、淡水、土壤、污泥、动物组织等5-6。MPs的持久存在会对环境造成一定影响。一方面，受周围环境的生物/非生物侵蚀作用，MPs 释放出有害的添加剂（如双酚 A、多溴联苯醚等）7；另一方面，MPs从环境中吸附各类污染物（如芳香化收稿日期：2022-09-27基金项目：国家自然科学基金面上项目（52070135）*联系人，引用本文：陈瑶,夏子渊,苟敏,等.微塑料富集环境抗生素抗性基因的研究进展J.塑料科技,2023,51(2):93-98.Citation：Chen Y,Xia Z Y,Gou M,et al.Research progress on enrichment of antibiotic resistance genes in environment by microplasticsJ.Plastics Science and Technology,2023,51(2):93-98.94综述NO.02 2023塑料科技 Plastics Science and Technology合物、重金属、抗生素等），成为污染物的传播载体8-9。抗生素抗性基因(ARGs)是一种新兴环境污染物，其丰度不仅与抗生素和重金属等含量直接相关，而且利用可移动基因元件(MGEs)进行水平基因转移(HGT)，在环境微生物群落间扩散与传播10。研究表明：通过MPs、污染物、环境微生物之间的相互作用，MPs表面可能富集到独特的微生物群落，尤其是致病菌、抗生素抗性菌等，从而加剧ARGs传播的生态风险11。已有研究表明：MPs促进ARGs在其表面生物膜中及其周围环境中的富集与传播12-15。但由于研究方法的不同，报道中MPs对ARGs的富集结果存在较大差异，规律不明显。本研究分别从研究方法、富集效果、富集机制等方面总结MPs对环境中ARGs的富集研究情况，为MPs存在条件下ARGs的风险评估及传播控制提供支撑。1环境中ARGs富集作用的研究方法收集环境样本是研究环境中ARGs富集作用的关键。环境样本（包括MPs）主要获取方式：（1）野外调查。直接收集不同区域的环境样品（河流、海洋、湖泊、污水排放口等），对MPs、ARGs以及微生物群落进行分析，以获取环境背景值。（2）实验室模拟研究。在实验室条件下，通过控制特定的变量（如MPs的种类、尺寸、数量等），模拟MPs对ARGs的富集作用。（3）原位模拟研究。通过特殊装置（如金属笼16-18、粗麻袋19等），将MPs放置于原位环境（如红树林土壤20、河流21、北极冰湖17等），定期收集样品分析MPs的富集作用。ARGs的主要检测方法包括：（1）微生物培养与聚合酶链式反应(PCR)技术相结合的定性检测。（2）实时荧光定量PCR(qPCR)。（3）高通量实时荧光定量PCR(HT-qPCR)。（4）宏基因组测序。对于ARGs丰度定量方面，多数研究基于16S rRNA基因拷贝数进行相对定量；少数研究根据MPs与环境样品的单位质量或体积进行绝对定量22。2MPs对环境中ARGs的富集效果各研究对ARGs分布的关注角度不同：（1）考察MPs生物膜上及其周围环境中的ARGs。（2）考察MPs对周围环境中ARGs的影响。（3）考察MPs生物膜上的ARGs23-24。本文主要从环境类型、MPs暴露特征（类型、尺寸、与抗生素联合作用、暴露时间）、细胞外ARGs(eARGs)富集等方面，探讨MPs对生物膜与环境中ARGs的富集效果。2.1不同环境类型中MPs对ARGs的富集效果MPs生物膜从水体环境富集ARGs的现象较容易观察，并且MPs对周围环境中ARGs总丰度的提升也较为常见。在自然水体（河水、海水、湖水等）与污染水体（污水、垃圾渗滤液、养殖水体等）中，MPs生物膜在多数情况下可富集到ARGs；但是在自然水体中，MPs生物膜对ARGs的富集现象更显著。例如，从海水中收集的MPs生物膜上检测出64种ARGs，而海水样本中仅检测出6种。