HPLC同时检测血清和尿样中肌酐_假尿苷_尿酸_彭长华.pdf

HPLC同时检测血清和尿样中肌酐、假尿苷、尿酸彭长华王昌富李承彬高清平王植雄张国明(湖北省荆州市中心医院检验科荆州 434100)提要用反相高效液相色谱法同时测定了 39例糖尿病患者的血清和尿样中的假尿嘧啶核苷、肌酐和尿酸,并与 24h尿白蛋白排泄量进行了比较分析。发现血清假尿嘧啶核苷是糖尿病肾病早期诊断的一种新颖而敏感的指标,有助于连续监测肾脏的功能状态以了解病程的转归。关键词高效液相色谱法,假尿嘧啶核苷,肌酐,尿酸,糖尿病肾病分类号 O658/Q51 前言肌酐(creatinine,Cr)因不被肾小管重吸收而成为使用最广泛的监测肾功能的指标;尿酸(uric acid,UA)大部分从肾脏排泄,也能反映肾脏功能;假尿嘧啶核苷(pseudouridine,Pu)是 tRN A分解代谢的最终产物之一,无补救途径使其重新利用,只能原封不动地从尿中排出体外,且正常人Pu排泄较为恒定1,也很少受饮食干扰2,3,故也能用于对肾脏功能的评价。三者的同时测定对很清晰地检测到肾功能的任何变化有重要意义。用高效液相色谱法对三者中的两者同时测定已见报道4,5,但同时测定上述三种化合物的方法尚未见报道。我们通过对色谱条件的优化,建立了反相 HPLC同时测定血清和尿样中的 Pu,Cr和 U A的方法,并已应用于对糖尿病肾病(DN)早期诊断价值的探讨。2 实验部分2.1 仪器和试剂C-R4A数据处理机、SPD-6AV 检测器、LC-9A送液泵、DGU-4A脱气机、CTO-6A柱箱、SCL-6B控制器、SIL-6B自动进样器和 UV-2201分光光度计均为日本岛津制作所产品。Pu,Cr及 U A标准对照品(美国 Sigma公司),其它为国产分析纯试剂。2.2 标准对照品及样品的制备与前处理(1)标准对照品制备:将Cr,Pu用重蒸水溶解,UA 用 11.6mmol/L 的 Na2CO3在 70 水浴 中溶解。使 用 前 配 成 浓 度 分 别 为 274.6,22.93 和612.7mol/L的混合标准液S1,将S1倍比稀释 5次至 S6。(2)样本收集:收集受试者 24h尿液,用甲苯防腐,准确记录尿量,混匀后取约 5mL;同时取静脉血3mL,及时分离血清,与尿液一起置于-20 下,于一周内分析。(3)准确吸取系列混合标准液、血清及 40倍稀释的尿液 0.1mL,滴加 1.9mL甲醇,在漩涡振荡器上混匀,于 6 000r/min离心 10min。取上清液 1.2mL置于干净试管中,在氮气流下吹干,分析前以流动相0.3mL复溶,漩混 1min,自动进样 40 L进行色谱分析。图 1 标准对照品(a)、样品(b)和加标准对照品的样品(c)的色谱图Fig.1 Chromatograms for the separation of thestandard(a),specimens(b)and a+b(c)1.Cr(3.6min),2.Pu(6.2min),3.U A(8.3min).2.3色谱条件分析柱:Shim-pack CLC-ODS15cm 0.6cm;预柱Shim-pack CLC G-ODS(4);流动相 0.02mol/L KH2PO4,用磷酸调 pH 3.2;流速 1mL/min;柱温35;AUFS 0.001;波长开始设为 233nm,分析至第 16卷第 2期色谱Vol.16 No.21998年 3月CHINESE JOURN AL O F CHROM ATOGRAPHYMarch 1998 作者还有本院内科的张金平、李欣、彭家清本文收稿日期:1996-11-10,修回日期:1997-04-165.2min时自动变换为 263nm,至 10min时分析结束,重新设为 233nm,12min时开始下一试样分析。3 结果按上述条件对标准对照品、样品和加标准对照品的样品进行了分析,色谱图见图 1。临床应用:(1)把在我院住院及专科门诊的 39例糖尿病(MD)患者以尿白蛋白排泄量(U AE)分为三组6:组,正常白蛋白尿组,22例,尿白蛋白排泄量小于30mg/24h;组,微量白蛋白尿组,8例,尿白蛋白排泄量为 30 300mg/24h;组,大量白蛋白尿组,9例,尿白蛋白排泄量大于 300mg/24h。样品检测结果见表 1。