大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化.pptx

大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞的制备与转化的制备与转化 一一.实验目的实验目的 通过本实验，学习大肠杆菌感受态细通过本实验，学习大肠杆菌感受态细胞制备和转化的原理与技术方法。胞制备和转化的原理与技术方法。二二.实验原理实验原理感受态细胞感受态细胞感受态细胞感受态细胞(Competent cells):(Competent cells):受受受受体体体体细细细细胞胞胞胞经经经经过过过过一一一一些些些些特特特特殊殊殊殊方方方方法法法法处处处处理理理理后后后后，细细细细胞胞胞胞膜膜膜膜的的的的通通通通透透透透性性性性发发发发生生生生变变变变化化化化，成成成成为为为为能能能能使使使使许许许许多多多多有有有有外外外外源源源源DNADNA的的的的载载载载体体体体分分分分子子子子通通通通过过过过的的的的感感感感受受受受态态态态细细细细胞胞胞胞(competent(competent cell)cell)。转化（转化（转化（转化（transformationtransformation）：是是是是将将将将异异异异源源源源DNADNA分分分分子子子子引引引引入入入入受受受受体体体体细细细细胞胞胞胞，使使使使其其其其获获获获得得得得新的遗传性状的一种技术方法。新的遗传性状的一种技术方法。新的遗传性状的一种技术方法。新的遗传性状的一种技术方法。进入细胞的进入细胞的进入细胞的进入细胞的DNADNA分子通过复制表达，才能实分子通过复制表达，才能实分子通过复制表达，才能实分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。性状。性状。性状。大肠杆菌转化的方法：大肠杆菌转化的方法：大肠杆菌转化的方法：大肠杆菌转化的方法：1.化学法：使用化学试剂（如化学法：使用化学试剂（如化学法：使用化学试剂（如化学法：使用化学试剂（如CaClCaCl2 2）制备）制备）制备）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体的感受态细胞，通过热击处理将载体的感受态细胞，通过热击处理将载体的感受态细胞，通过热击处理将载体DNADNA分子导入受体细胞；分子导入受体细胞；分子导入受体细胞；分子导入受体细胞；2.电转化法：通过高压脉冲的作用将载体电转化法：通过高压脉冲的作用将载体电转化法：通过高压脉冲的作用将载体电转化法：通过高压脉冲的作用将载体DNADNA分子导入受体细胞。分子导入受体细胞。分子导入受体细胞。分子导入受体细胞。转化子的筛选：转化子的筛选：利用导入的利用导入的利用导入的利用导入的DNADNA上的选择性标记，区分转化子上的选择性标记，区分转化子上的选择性标记，区分转化子上的选择性标记，区分转化子与非转化子。与非转化子。与非转化子。与非转化子。选择性标记主要有两类：选择性标记主要有两类：选择性标记主要有两类：选择性标记主要有两类：营养筛选标记营养筛选标记营养筛选标记营养筛选标记抗性筛选标记抗性筛选标记抗性筛选标记抗性筛选标记三实验方法三实验方法 1 1挑挑挑挑取取取取大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌DH5DH5单单单单菌菌菌菌落落落落，接接接接于于于于5mL 5mL LBLB液液液液体培养基中体培养基中体培养基中体培养基中3737振荡培养过夜振荡培养过夜振荡培养过夜振荡培养过夜2 2以以以以1:501:50比比比比例例例例将将将将1ml1ml菌菌菌菌液液液液转转转转移移移移到到到到新新新新鲜鲜鲜鲜LBLB液液液液体体体体培培培培养养养养基基基基中中中中，3737振振振振荡荡荡荡培培培培养养养养1.51.52 2 hrhr左左左左右右右右，使使使使A A600600在在在在0.40.40.50.5左右左右左右左右3 3将将将将培培培培养养养养液液液液4ml4ml转转转转移移移移到到到到5ml5ml离离离离心心心心管管管管中中中中，44，2000g2000g离心离心离心离心3min3min4 4弃弃弃弃上上上上清清清清，加加加加0.5mL0.5mL用用用用冰冰冰冰预预预预冷冷冷冷的的的的0.1 0.1 M M CaClCaCl2 2溶溶溶溶液液液液，轻轻吹打或摇动混匀细胞轻轻吹打或摇动混匀细胞轻轻吹打或摇动混匀细胞轻轻吹打或摇动混匀细胞注注注注意意意意：加加加加入入入入CaClCaCl2 2动动动动作作作作需需需需轻轻轻轻柔柔柔柔，勿勿勿勿剧剧剧剧烈烈烈烈震震震震荡荡荡荡，并并并并且且且且尽量使细胞处于低温中尽量使细胞处于低温中尽量使细胞处于低温中尽量使细胞处于低温中5 5 5 5冰上放置冰上放置冰上放置冰上放置20min20min20min20min，2000g2000g2000g2000g离心离心离心离心2min2min2min2min 6 6弃弃弃弃上上上上清清清清，加加加加0.1ml0.1ml预预预预冷冷冷冷的的的的 0.1 0.1 M M CaClCaCl2 2溶溶溶溶液液液液，轻轻轻轻轻吹打或摇动混匀细胞，即得感受态细胞轻吹打或摇动混匀细胞，即得感受态细胞轻吹打或摇动混匀细胞，即得感受态细胞轻吹打或摇动混匀细胞，即得感受态细胞注注注注意意意意：离离离离心心心心后后后后观观观观察察察察沉沉沉沉淀淀淀淀，如如如如果果果果出出出出现现现现中中中中间间间间空空空空心心心心的的的的沉沉沉沉淀说明操作正常淀说明操作正常淀说明操作正常淀说明操作正常7 7将将将将取取取取0.1ml0.1ml感感感感受受受受态态态态细细细细胞胞胞胞转转转转移移移移到到到到1.5ml1.5ml离离离离心心心心管管管管中中中中，加加加加2l 2l 质粒，混匀，冰上放置质粒，混匀，冰上放置质粒，混匀，冰上放置质粒，混匀，冰上放置30min30min8 84242水浴水浴水浴水浴9090秒秒秒秒,在冰上放置在冰上放置在冰上放置在冰上放置2min2min9 9加加加加入入入入 0.5 0.5 mlml新新新新鲜鲜鲜鲜LBLB培培培培养养养养基基基基，3737，200rpm200rpm振振振振荡荡荡荡约约约约30min30min45min45min（注注注注：转转转转纯纯纯纯质质质质粒粒粒粒可可可可省省省省略略略略，转转转转连连连连接产物需进行）接产物需进行）接产物需进行）接产物需进行）10.10.取取取取 100l 100l 涂涂涂涂布布布布到到到到含含含含有有有有氨氨氨氨苄苄苄苄青青青青霉霉霉霉素素素素的的的的平平平平板板板板上上上上,加加加加X-X-gal/IPTGgal/IPTG各各各各3 3 3 3LL 1111倒置平皿，倒置平皿，倒置平皿，倒置平皿，3737培养培养培养培养1216h1216h每个平板大约每个平板大约20ml的培养基的培养基平板培养基平板培养基用用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒超螺旋质粒 DNA产生产生5 106-2 107个转化菌个转化菌落。在实际工作中，每微克有落。在实际工作中，每微克有105以上的转化以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。菌落足以满足一般的克隆实验。