同时MPs生物膜上 ARGs 总丰度(5.1510-3 copies/16S rRNA gene copies)高 于 周 围 水 体(9.0610-4 copies/16S rRNA gene copies)25。虽然海水养殖水体的MPs表面可以从水体中富集到大量的ARGs与MGEs，但富集的ARGs种类及总丰度均低于周围水体26。MPs普遍使污染水体、土壤-污泥-沉积物和动物肠道三种环境中ARGs丰度得到提升，并且在相似环境中，环境因子的差异影响MPs对环境中ARGs的富集效果。例如，与海水相比，PE MPs使河水中部分ARGs明显富集20。PE MPs可以显著提升55 废水厌氧反应器中ARGs的丰度，但不影响65 反应器中ARGs放热丰度27。PVC对乙醇合成废水与甲醇合成废水中ARGs的丰度变化也起相反作用28。此外，水分也影响MPs对土壤中ARGs丰度的提升效果29。2.2不同类型的MPs对ARGs的富集效果不同类型的MPs所形成的生物膜对ARGs的富集能力，以及其对周围环境中ARGs丰度的提升效果差异较大。另外，与其他人工或自然材料颗粒的比较中，MPs对ARGs的富集效果并非绝对。研究表明：在三种使用频次最高的 MPs（聚乙烯（PE）、聚氯乙烯（PVC）、聚苯乙烯（PS）中，PE MPs生物膜更容易从周围环境中富集ARGs，但PE自身对环境中ARGs总丰度的提升效果较弱。例如，在垃圾渗滤液30、污水31、河水18以及红树林土壤19等多种环境中，PE MPs暴露30 d左右所形成的生物膜上富集的ARGs丰度远高于PS或PVC MPs。但是PE MPs对活性污泥中ARGs的提升效果却低于PVC与PS MPs32-33。可生物降解MPs与非可生物降解MPs的比较研究中，虽然可生物降解MPs（如聚羟基脂肪酸酯（PHA）、聚-羟基丁酸（PHB）、聚己内酯（PCL）、聚乳酸（PLA）等）17，34-35对ARGs丰度或种类没有明显富集作用，但这些塑料的种类显著影响ARGs组成。PCoA分析结果显示：PHA与聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)相比，MPs表面及海水中ARGs的组成均有显著差异35。在硬质材料的研究中，硬质人工材料（玻璃珠、陶瓷珠）对ARGs也具有富集作用，并且与硬质MPs（如PET）的富集效果类似36-37。但与硬质自然材料（石英砂）相比，PS与PE MPs的ARGs富集能力明显更强，可能是因为 MPs 表面比沙子表面更容易形成生物膜17,23,38。可生物降解的树叶碎片可以富集到比PE MPs更高的ARGs丰度与种类数39，但木材颗粒与MPs的富集效果差别不大21。2.3不同尺寸的微塑料对ARGs的富集效果目前，不同尺寸MPs形成的生物膜对ARGs的富集作用没有显著变化趋势，各项研究结果存在相互矛盾的现象。在毫米级MPs的研究中，与1 mm PE MPs相比，更大尺寸（3 mm 和 4 mm）MPs 表面富集的 ARGs 丰度高98.8%154.4%，ARGs种类多1.7%13.6%24。对于微米级塑料，Parrish等36研究表明：100200 m与300400 m粒径的PE MPs对河水、污水中ARGs丰度富集没有显著差95综述NO.02 2023塑料科技 Plastics Science and Technology别。但吴文斌等40认为在100400 m范围内，PE MPs尺寸越小，从污水中所富集到ARGs的丰度越高。对跨尺寸级的同种 MPs 进行比较，大尺寸塑料(5 mm)与毫米级MPs(抗生素单独作用MPs单独作用不投加抗生素与MPs。例如，在PA MPs与四环素(TC)联合作用对蚯蚓肠道ARGs影响研究中，PA、TC单独作用以及两者联合作用均使蚯蚓肠道ARGs与MGEs种类数显著提升，并且PA同TC联合作用提升效果大于PA、TC单独作用44。