表 1 血清和 24h尿中各检测指标的结果(X-S)Table 1 Anatylical resulls of serum and urine(X-S)组别Groupsn血清 Serum(mol/L)PuCrU A尿 Urine(mmol/24h)PuCrUA对照组532.0072.7218.70.30013.242.66Control 0.31 10.4 49.9 0.066 2.68 1.01正常白蛋白尿组222.8589.0235.60.2909.282.98No rmal albuminuria 1.37 24.0 85.7 0.09 3.28 0.82微量白蛋白尿组84.37119.8195.20.2407.591.76Microabluminuria 1.92 43.3 51.9 0.08 3.07 0.83大量白蛋白尿组95.19129.6268.30.3508.664.25Macroalbuminuria 2.86 68.4 118.9 0.133.53 3.30肾病综合征组1511.63269.64.330.2408.142.19Nephrotic syndrome 12.89 292.9 20.7.3 0.09 3.60 1.14与对照组比,p 0.01;与正常白蛋白尿组比,p 0.01。compared with the control,p 0.01;compared with normal albuminuria,p 0.01.(2)各检测指标之间的相关分析血清 Pu与尿蛋白排泄量在各组都无直线相关关系(p 0.05),两指标经对数转换后仅在正常白蛋白尿组有直线相关关系(r=0.564,p 0.05),而在其它各组中均呈显著的直线相关关系(r=0.960,0.938,0.959,p 0.01);尿 Pu与尿 Cr在糖尿病各组都呈显著的直线相关关系(r=0.833,0.815,0.834,p值均小于 0.01)。(3)糖尿病并视网膜病变(DR)39例糖尿病患者中有 20例作了眼底检查,三组分别有 5/12,4/4,3/4的患者发生视网膜病变。用两样本比较的秩和检验显示视网膜病变发生者的病程、尿白蛋白排泄量显著性地高于无视网膜病变者(p 0.05),血清 Pu非常显著地增高(p 0.01);而血清Cr及其它指标无显著性差异(p0.999 9,p 0.01)。(2)我们用本法测定了 39例糖尿病患者的血清和 24h尿样,结果表明在目前公认的有肾脏损伤的微量白蛋白尿组、大量白蛋白尿组和肾病综合症组的血清Pu均显著高于正常值(p 0.999,p 0.01).TheCVfor within day and between day measure-ments were 2.5%and 5.0%respectively.In addition,Pu,Cr and U A were simultaneously determinedin serum and urine of 39 patients with diabetic mellitus(DM).15 patients with nephrotic syndrome(NS)and53 normal subjects by the method.Results include:the levels of serum Pu in all DM patients(100%)withmicroalbuminuria(MiAU)and macroalbuminuria(MaAU)were greater than maximum of normal subjects(X-+2S).In addition,in9DM patients(41%)with normal albuminuria(N AU)the levels were also greaterthan the maximum.In patients with DM,there was no correlation between the serum Pu and the urinaryalbumin excretion(UAE),whereas the serum Pu correlated closely with the serum Cr.However,the inci-dence for serum Pu increase was significantly greater in patients.The levels of serum Pu in patients withNS were greater than those in control subjects and patients with DM.Conclusion is that the determination ofserum Pu could be used as sensitivity index for the early diagnosis of DN.Key wordshigh performance liquid chromatography,pseudouridine,creatinine,uric acid,diabeticnephropathy148色谱16卷