质粒构建中DNA片段与载体连接的经验.doc

在排除了其他问题后，我做了摩尔比的调整，需要做OD260的测量。不要怕浪费回收的载体和片段因为实际用量非常少，看了下面我们的实验实例就知道了。

摩尔比是指载体和插入片段，在连接时的摩尔比。
1 比例应该在1:2-6之间（载体：片段；片段要多）。
2 连接体系如果是20微升，载体和片段的总质量（微克）要在0.02微克~0.2微克之间。如果是10微升，则在0.01~0.1微克之间。我一般都用到接近上限。
3 EDTA不能太多。否则可能影响连接酶。

附加：
如何计算摩尔数和微克数（用20微升的链接体系，NEB的T4 DNA ligase）

公式：pmol数*kb数（双链）*0.65=微克数

实例：片段大小=555bp=0.555kb，浓度=0.19微克/微升
载体大小=4.969kb， 浓度=0.115微克/微升
选取：载体0.04pmol；片段0.12pmol（载体：片段=1:3）

代入公式：pmol数*kb数（双链）*0.65=微克数；
载体用0.129微克（1.12微升）；片段用0.043微克（0.23微升）：：：注意20微升体系

得出：载体和片段的总质量=0.043+0.129=0.172微克（在20微升体系所要求的0.02~0.2微克之间）

连接体系：体积按需调整，我们喜欢用20ul的体系。你如果要用10ul的，把上述用量减半。
20ul体系：
3d水 15.65 ul，
片段 0.23 ul，
载体 1.12 ul，
将上面三个液体混匀，45摄氏度水浴5min，迅速插入冰中，2min

保持在冰浴中，加入
10×buffer 2 ul
T4 DNA ligase 1 ul
混匀，4℃连接过夜

另外一种推算结果
设x1为DNA片段pmol数，x2为其ug数；设y1为载体pmol数，y2为载体ug数，a为DNA片段的kb数，b为载体的kb数，并且假定摩尔比为DNA片段：载体=3:1，则有
y2=0.2/(3a/b+1)
x2=0.2-y2
x1·a·0.65=x2
y1·b·0.65=y2
x1：y1=3
x2+y2=0.2（总质量）

最后提示：
不要怕测OD260浪费了回收的载体和片段，因为实际上用的很少（见上述）。不要嫌测OD值麻烦，因为非常必要，尤其是连接效率不高的质粒和片段。

根据酶切电泳条带估计用量通常都不能得到最大的连接效率，对初学者来说，估计通常不准。我有一次，按照估计的，两个板子才有一个克隆；按照摩尔比1:3连接得到了大约150个克隆；按照摩尔比1:10只得到了平均15个克隆/板。这说明：片段过多，过犹不及。