在小鼠肠道中PET与磺胺甲恶唑(SMX)的联合作用也具有类似效果43。在某些条件下，MPs或抗生素的单独作用比两者联合作用对环境中ARGs的富集效果更强。纳米级PS颗粒短期暴露(7 d)对蚯蚓肠道ARGs丰度的提升(0.35 copies/cell)高于PS与TC联合作用(0.15 copies/cell)，差别在暴露时间延长后(14 d)逐渐减小45。水稻田土壤的模拟研究中，PS MPs被发现可以缓解SMX对sul1、intI1的富集作用46。2.5不同暴露时间下MPs对ARGs的富集效果MPs生物膜的形成需要一定时间，长时间暴露更利于MPs生物膜对ARGs的富集，但是MPs暴露时间对周围环境中ARGs总丰度的提升效果不一致。例如，MPs在垃圾渗滤液、污水中暴露时间低于30 d时，没有观察到富集现象；但随着暴露时间进一步延长，MPs生物膜上ARGs总丰度逐渐接近或者超过周围环境30,47-48。虽然短期暴露对MPs 生物膜上 ARGs 总丰度影响不大，但部分 ARGs（如tetA、sul1）在更短时间（数天甚至 12 h）明显富集16-17,40。另外，即使是短期暴露，MPs 也可以促进其周围环境中ARGs总丰度的富集。但很少有研究比较不同暴露时间下MPs对周围环境中ARGs的富集效果。Wang等33在活性污泥中，PS、PE MPs分别暴露14 d与28 d，对比其对污泥中ARGs丰度的影响。结果表明：PS MPs暴露时间越长对污泥ARGs丰度提升越显著，但PE MPs在两个暴露时间下，对污泥中ARGs丰度无显著影响。2.6MPs对eARGs的富集效果环境ARGs的存在两种形式：细胞内ARGs(iARGs)与细胞外ARGs(eARGs)30,40,49，其中eARGs主要来自细胞裂解后释放的iARGs，可通过收集微生物细胞及0.22 m膜过滤液40获得。但大部分研究仅关注MPs对iARGs的影响。研究表明：当MPs暴露于环境后，环境中eARGs与iARGs的分布发生变化。Wang等49研究表明：MPs的暴露使好氧颗粒污泥中细胞内、外的tetW丰度提升，但是对细胞内外的tetE丰度影响差异很大。MPs选择性富集或吸附一些eARGs，并且对其富集或吸附能力可能更强40,49-51。MPs 生物膜中胞外 tetW 与 tetE 丰度也高于好氧颗粒污泥49。Cheng等50将多种MPs暴露于废水中，相较iARGs，MPs对eARGs具有更高的吸附倍数与吸附效率，并且此种吸附能力不容易受到多种理化条件变化的影响（如腐殖质、盐分等）。3MPs对环境中ARGs的富集机制环境ARGs主要通过垂直基因转移(VGT)与水平基因转移(HGT)两种途径进行传播52。eARGs 主要是具有iARGs的细胞裂解后产生的具有ARGs的遗传物质游离片段，通过HGT方式被其他细胞摄取并整合到基因组10，重新转化为iARGs。iARGs存在于活细胞中，由亲代细胞通过VGT将其传递给子代细胞53，也可以通过HGT方式将其传递给其他细胞10。MPs主要以三种不同方式参与促进HGT与VGT过程，最终实现 ARGs 的富集：（1）MPs 通过直接吸附实现ARGs的初步富集。MPs可以直接吸附游离在环境中的携带iARGs的抗生素抗性菌(ARB)及eARGs。游离微生物借助多种方式（例如，鞭毛运动、分泌多聚物、静电相互作用等）吸附并定殖在MPs表面40,54-55。eARGs同其他污染物一样主要通过物理和化学方式（如疏水相互作用、静电相互作用、氢键相互作用、-相互作用以及范德华力）56吸附于MPs表面。不带电荷的强疏水性MPs（如抗菌PP）颗粒很难与带高电荷的DNA分子发生吸附，但是高离子强度条件却可以通过静电相互作用影响两者吸附57。如丰富的金属离子（如钠离子、钙离子和镁离子等）一般促进吸附58，而无机阴离子（如磷酸根离子和柠檬酸根离子）起强烈抑制效果59。环境pH值可以改变MPs颗粒（如改性PS、POM）60的带电性质，从而影响eARGs的吸附效果59。含苯环的MPs（如PS、PET）可以通过芳香环的-相互作用促进对eARGs等污染物的吸附56,58。另外，eARGs作为环境ARGs的重要储存库，可以参与HGT过程，从而促进ARGs的传播与富集10。（2）MPs作为生物膜载体通过促进HGT实现ARGs的富集。生物膜上较高生物量的微生物之间进行高密度和强烈的相互作用，使其成为基因交换的热点区域，有效促进了质粒共轭形式的HGT14,61-62。生物膜群体感应(QS)在生物膜的形成与基因转移过程中起到重要调节作用，MPs可以通过影响生物膜形成过程中QS信号分子影响ARGs的HGT63。（3）MPs借用所吸附与浸出的污染物通过促进VGT与HGT的形式实现ARGs的富集。原本是或新突变产生的ARB能够克服该选择性压力在MPs表面及其周围环境96综述NO.02 2023塑料科技 Plastics Science and Technology中富集，以 HGT 形式实现对 ARGs 的富集9,12,64。例如，PET、PVC 等 MPs 在海水、河水水体中会选择性富集Pseudomonas菌属，该菌属中携带多重耐药ARGs的细胞数目超过50%21,35,39。致死浓度的重金属通过抗性共选择筛选出同时具有 ARGs 与金属抗性基因(MRGs)的抗性菌12,62。亚致死浓度的抗生素、重金属、其他污染物（特别是塑料添加剂、纳米颗粒）会诱导细胞内活性氧(ROS)累积，从而促进HGT65-66。例如，PS老化过程中释放的化学物质（如十二烷基硫酸钠（SDS）67）会诱导ROS在细胞内累积，影响细胞膜通透性，同时与基因摄取相关基因的表达活性也会上调，从而增加了受体细胞进行HGT的敏感性50,68。ROS累积造成的氧化应激也可能提高ARGs与MRGs共选择的频率69。MPs在吸附作用的基础上，从不同途径促进 HGT 与 VGT 是实现环境 ARGs 富集的主要机制。4结论（1）相关环境样本的主要获取方式为野外调查、实验室模拟研究与原位模拟研究，环境样本ARGs主要检测方法为qPCR、HT-qPCR与宏基因组技术。（2）MPs影响环境中iARGs与eARGs的组成分布，在各个环境中均存在ARGs富集现象，并且环境条件的差异会显著影响ARGs的富集效果。（3）MPs的材料类型、与抗生素的联合作用以及暴露时间对ARGs的富集影响显著，但MPs的尺寸对ARGs的富集效果的影响趋势不明显。（4）MPs 从不同途径促进 HGT 与 VGT 是实现环境ARGs富集的主要机制。目前，MPs富集环境ARGs的相关研究主要集中在富集效果的揭示方面，对富集机制的研究较为缺乏，环境类型研究范围不够均衡，主要集中在水体环境，应加强土壤、污泥/沉积物、大气、动物肠道，特别是哺乳动物肠道环境中的研究，以探索MPs对环境ARGs的富集规律与生态效应。参考文献1 Thompson R C,Olsen Y,Mitchell R P,et al.Lost at Sea:Where is all the plastic?J.Science,2004,DOI:10.1126/science.109455.2 Frias J,Nash R.Microplastics:Finding a consensus on the definitionJ.Marine Pollution Bulletin,2019,138:145-147.3 高文杰,卫新来,吴克.环境中微塑料的研究进展J.塑料科技,2021,49(2):111-116.4 Cole M,Lindeque P,Halsband C,et al.Microplastics as 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